Construcción libre de plásmidos de Escherichia coli para la producción de xilitol libre de arabitol de

la mazorca de maíz hidrolizado hemicelulósico

Los altos costos y la baja eficiencia de producción son una seria limitación para la producción de
xilitol de origen biológico. Para la producción a escala industrial de xilitol, una Escherichia coli libre
de plásmidos para la producción de xilitol a partir del hidrolizado hemicelulósico de la mazorca de
maíz.

En lugar de ser plásmido e inductor dependiente, esta cepa se basó en la integración de múltiples
copias de los genes de la xilosa reductasa (XR) en el cromosoma, donde su expresión estaba
controlada por el promotor constitutivo P43.

Además de minimizar el flujo de L-arabinosa a arabitol, dos estrategias que incluyen una actividad
total de XR baja y alta selectividad de XR ha sido adoptada.

El arabitol se redujo significativamente usando una cepa libre de plásmidos que tuvo una actividad
total XR más baja y ocho mutaciones puntuales de XR con una actividad enzimática 27 veces
menor hacia la L-arabinosa fue lograda.

La cepa libre de plásmidos junto con XR mutado puede eliminar completamente la formación de
arabitol en la producción de xilitol. En la fermentación discontinua, esta cepa sin plásmido produjo
143.8 g de L − 1 xilitol a 1.84 g/L *h a partir de hidrolizado hemicelulósico de mazorca.

A partir de estos resultados, concluimos que esta ruta por E. coli libre de plásmidos tiene potencial
para convertirse en un proceso comercialmente viable para la producción de xilitol.

Sin embargo, el sistema de expresión basado en plásmidos utilizado en el trabajo mencionado

anteriormente está limitado por la función metabólica.

carga sobre la cepa huésped y el gen de resistencia a los antibióticos utilizado en el plásmido. Una
desventaja general del uso de la selección de antibióticos es la necesidad de eliminar
completamente el antibiótico residual del producto final antes de su aplicación.

Además, el costo asociado con el uso de antibióticos y la diseminación de la resistencia a los

antibióticos son preocupaciones importantes en proyectos a escala industrial que involucran
cultivos bacterianos. En particular, la ingeniería metabólica.

Los enfoques asociados con los plásmidos tienen varios inconvenientes, incluida la inestabilidad
segregacional e inestabilidad estructural.

En contraste, la integración de genes relevantes directamente en el cromosoma del huésped tiene

muchas ventajas en términos de estabilidad y carga metabólica. A pesar de que E. coli
recombinante se ha utilizado para producir xilitol, los genes XR se expresaron generalmente en
función de En sistema plasmídico con promotor inducible. Por lo tanto, una integración
cromosómica multi-copia de los genes XR controlada por el promotor constitutivo en E. coli sería
útil para la producción de xilitol.

En la industria, el xilitol se produce por la reducción de D-xilosa derivada de hidrolizado

hemicelulósico en presencia de catalizadores de níquel Raney. Este proceso requiere la separación
de la D-xilosa de la L-arabinosa, para eso la L-arabinosa también se puede reducir a L-arabitol, un
subproducto no deseado. Porque la D-xilosa y la L-arabinosa son Epímeros, su separación es muy
difícil y es uno de los principales obstáculos para la producción económica de xilitol.

Afortunadamente, una XR que tiene una preferencia innata de 2.4 veces por la D-xilosa sobre L-
arabinosa se ha aislado de Neurospora crassa y un mutante XR (VMCQI) que tenía 50 veces menos

la eficacia catalítica hacia la L-arabinosa se encontró a través de varias rondas de evolución

dirigida11. Afortunadamente, una XR que tiene una preferencia innata de 2.4 veces por la D-xilosa
sobre L-arabinosa se ha aislado de Neurospora crassa y un mutante XR (VMCQI) que tenía 50 veces
menos la eficacia catalítica hacia la L-arabinosa se encontró a través de varias rondas de evolución
dirigida.

Además, una E. coli diseñada por ingeniería genética (mutante CRP) junto con la mutación XR
(VMCQI) pudo eliminar la producción de L-arabitol de una mezcla de D-xilosa, L-arabinosa y glucosa.
Sin embargo, se utilizó XS(VMCQI) basado en plásmidos en E. coli, casi todos la L-arabinosa en el
hidrolizado hemicelulósico de la mazorca de maíz se ha reducido a L-arabitol .

Para diseñar E. coli para una producción más económica de xilitol libre de arabitol a partir de
hidrolizado hemicelulósico de la mazorca de maíz , el objetivo de este estudio es realizar una
integración cromosómica de copias múltiples de los genes XR de N. crassa controlados por un
promotor constitutivo para lograr una producción estable de xilitol.

Un plásmido que contenía una secuencia IS5 (una familia de secuencias de inserción y los genes N.
crassa XR dirigidos por un promotor P43 se construyeron para la integración cromosómica en
múltiples ubicaciones.

Por otra parte, una XR mutante con una actividad enzimática mucho menor hacia la L-arabinosa se
logró y una E. coli libre de plásmidos en conjunto con este mutante se construyó. La sinergia se
manifestó como selectividad incrementada tal que la formación de L-arabitol se eliminó
completamente en la producción de xilitol a partir de hidrolizado hemicelulósico de mazorca.

https://www.nature.com/articles/srep26567.pdf
https://es.wikipedia.org/wiki/Alimento_hidrolizado

promotor: Se considera que los promotores son regiones reguladoras cis-acting que dirigen la
transcripción de otras regiones adyacentes o cercanas al ácido ribonucleico

mensajero (ARNm), el cual es traducido en proteínas. Funcionalmente, un promotor es una

secuencia de ADN localizada “upstream” o “aguas arriba” (hacia el extremo 5´ de la región
codificante de un gen) que incluye las regiones de enlazamiento para factores de transcripción

cpr: La proteína C reactiva (PCR) es un marcador establecido de inflamación con actividades

similares al receptor de reconocimiento de patrones.

El hidrolizado hemicelulósico de bagazo de caña de azúcar fue obtenido por hidrólisis ácida en
reactor de acero inoxidable de 250 L, a 120 ºC y 20 min, usando ácido sulfúrico 0,07 N, con
relación sólido:líquido 10:1. La eliminación de partículas sólidas se realizó por centrifugación.