UNIVERSITÉ MOHAMMED V – AGDAL

FACULTÉ DES SCIENCES

Rabat

THÈSE DE DOCTORAT
N° d‘ordre : 2475

Présentée par

Mme. Ouadghiri Mouna

Discipline : Biologie
Spécialités : Microbiologie et Biologie Moléculaire

Biodiversité des bactéries lactiques dans le lait cru et

ses dérivés « Lben » et « Jben » d’origine marocaine

Soutenue le 23 décembre 2009 devant le jury :

Président :

M. Mohamed Saghi : Professeur à l‘Université Mohammed V- Agdal, Rabat

Examinateurs :

M. El Bekkay Berraho : Professeur à la Faculté des Sciences de Rabat

M. My Mustapha Ennaji: Professeur à la Faculté des Sciences et Techniques de Mohammedia
M. Houssine Azeddoug : Professeur à la Faculté des Sciences Aîn Chock, Casablanca
M. M’hamed Tijane : Professeur à la Faculté des Sciences de Rabat
M. Mohamed Amar : Professeur au Centre National pour la Recherche Scientifique et
Technique, Rabat

1
 Dédicaces
Je dédie ce travail à
Mon pére Mr. Ouadghiri Mohamed
Tu es un pilier solide et incontournable pour ma personne et mon parcours, que
Dieu te donne santé et longue vie
Ma mére Mme. Latifa ElFilali
Que ce travail soit pour toi le témoignage de mon infinie reconnaissance pour ton
aide précieuse et toutes ces années de compréhension
A ma sœur Asmae et son mari Abderrahim Tarek et leur petit Mohammed
Ma sœur Ilhame et son mari Hicham Rahou

Mon chér frére Nabil

pour ta compréhension et ton aide précieuse dans les moments difficiles

Ma chère sœur Naoual et Mon chèr frére Mehdi

À mes chérs oncles : Mamoun, Mustapha, Ghali et Hassan ainsi que leur famille
Mon chér mari Mr. Youssef Khayati

Pour ton soutien et ta compréhension

A mon bébé Ismaîl né au cours de la préparation de cette thése et qui a illuminé

ma vie

A ma belle mére Fatima Khayati

Mes deux belles sœurs Badiaa et Malika

Mes beaux fréres Mohamed, Abdelkrim, Zouhair et Yassine

2
 AVANT PROPOS
Les travaux présentés dans cette thèse ont été effectués au Laboratoire de Biochimie et
Immunologie de la Faculté des Sciences de Rabat en collaboration avec le Laboratoire de
Microbiologie et Biologie Moléculaire (LMBM) relevant du Centre National pour la
Recherche Scientifique et Technique (CNRST) Rabat.

L‘encadrement scientifique de ce travail a été assuré par le Prof. M‘hamed Tijane,

Professeur de Biochimie et responsable du Laboratoire de Biochimie et Immunologie de la
Faculté des Sciences de Rabat (UFR : Biodiversité et Aquaculture, SV01/01) et le Prof.
Mohamed Amar, Professeur de Microbiologie et Biologie Moléculaire et responsable du
Laboratoire de Microbiologie et Biologie Moléculaire, CNRST, Rabat.

Tout d‘abord, je tiens à remercier infiniment le Professeur M‘hamed Tijane qui non
seulement a été mon professeur de Biochimie à la Faculté des Sciences de Rabat mais m‘a
aussi aidé à choisir une thématique porteuse qui est la biologie moléculaire et la
bioinformatique. Je tiens à lui exprimer ma reconnaissance et ma gratitude pour avoir choisi
pour moi le LMBM/CNRST, Rabat comme laboratoire d‘acceuil.

Je tiens vivement à exprimer ma profonde reconnaissance et gratitude au Professeur

Mohamed Amar pour m'avoir accueilli au laboratoire et m'avoir donné les moyens de mener à
bout cette étude, pour sa disponibilité, sa patience, sa compréhension et l‘intérêt porté pour
mon sujet de recherche.

Mes remerciements les plus chaleureux et respectueux au président du jury, le

Professeur Mohamed Saghi, Professeur de Microbiologie de l‘Université Mohammed V-
Agdal, Rabat.

Mes remerciements vont aussi au Prof. El Bekkay Berraho, Professeur à la Faculté des
Sciences de Rabat, d‘avoir accepté, malgré ses préoccupations et ses tâches d‘enseignement et
d‘encadrement, de lire et de juger ce travail. Qu‘il trouve ici mes sincères sentiments de
gratitude et de respect.

Je tiens à remercier également Prof. Moulay Mustapha Ennaji, Professeur à la Faculté

des Sciences et Techniques de Mohammedia, d‘avoir eu l‘amabilité d‘accepter volontairement
et aimablement de critiquer et de juger ce travail.

3
 Mes remerciements vont aussi au Prof. Houssine Azeddoug, Professeur à la Faculté
des Sciences, Aîn Chock, Casablanca, d‘avoir pris de son temps malgré les responsabilités qui
lui incombent pour juger et critiquer ce travail. Je suis particulièrement reconnaissante et
honorée par sa participation au jury de cette thèse.

Mes sentiments les plus profonds et remerciements infinis à mes collègues et amis du
Laboratoire de Microbiologie et Biologie Moléculaire du CNRST pour les relations amicales,
conviviales, fraternelles et professionnelles qu‘ils ont su tisser au sein du laboratoire. Je tiens
à exprimer ma profonde gratitude spécialement à Mme Najat Bouachik qui a lu et corrigé
cette thèse, Mlle Imane Berrada, Mr. Tarik Aaniz et Mr. Chajar Noureddine.
Mes très spéciaux remerciements reviennent à mes amies : Mme Naima Amaamaa,
Mme. Naima Lachhab, Mme. Amina ElBassami, Mme. ElKhedri Hanane, Mme. Fatima
Zahra Raziki, Mlle. Zaynab Fadli, Mlle. Siham Amanou, Mlle. Ettahiri Wafae, Mme. Nihal
Abitiu et Mme. Joumana ElTurk pour tous les moments partagés ensemble, pour leur soutien
et leurs mots encourageants et pour leur amitié sincère.
Un remerciement spécial et chaleureux à mon amie Mlle Amina Radgui, pour son
soutien sans faille, sa compréhension et ses encouragements.

4
 Production scientifique
Ce travail s‘inscrit dans le cadre de l‘étude de la biodiversité des bactéries lactiques dans
le lait cru d‘origine marocaine et ses dérivés traditionnels (« Jben » et « Lben »). Il a bénéficié
du soutien financier de la part :

- du programme de participation de l‘UNESCO (project: pp04-27222505),

- de l‘Administration Générale de la Coopération Belge (AGCB - projet: FRAB ⁄

2005),

- du Centre National pour la Recherche Scientifique et Technique, Rabat, Maroc

(project: PROTARS P2T3 ⁄ 28).

Les travaux effectués au cours de cette Thèse ont contribué aux publications et
communications orales et affichées suivantes:

Publications:

Ouadghiri, M., Vancanneyt, M., Amar, M. and Swings, J. (2005). Biodiversity of lactic acid
bacteria in Moroccan soft white cheese (jben). FEMS Microbiology Letters. 251: 267–271.

Ouadghiri, M., Vancanneyt, M., Vandamme, P., Naser, S., Gevers, G., Lefebvre, K., Swings,
J. and Amar, M. (2009). Identification of lactic acid bacteria in Moroccan raw milk and
traditionally fermented skimmed milk ‗lben‘. Journal of Applied Microbiology. 106 : 486–
495

Communications affichées:

- Ouadghiri, M., Abitiu, N. And Amar, M. Quatrième salon de l‘innovation, de la recherche

et développement et de la technologie, en présentant un poster traçant les différents activités
et services du Laboratoire de Microbiologie et Biologie Moléculaire - CNRST, organisé au
parc des expositions de l‘office des changes à Casablanca du 6 au 9 octobre 2004.

5
- Abitiu, N., Ouadghiri, M. And Amar, M. Moroccan Coordinated Collections of
Microorganisms – CCMM : National tool for promoting scientific interest and investigation
in microbial biodiversity, Tenth International Congress for Culture Collections – ICCC-10,
Tsukuba – Japan du 10 au 15 Octobre 2004.

- Ouadghiri, M., Vancanneyt, M., Vandamme, P., Naser, S., Gevers, G., Lefebvre, K.,
Swings, J. and Amar, M. Identification of lactic acid bacteria in Moroccan raw milk and
traditionally fermented skimmed milk ‗Lben‘. Journée Nationale de Microbiologie sous le
thème: Microbiologie et santé, Université Hassan II Mohammedia, Faculté des Sciences et
Techniques, Mohammedia, 23 mai 2007.

Communications orales:

- Ouadghiri M., Amar M. « Biodiversité des bactéries lactiques dans le Jben

marocain ». Journées Nationales de Microbiologie, Université Mohamed Premier,
Faculté des Sciences, Oujda, 27 et 28 mai 2005.

6
 Résumé

Un total de 54 échantillons de produits laitiers (lait cru (29), Jben (8) et Lben (17))
provenant de différentes fermes et régions marocaines ont fait l‘objet d‘une analyse
microbiologique pour déterminer leur diversité en bactéries lactiques.
300 bactéries lactiques ont été isolées et identifiées par des méthodes biochimiques
(API50 CHL), moléculaires (SDS-PAGE) et génotypiques ((GTG)5-PCR et séquençage du
gène codant pour l‘ARNt phenylalanine synthase PheS). Cette étude a montré que
l‘identification fiable des 300 isolats a nécessité l‘utilisation d‘une approche polyphasique
incluant des techniques moléculaires de pointes et des logiciels bioinformatiques utilisant de
larges bases de données.
Cette étude montre que la biodiversité du lait cru marocain est caractérisée par des
entérocoques, des lactobacilles, des lactocoques, des leuconostocs et des Weissella. Les
bactéries lactiques les plus fréquentes appartiennent aux espèces Lactococcus lactis,
Leuconostoc pseudomesenteroides, Leuconostoc mesenteroides et Lactobacillus plantarum.
Les bactéries lactiques dominantes dans le « Jben » marocain appartiennent au genre
Lactobacillus (34%), Lactococcus (22%), Leuconostoc (27%) et Enterococcus (10%). Au
niveau de l‘espèce, Leuconostoc pseudomesenteroides est présente dans tous les échantillons
examinés. L‘espèce Lactobacillus plantarum est présente d‘une façon dominante dans la
quasi-totalité des échantillons examinés.
Le ―Lben‖ est typiquement dominé par les espèces Lactococcus lactis (41%),
Leuconostoc pseudomesenteroides (36%) et Lactobacillus plantarum (15%). Leuconostoc
mesenteroides a été trouvé moins fréquemment (5%).
Le lait cru et les produits laitiers traditionnels marocains sont caractérisés par une
riche biodiversité en bactéries lactiques. Cependant, sa prévalence est fonction des fermes, de
la région, des pratiques courantes des producteurs et du mode de production.

Mots clés : lait cru, produits laitiers traditionnels, biodiversité, bactéries lactiques,
(GTG)5-PCR, séquençage, bioinformatique.

7
 Summary
A total of 54 samples of dairy products (raw milk (29), ―Jben‖ (8) and ―Lben‖ (17))
sampled from different Moroccan regions and farms have been investigated for their lactic
acid bacteria microbial diversity.
300 lactic acid bacteria have been isolated and identified using biochemical
(API501CHL), molecular (SDS-PAGE) and genotypic methods ((GTG)5-PCR and
sequencing of the gene coding for phenylalanine tRNA synthase). It has been shown that
reliable identification of the isolates required the use of a polyphasic approach including
molecular techniques and bioinformatic software with large databases.
This study shows that biodiversity of Moroccan raw milk is characterized by
enterococci, lactobacilli, lactococci, leuconostocs and Weissella. The most frequent species of
lactic acid bacteria belong to Lactococcus lactis, Leuconostoc pseudomesenteroides,
Leuconosto mesenteroides and Lactobacillus plantarum.
The dominant lactic acid bacteria in "Jben" belong to the genera Lactobacillus (34%),
Lactococcus (22%), Leuconostoc (27%) and Enterococcus (10%). At the species level,
Leuconostoc pseudomesenteroides is present in all analyzed samples. The species
Lactobacillus plantarum is present in almost all analyzed samples.
The "Lben is typically dominated by the species Lactococcus lactis (41%),
Leuconostoc pseudomesenteroides (36%) and Lactobacillus plantarum (15%). Leuconostoc
mesenteroides was found less frequently (5%).
Moroccan raw milk and traditional dairy products are characterized by a rich
biodiversity of lactic acid bacteria. However, its occurrence depends on the farms, the region,
the practices of farmers and the process of production.

Keywords: raw milk, traditionnel dairy products, biodiversity, lactic acid bacteria,
(GTG)5-PCR, sequencing, bioinformatics.

8
 Liste des abbréviations
ADN : Acide DéoxyriboNucléique
ARN : Acide RiboNucléique
ADNr: ADN ribosomal
ARNt: ARN de transfert
AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism
AFNOR: Association Française de Normalisation
ADP: Adénosine Diphospahte
API: Analytic Programme Index
ATP: Adénosine Triphosphate
BCCM: Belgian Coordinated Collections of Microorganimsms
BSA : Bovine Sérum Albumine
Carno: Carnobacterium
CCMM: Collections Coordonnées Marocaines de Microorganismes
cm : centimètre
CNRST: Centre National pour la Recherche Scientifique et Technique
CO2: dioxyde de carbone
°C: Degré celsus
dATP:Désoxyadénosine Triphosphate
dCTP: Désoxycitidine Triphosphate
DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
dGTP: Désoxyguanosine Triphosphate
DMSO : Diméthylsulfoxyde
dNTP : Désoxyribonucléotides Triphosphate
DO: Densité Optique
dTTP: Désoxythimidine Triphosphate
°D: Degré dornic
EDTA : Ethylène Diamine Tétraacétique Acid
Ent. : Enterococcus
FAO/OMS: Food and Agriculture Organization / Organisation Mondiale de la Santé
g : gramme
GRAS: Generally Regarded As Safe
G+C: Guanine + Cytosine

9
h: heure
HCl : Acide chlorhydrique
Kv : kilovolt
l.: litre
L.: Lactococcus
LAB: Lactic Acid Bacteria
Lact.: Lactobacillus
Leuc.: Leuconostoc
LMBM: Laboratoire de Microbiologie et Biologie Moléculaire
LMG: Laboratoire de Microbiologie de Gand
M : Molaire
mA : milliampère
mg: milligramme
MgCl2 : Chlorure de Magnésium
min: minute
ml: millilitre
mM : millimolaire
mol : mole
MRS: Man Rogosa Sharp
N : Normalité
NaCl : Chlorure de sodium
NAD: Nicotinamide Adénine Dinucléotide
Na2HPO4 : phosphate disodique
NaOH : Hydroxyde de sodium
nb. : nombre
ng. : nanogramme
(NH4)SO4 : sulfate d‘ammonium
Ped.: Pediococcus
Pb : Paire de base
PFGE: Pulsed Field Gel Electrophoresis
Phe S: Phenylalanine Synthase
PheS F: Phenylalanine Synthase Forward
PheS R : Phenylalanine Synthase Reverse
PROTARS : Programmes Thématiques d'Appui à la Recherche Scientifique

10
pH: potentiel Hydrogène
qsp: quantité suffisante pour
RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA
rpm: rotation par minute
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism
rep-PCR: repétitive extragénic palindromique – Polymerase Chain Reaction
sec: seconde
SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate- PolyAcrilamide Gel Electrophoresis
SDS : Sodium Dodecylsulfate
Sp. : espèce non précisée
Spp. : plusieurs espèces non précisée
STET : Saccharose, Tris, EDTA, Triton
Subsp.: Sous esépce
T°: Température
T: Type
TAE: Tris Acétate EDTA
Taq : de Thermus aquaticus
TE: TrisEDTA
TEMED: Tétraméthyléthylènediamine
TES : Tris EDTA Saccharose
TCA : Acide Trichloroacétique
STET : Saccharose Tris EDTA Triton
TE : Tris EDTA
U : unité
UFC: unité formant colonie
UNESCO : Organisation des Nations Unies pour l‘Education, la Science et la Culture
UPMGA: Unweight Pair Group Method with Arithmetic mean
USA : United States of America
V : volt
W.: Weissella
µl: microlitre
µM : micromolaire
µg : microgramme

11
 LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Schéma de fabrication des produits laitiers traditionnels marocains ……..….…. 28

Figure 2 : Dégradation du glucose par les bactéries lactiques …………….………….…… 36
Figure 3: Arbre phylogénétique des bactéries Gram positives basé sur la comparaison des
séquences de l‘ARNr 16S …………………………………………….……………….…… 38
Figure 4 : Gel d‘électrophorése des produits de la (GTG)5-PCR des isolats identifiés par API
50CHL comme des L. lactis …………………………………………………………….…. 62
Figure 5 : Dendrogramme et profils (GTG)5-PCR des bactéries lactiques du gel de la figure 4
…………………………………………………………………………………………….... 62
Figure 6 : Gel d‘électrophorése des produits de la (GTG)5-PCR des isolats identifiés par API
50CHL comme des Leuc.mesenteroides ………………………………………………….... 64
Figure7 : Dendrogramme et profils (GTG)5-PCR des bactéries lactiques du gel de la figure 6
……………………………………………………………………………………………… 64
Figure 8 : Gel d‘électrophorèse des produits de la (GTG)5-PCR de 7 isolats (identifiés
différemment par API 50CHL) …………………………………………………………...… 65
Figure 9: Dendrogramme et profils (GTG)5-PCR de bactéries lactiques du gel de la figure 8
……………………………………………………………………………………………….. 65
Figure 10: Dendrogramme et profils (GTG)5-PCR de bactéries lactiques, isolées du lait cru,
incubé et pasteurisé, groupés et identifiées au niveau de l‘espèce par (GTG)5-PCR ………. 66
Figure 11 : Dendrogramme basé sur l‘analyse numérique des profils protéiques des souches
représentatives de chaque groupe identifié après l‘analyse SDS-PAGE …………………… 68
Figure 12: Dendrogramme et profils (GTG)5-PCR de bactéries lactiques, isolées du Jben,
groupés et identifiées au niveau de l‘espèce par (GTG)5-PCR …………………………..…. 75
Figure 13: Dendrogramme et profils (GTG)5-PCR de bactéries lactiques, isolées du « Lben »,
groupés et identifiées au niveau de l‘espèce par (GTG)5-PCR ………………………………81

12
 LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1: Incidence des bactéries lactiques dans le lait cru marocain et le lait pasteurisé .. 58
Tableau 2 : Résultats des identifications par API 50CHL ……………………………….. 60
Tableau 3 : Comparaison des résultats des identifications par API 50CHL et identification
par (GTG)5-PCR, SDS-PAGE et pheS ……………………………………………………… 70
Tableau 4 : Incidence des bactéries lactiques dans le « Jben » marocain ………………….. 77
Tableau 5 : Incidence des bactéries lactiques dans le « Lben » marocain …………………. 79

13
 LISTE DES ANNEXES

Annexe 1 : Composition des milieux MRS et M17 …………………………………..….. 106

Annexe 2 : Coloration de Gram ………………………………………………………..… 107
Annexe 3 : Les tampons et solutions utilisés pour SDS-PAGE ………………………….. 108
Annexe 4 : Les tampons et solutions nécessaires à l‘extraction d‘ADN …………..…….. 110
Annexe 5 : Les solutions nécessaires pour la réaction (GTG)5-PCR …………………… 112
Annexe 6 : Les gels d‘eléctrophorése des produits de PCR en utilisant (GTG)5 comme
amorce …………………………………………………………………………………… 113

14
 Sommaire
Dedicaces
Avant propos
Production scientifique
Résumé
Summary
Liste des abbréviations
Liste des figures
Liste des tableaux
Liste des annexes
Introduction générale ………………………………………………..….…… 19
Partie I : Revue bibliographique ….....……….…………………………....... 22
I- Le lait et ses dérivés …………………………………………………………………….. 23
1- Le lait cru …………………………………………………………………………… 23
2- Les laits fermentés ……………………………………………………………..…… 24
3- Le fromage frais ……………………………………………………………….……. 26
II- Consommation des produits laitiers au Maroc ………………………………………. 29
III- Composition physico-chimique du lait cru et ses dérivés ………………………….. 29
1- Lait cru …………………………………………………………………...………… 29
2- Lait fermenté écrémé ……………………………………………………………… 30
3- Fromage frais « Jben » ……………………………………………………………. 30
IV- Microbiologie du lait cru et ses dérivés ……………………………………………… 31
1- Lait cru ……………………………………………………………………………… 31
2- Lait fermenté écrémé …………………………………………………………….…. 32
3- Fromage frais …………………………………………………………………….…. 32
V- Découverte et application industrielle des bactéries lactiques ………………………. 33
1- Découverte des bactéries lactiques ………………………………………………… 33
2- Application industrielle des bactéries lactiques ………………………………...… 33
2.1- Les ferments lactiques naturels …………………………………………...…. 33
2.2- Les ferments lactiques sélectionnés ………………………………………...... 34

15
 VI- Caractéristiques, classification et identification des bactéries lactiques ………..…. 34
1- Caractéristiques principales des bactéries lactiques ………………………….…. 34
2- Classification des bactéries lactiques ………………………………………….….. 37
3- Identification et tyage des bactéries lactiques …………………………………… 39
3.1- Méthodes phénotypiques ……………………………………………………... 39
3.2- Méthodes génotypiques ………………………………………………………. 40
3.2.1- Le ribotypage ………………………………………………………... 40
3.2.2- Le profil plasmidique ………………………………………………… 41
3.2.3- Méthodes des empreintes digitales (fingerprinting) …………………. 41
3.2.3.1- L‘électrophorèse en champs pulsé de l'ADN chromosomique digéré
(Puled Field Gel Electrophoresis) …………………………………………………………... 41
3.2.3.2- Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) ………………...… 41
3.2.3.3- Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) ……………… 41
3.2.3.4- repetitive extragenic palindromic- Polymerase Chain Reaction (rep-
PCR) ………………………………………………………………………………… 42
Partie II : Matériel et méthodes .......………………………………………… 43
I- Protcole général de l’étude des différents produits laitiers marocains (lait cru,
« Jben » et « Lben ») ……………………………………………………………………… 44
1- Échantillonnage et isolement des bactéries lactiques …………………….…. 44
1.1- Echantillonnage …………………………………………………………… 44
1.1.1- Lait cru ………………………………………………………………. 44
1.1.2- Lait fermenté écrémé marocain « Lben » ……………………………. 44
1.1.3- Fromage frais traditionnel marocain « Jben » ……………………….. 44
1.2- Analyse des échantillons et isolement des bactéries lactiques …………. 44
1.2.1- Analyse des échantillons ………………………………………..……. 44
1.2.2- Isolement des bactéries lactiques ……………………………….……. 44
2- Analyse préliminaire des isolats ………………………………………………. 45
2.1- Coloration de Gram …………………………………………………………... 45
2.2- Test de la catalase ……………………………………………………………... 45
2.3- Test d’oxydase ………………………………………………………………… 45
II- Identification des isolats de bactéries lactiques ……………………………………...… 46
1- Identification biochimique et phénotypique …………………………………. 46
1.1- Identification biochimique ………………………………………………….. 46

16
 1.2- Identification moléculaire par les protéines totales de la cellule (SDS-PAGE)
…………………………………………………………………………………… 47
1.2-.1- Préparation des protéines totales ……………………………………. 47
1.2.2- Assemblage de la cassette (plaques de verre et le support) et préparation
des gels de concentration et de séparation ………………………………………….. 47
1.2.3- L‘électrophorèse ……………………………………………………… 48
1.2.4- Décoloration ………………………………………………………..… 49
2- Etude genotypique …………………………………………………………..…. 49
2.1- La réaction (GTG)5-PCR …………………………………………………….. 49
2.1.1- Extraction de l‘ADN ………………………………………………… 49
a- Préparation des cellules ………………………………………………….. 50
b- Rinçage …………………………………………………………………… 50
c- Lyse des cellules ………………………………………………………….. 50
d- Purification de l‘ADN ……………………………………………………. 50
e- Précipitation de l‘ADN …………………………………………………… 50
f- Rinçage et séchage de l‘ADN …………………………………………….. 51
g- Resuspension de l‘ADN …………………………………………..……… 51
h- Vérification de la qualité de l‘ADN ………………………..…………….. 51
2.1.2- La réaction (GTG)5-PCR ………………………………..……….…… 51
2.1.2.1- Réaction et programme d‘amplification ……………………….…… 51
2.1.3- Electrophorèse des produits de la réaction PCR …………….……….. 52
2.1.4- Le logiciel Gel Compar II ………………………………………….… 53
2.1.5- Traitement des gels ………………………………………………...… 53
2.1.6- Les souches de références utilisées dans (GTG)5-PCR ………………. 53
2.2- Séquençage du gène Phenylalanyl-tRNA synthase (pheS) …………………. 54
2.2.1- Extraction de l‘ADN ……………………………………………….… 54
2.2.2- Amorces et réaction PCR …………………………………………….. 54
Partie III : Résultats et discussion ……………………...…………………… 56
I- Etude du lait cru d’origine marocaine ……………………………………………….. 57
1- Composition physico-chimique des échantillons ……………………………….. 57
2- Dénombrement, isolement et identification des bactéries lactiques …………… 57
3- Bactéries lactiques dans le lait cru ……………………………………………….. 69
II- Etude du Jben d’origine marocaine ………………………………………………… 74

17
 1- Dénombrement, isolement et identification des bactéries lactiques …………… 74
2- Bactéries lactiques dans le « Jben » marocain ………………………………….. 74
III- Etude du Lben d’origine marocaine ………………………………………………… 79
1- Composition physico-chimique des échantillons ………………………………… 79
2- Dénombrement, isolement et identification des bactéries lactiques ……………. 79
3- Bactéries lactiques dans le « Lben » ……………………………………………… 82
Partie IV : Conclusions et perspectives ………………………………….….. 83
Conclusions ………………………………………………………………………………… 84
Perspectives ………………………………………………………………………………… 85
Références bibliographiques …………………………………...……………. 86
Annexes ……………………………………………..………………………. 105
Annexe 1 ……………………………………………………...…………………………… 106
Annexe 2 ……………………………………………………………...…………………… 107
Annexe 3 ……………………………………………………………...…………………… 108
Annexe 4 ……………………………………………………...…………………………… 110
Annexe 5 ……………………………………………………………...…………………… 112
Annexe 6 ……………………………………………………………...…………………… 113

18
Introduction générale

19
 Depuis l‘antiquité, les bactéries lactiques ont été utilisées pour la fabrication et la
conservation d‘aliments. La découverte de leur action sur le lait fut probablement accidentelle
mais leur utilisation fut perpétuée sous forme de levains naturels (Chammas et al., 2006 ;
Zamfir et al.,2006).
La microflore microbienne du lait cru, composée essentiellement de bactéries
lactiques, participe de façon importante à l‘élaboration des caractéristiques organoleptiques
des produits laitiers fermentés (lait fermenté, fromage). De nombreuses études scientifiques
montrent que les produits laitiers préparés traditionnellement à partir du lait cru ont des
saveurs typiques et des qualités nutritionnelles de plus en plus recherchées par le
consommateur (Chammas et al., 2006 ; Patrignani et al., 2006).
Au Maroc, peu d‘auteurs ont cherché à caractériser la flore microbienne du lait cru et
ses dérivés. Les seuls travaux qui ont été effectués dans ce sens et qui apportent des
informations plus ou moins globales concernent des études faites par Boubekri et al., 1984 ;
Tantaoui-Elaraki et El Marrakchi 1987,, Hamama 1997, Benkerroum et Tamime 2004 et
Srairi et al., 2005. Dans leurs travaux, ces auteurs ont utilisé uniquement des méthodes
physiologiques et biochimiques pour l‘identification des souches de bactéries lactiques isolées
à partir des produits laitiers. Ces méthodes, bien qu‘elles donnent une idée sur la flore
microbienne du lait cru et ses dérivés mais elles ne permettent pas une identification fiable
des isolats. En plus, toute l‘information sur les produits laitiers date des années 90 et les
résultats obtenus, bien qu‘ils soient publiés, néanmoins, ils n‘ont jamais été exploités.
Plusieurs études ont montré que la systématique ne se limite pas aux méthodes
biochimiques et phénotypiques. Dans ce travail, nous nous proposons d‘étudier la flore
microbienne du lait cru et ses deux dérivés (« Jben » et « Lben ») et l‘identifier en utilisant
des méthodes phénotypiques et génotypiques. Pour ce faire, nous allons utiliser les techniques
suivantes : API 50CHL, SDS-PAGE, (GTG)5-PCR et séquençage du géne (PheS).
L‘objectif global de ce travail est :
- l‘identification de la flore microbienne du lait cru et ses dérivés
Les objectifs spécifiques sont :
- connaître la biodiversité des bactéries lactiques des différents produits laitiers
marocains,
- étudier la variabilité de la composition microbiologique des différents produits
traditionnels marocains selon les régions, les fermes, et le procédé de fabrication ,
- déterminer, avec précision, les espèces bactériennes qui sont le plus fréquemment
rencontrées dans les produits laitiers traditionnels,

20
 - déposer les souches isolées et identifiées dans les Collections Coordonnées
Marocaines de Microorganismes pour préserver la biodiversité marocaine en vue de son
utilisation par les générations futures ou dans des applications biotechnologiques.

21
 Partie I
Revue bibliographique

22
 I- Le lait et ses dérivés:

1- Le lait cru :

Le lait est un aliment nutritif pour les êtres humains, il constitue un milieu propice
pour la croissance de nombreux micro-organismes, en particulier les bactéries pathogènes
(Chye et al., 2004). C‘est un aliment de base pour l'homme. Indispensable pour le nouveau-
né, il s'avère très bénéfique pour l'adulte.
Traditionnellement, le lait de vache a été considéré comme un aliment de base dans de
nombreux régimes alimentaires. C‘est une boisson saine puisque sa consommation est
associée à une alimentation de qualité. Il fournit une matrice facilement accessible, riche en
une grande variété de nutriments essentiels : des minéraux, des vitamines et des protéines
faciles à digérer. Il est par conséquent essentiel à l'ensemble des fonctions du corps (Steijns,
2008). Avec les céréales, les viandes, les légumes et les fruits, les produits laitiers sont
considérés comme des aliments riche en nutriments, ils fournissent de nombreux éléments
nutritifs à teneur relativement faible en énergie et indispensables à la santé tout au long du
cycle de vie (Drewnowski, 2005 ; Miller, Jarvis et McBean, 2007). La consommation des
produits laitiers est également associée à des effets bénéfiques sur la santé en plus de leurs
valeurs nutritionnelles (Takahiro et al., 2007)
Le lait et les produits laitiers ont également servi de vecteurs d‘ingrédients
alimentaires fonctionnels (phytostérols, les acides gras et différentes sortes de bactéries
probiotiques) et de source riche pour le développement d'une grande variété d‘ingrédients
novateurs de promotion de la santé qui trouvent leur voie sur le marché (suppléments
diététiques) (Schaafsma et Steijns, 2000 ; Steijns and van Hooydonk, 2000 ; Steijns, 2001a,
2003; Michaelidou et Steijns, 2006 ; Steijns, 2008). Enfin, les protéines laitières sont
préférentiellement introduites dans des formules de nutrition spéciales comme la (re)
construction des tissus et la masse musculaire chez les nourrissons, les personnes
hospitalisées, les athlètes, et les personnes âgées (Steijns, 2001b). Aujourd'hui, les
recommandations diététiques reconnaissent la contribution des produits laitiers à une
alimentation saine, et pourtant il est souvent recommandé d‘utiliser préférentiellement la
gamme des produits pauvres en matière grasse (produit écrémé) à cause de la quantité
relativement forte d‘acides gras saturés contenus dans le lait et leur impact « supposé » sur le

23
risque de développer des maladies cardiovasculaires (Programme mixte FAO / OMS d'experts
Consultation, 2003).
Au Maroc, la production laitière jouit d‘un statut très particulier dans les plans de
développement du secteur agricol car en plus de la création de revenus et d‘opportunités de
travail, elle contribue aussi à l‘approvisionnement d‘une population en plein essor
démographique et dont les habitudes alimentaires évoluent vers davantage de produits de
qualité, en protéines alimentaires (Srairi et al., 2005).

2- Les laits fermentés :

Divers types de produits laitiers fermentés existent à travers le monde (Tamime, 1997 ;
Stanely, 1998). Leur nature dépend du type de lait utilisé, le prétraitement, les conditions de
fermentation et le traitement ultérieur. La fermentation du lait implique principalement les
bactéries lactiques (LAB), mais les Micrococcus, les corynéformes, les levures et les
moisissures peuvent également jouer un rôle (Zamfir et al., 2006). Historiquement, les
produits laitiers fermentés ont été produits pour prolonger la durée de conservation du lait.
Ces aliments traditionnels ont persisté au cours des siècles et ils ont souvent évolué d‘un
niveau artisanal et traditionnel à la fabrication à grande échelle industrielle avec production
utilisant des cultures spécifiques (starter) et équipements modernes (Cogan, 1996 ; Oberman,
1998). L'utilisation de starters a amélioré la qualité technologique des produits laitiers, mais
en même temps, a limité leur biodiversité ainsi que les caractéristiques organoleptiques et la
variabilité du produit fini (Wouters, 2002 ; Leroy, 2004,). Par conséquent, il existe une
demande croissante en nouvelles souches pouvant avoir des caractéristiques recherchées au
niveau du produit fini. Les produits laitiers traditionnels sont une source indéniable d'un tel
genre de micro-organismes (Leroy, 2004). En effet, la fermentation du lait par des micro-
organismes particuliers induit des changements dans le goût, la texture, la couleur, la saveur,
et les propriétés nutritives du lait. Elle fournit toute une gamme de produits finis (Duboc et
al., 2001). C‘est un moyen peu coûteux et une technologie qui préserve les aliments, améliore
leurs valeurs nutritives et améliore leurs propriétés sensorielles (Marty et Kummar, 1995 ;
Steinkrauss, 1996). Elle peut également conduire à la désintoxication, la destruction
d'éléments indésirables présents dans les aliments crus comme le cyanure, les tanins et les
polyphénols (Blandino et al., 2003) et aussi à la dégradation du lactose (Fox et Thomson,
2007 ; Schaasfsma, 2008).

24
 De plus, les laits fermentés ont un effet bénéfique sur la santé humaine
(Oberman, 1998 ; Von Wright, 1998). Ils sont en effet utilisés comme ferments lactiques pour
remédier aux troubles gastro-intestinaux (Rastall et al., 2005).
Les produits laitiers fermentés traditionnellement ont une part très importante dans
l'alimentation quotidienne des gens de différents pays. En effet, ils ont fait l‘objet de plusieurs
études : au Maroc (Ouadghiri et al., 2009), en Roumanie (Zamfir et al., 2006), au Liban
(Chammas et al., 2006), en Egypt (El-Baradei et al., 2008), au Burkina Faso (Aly Savadogo et
al., 2004), au Kenya (Mathara et al., 2004), en Afrique du sud (Beukes et al., 2001) etc.
Généralement, les gens qui vivent à la campagne possèdent leurs propres vaches, ils utilisent
le lait pour produire la crème et le fromage pour leurs propres besoins. Les agriculteurs qui
ont plus d‘animaux vendent le lait à de petites usines situées dans un village voisin, ou
vendent le lait et les produits fermentés sur le marché local (Zamfir et al., 2006 ; Ouadghiri et
al., 2009). Dans la plupart des cas, le lait non pasteurisé est utilisé et le processus de
fermentation se base sur la flore microbienne naturelle du lait et de l'environnement (levains
naturels). Le processus appelé « Backslopping » consiste à prélever une partie d'un lait
traditionnellement fermenté ou de crème aigre à partir d'un lot précédant et l‘utiliser comme
inoculum pour la nouvelle fournée. Ce processus est parfois pratiqué pour accélérer la
fermentation. Les produits fabriqués par ce processus peuvent avoir une teneur microbienne
très constante dans le temps. (Zamfir et al., 2006 ; El Baradei et al., 2008 ; Nzigamasabo et
al., 2009 ; Ouadghiri et al., 2009). Cependant, les conditions environnementales telles que la
température, l‘origine du lait, les conditions de transformation et les conditions sanitaires, etc,
peuvent avoir une influence significative sur la composition microbienne des produits laitiers
fabriqués traditionnellement.
Au Maroc, la fermentation du lait donne le «Lben ». Sa préparation, très simple, est
demeurée au stade familial ou artisanal (Benkerroum et Tamime 2004): le lait est abandonné à
lui-même jusqu'à sa coagulation. Celle-ci se fait à température ambiante et dure 24 à 48 h
suivant la saison. Le barattage qui lui succède dure 30 à 40 min. A la fin du barattage, on
ajoute généralement un certain volume d'eau (environ 10 % du volume du lait), chaude ou
froide, suivant la température ambiante, de façon à ramener la température de l'ensemble à un
niveau convenable au rassemblement des grains de beurre ; produit de grande valeur
marchande (A. Tantaoui-Elaraki et al., 1983).

25
 3- Le fromage frais :

Plusieurs variétés de fromage à partir du lait de vache, de chèvre et de brebis sont

fabriquées, à travers le monde, dans des fermes suivant des techniques traditionnelles, sans
addition intentionnelle de levains, et sont généralement conçues comme des " fromages
artisanaux". Les paramètres technologiques ont une grande influence sur les caractéristiques
finales du fromage et jouent un rôle important dans la composition microbienne qui est
considérée à la fois par les fabricants et les consommateurs comme une caractéristique
spéciale des fromages artisanaux (Randazzo et al., 2009).
Le « Jben » est le fromage frais le plus connu et consommé au Maroc depuis fort
longtemps aussi bien en milieu rural qu'en milieu urbain. Dernièrement, la consommation de
ce produit s'est accrue suite à l'installation dans les villes d'un grand nombre de laiteries
traditionnelles qui préparent le « Jben » à partir du lait cru selon des procédures souvent
artisanales. A côté de ce secteur traditionnel, certaines unités laitières semi-industrielles se
sont aussi intéressées à la fabrication du « Jben », utilisant du lait soit cru, soit pasteurisé, et
des procédures de préparation plus ou moins améliorées. De ce fait, il existe aujourd'hui de
nombreuses méthodes de préparation du « Jben », et par conséquent, plusieurs variétés de
fromage frais sont commercialisées au Maroc sous la dénomination populaire commune de
"Jben" (Benkerroum et Tamime 2004).
D‘une manière générale, le fromage frais commercialisé est fabriqué soit à partir du
lait de vache ou du lait de chèvre. Le processus de fabrication nécessite trois grandes étapes
essentielles (voir figure 1): la maturation, la coagulation et l‘égouttage (Randazo et al.,
2002) :
 la maturation : c‘est l‘incubation du lait cru à température ambiante pendant un
temps variable de façon à favoriser la multiplication d‘une flore lactique qui va jouer un rôle
important dans l‘acidification du lait. Cette maturation peut être spontanée ou provoquée par
adjonction de levains. Le recours à des levains artificiels du commerce n‘est cependant pas
toujours une nécessité absolue, car le fermier producteur de lait a lui-même la possibilité de
cultiver un levain naturel à partir de la flore contenue dans son propre lait.
 La coagulation : c‘est une opération qui vise à coaguler le lait au moyen de la
présure (emprésurage) ou de toute autre enzyme coagulante. L‘activité coagulante est
déterminée par la force de présure, la température du lait et son acidité. Après l‘emprésurage,
le lait est abandonné au repos à température ambiante pendant 6 à 10 heures. Il va prendre en
masse (caillage) avec une consistance plus ou moins ferme selon le degré d‘acidité développé.

26
En réalité, le coagulum est obtenu par deux modes de coagulation : la coagulation dite
lactique et celle engendrée par l‘action de la présure. Ces deux modes ont une action
simultanée sur le lait avec cependant une prédominance plus ou moins marquée de l‘un ou
l‘autre selon que le fromager souhaite obtenir une pâte à caractère plus présure ou à caractère
plus lactique.
 L‘égouttage : un des buts essentiels de cette opération est de régler la teneur en
eau du fromage. Il permet l‘élimination de la plus grande partie du sérum qui imprègne le
coagulum. L‘égouttage est amorcé dans des moules qui confèrent au fromage sa forme. La
nature du gel influe sur la conduite de l‘égouttage. Un gel lactique subit un égouttage
spontané et le caillé a par conséquent une forte humidité. Cependant, un gel présure est un gel
compact, solide ou l‘égouttage ne peut avoir lieu qu‘après certaines interventions telles des
actions mécaniques de pression.
Suivant le goût du fromager, le salage peut être fait. C‘est une opération importante
dans la fabrication des fromages. Elle a des effets multiples : elle améliore l‘égouttage en le
complétant, elle oriente et sélectionne le développement microbien et relève la saveur de la
pâte (Kbibou, 1987; Benkerroum et Tamime 2004).

27
 Lait cru

∙ Fermentation spontanée
Maturation (T° ambiante 24-72h)

Coagulation Lait caillé

∙ Barattage
Égouttage
« Lben Beurre
» (zebda beldia)

Maturation
(Optionnel)

« Jben »

Fig.1. Schéma de fabrication des produits laitiers traditionnels marocains

(Benkerroum et Tamime 2004)

28
II- Consommation des produits laitiers au Maroc :

Malgré l‘augmentation de la production laitière durant ces dernières années

(triplement de la production entre 1969 et 2004), le niveau de consommation en lait et dérivés
demeure faible (38 litres/an) comparativement aux pays du Maghreb ; l‘Algérie et la Tunisie
ou la consommation respective en lait est de 95 et 68 litres/an. Cette faible consommation
peut s‘expliquer par des habitudes alimentaires où le lait n‘est pas souvent utilisé dans les
préparations culinaires, et surtout par la faiblesse du pouvoir d‘achat. De plus, le lait n‘est pas
accessible pour de nombreux ménages surtout en milieu rural (Haut Commissariat au Plan,
2004).

III- Composition physico-chimique du lait cru et ses dérivés:

1- Lait cru :

Le lait est un liquide blanc mat, légèrement visqueux, dont la composition et les
caractéristiques physico-chimiques varient sensiblement selon les espèces animales, et même
selon les races (Rahali et Ménard, 1991 ; Soryal et al., 2004). Ces caractéristiques varient
également au cours de la période de lactation, de la traite ou de l'allaitement. Elles sont aussi
tibutaires de la nature de l‘alimentation des animaux (Sutton, 1989 ; Coulon et al., 1995).
Schématiquement, on peut considérer le lait comme une émulsion de matière grasse
dans une solution aqueuse, comprenant de nombreux éléments, dont les uns sont à l‘état
dissous et les autres sous la forme colloïdale. D‘après Doyle et al., 2001, Le lait renferme une
grande quantité d‘eau 87%, le lactose (4.8 %), les lipides (3.7%), la caséine (2.6%), l‘azote
non protéique (urée, créatinine), les protéines du petit lait (0.6%) et les sels minéraux :
cations: sodium (58mg/100g), potassium (140mg/100g), calcium (118mg/100g) et
magnésium (12mg/100g) ;
anions : citrate (176mg/100g), chlorure (104 mg/100g) et phosphore (74 mg/100g)
Il existe en effet de fortes variations de composition entre les laits provenant de
différentes exploitations. Ces variations sont dues essentiellement à l‘état de l‘animal :
hérédité, âge, état de santé, équilibre neurovégétatif, régime alimentaire, période de lactation,
qualité du trayeur, vitesse de la traite et au conditionnement au moment de la traite (Ercolini
et al., 2009).

29
 Concernant la composition physico-chimique, le lait est à la fois une émulsion, une
solution et une suspension. Les sels minéraux (à l‘état d‘ions ou de sels non dissociés) et le
lactose sont en solution. La matière grasse est en émulsion, les matières azotées (caséines)
étant en suspension (Bennacir, 1985).
Le pH du lait est légèrement acide (compris entre 6,4 et 6,8 pour le lait de vache).
L'acidité du lait augmente avec le temps. En effet, sous l‘action des micro-organismes du lait,
le lactose va être dégradé en acide lactique, ce qui permettra d'avoir un indicateur du degré de
conservation du lait qui est le degré dornic (°D) (Doyle et al., 2001).

2- Lait fermenté écrémé « Lben »:

La composition chimique du « Iben » est variable, elle dépend des localités, des
régions, des fermes, de la composition chimique du lait cru de départ et de la procédure de
fabrication (El Baradei et al., 2008). Néanmoins, certains indicateurs donnent une idée sur la
qualité globale du produit et le processus de sa fabrication. La fermentation du lactose
augmente l‘acidité titrable dans le « Lben » a plus de 0.60 % d‘acide lactique, par conséquent
le pH et le lactose baissent respectivement au dessous de 4.7 et 3.7 g 100g-1. L‘extraction du
beurre diminue le contenu en lipides à environ 1.8 g.100 g−1 (Benkerroum et al., 1984).
Généralement, Les valeurs moyennes pour les principaux constituants sont les suivantes: pH :
4.2; acidité titrable : 8.2 g en acide lactique; graisses: 8.9 g/l; protéines totales: 25.6 g/l;
lactose: 26.9 g/l et matière sèche totale: 89 g /l (A. Tantaoui-Elaraki et al., 1987)
La fermentation du citrate dans le lait génère des composés carbonés volatiles
(acétaldéhyde, acétoine et diacétyl). On reporte aussi la présence d‘éthanol dans le « Lben »,
c‘est un élément qui confère un arôme typique au produit, pourtant, sa concentration est trop
faible pour donner un goût alcoolique au produit.

3- Fromage frais « Jben » :

Comme mentionné ci-dessus pour le lait fermenté « Lben », le fromage frais « Jben » ne
présente pas de caractéristiques définies à cause des méthodes artisanales utilisées pour sa
préparation reposant, essentiellement, sur les connaissances acquises à partir d'une longue
expérience (Salmeron et al., 2002). Les arômes, les propriétés organoleptiques et les
caractéristiques physico-chimiques du fromage dépendent de celles du lait cru qui à son tour
dépend de la race des animaux et leur type d‘alimentation (Poznanski et al., 2004).

30
Généralement, Le pH (<4,2) et l'acidité titrable (> 0,9%) sont les paramètres les moins
variables du « Jben ». Cependant, les matières solides totales du « Jben » sont le facteur le
plus variable car ce dernier dépend de la durée d'égouttage. Étant donné que les lipides, le
lactose et les protéines constituent les principaux composants de l'ensemble des matières
solides en « Jben », ils sont directement influencés par les variations des dites matières solides
(Benkerroum et Tamime 2004).

IV- Microbiologie du lait cru et ses dérivés:

1- Lait cru :

La Connaissance de la composition microbienne du lait est d'un intérêt particulier pour

les agriculteurs et les transformateurs du lait. Le prix du lait est calculé en fonction du nombre
total de bactéries qui doit être aussi faible que possible (Verdier-Metz et al., 2009). Le lait
dans les cellules du pis est stérile (Tolle, 1980), mais la glande mammaire, la peau du pis
(Brisabois et al., 1997), le matériel de traite, la litière, la qualité de l'air et les pratiques des
éleveurs (Sevi et al., 1998, 2003 ; Ménard et al., 2004) sont des sources de contamination. La
colonisation du lait par des microorganismes n‘a été que partiellement décrite. Seuls les
microorganismes pathogènes ont été souvent considérés (Wareing, 2005).
Les genres : Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus et
Micrococcus spp. constituent la flore bactérienne du lait (Chye et al., 2004). Cette flore peut
être prédominée par les psychrotrophes si le lait est conservé au frais avant son utilisation
ultérieure (Bishop et White, 1986 ; Sorhaug et Stepaniak, 1997). La détection des bactéries
coliformes et des pathogènes dans le lait témoigne d'une contamination fécale possible (Olson
et Mocquot, 1980; Bonfoh et al., 2003). Généralement, un lait cru provenant d'une vache en
bonne santé contient une faible charge microbienne (moins de 1000 ml-1), mais cette charge
peut augmenter jusqu'à 100 fois ou plus quand le lait est abandonné à température ambiante
(Richter et al., 1992).
Toutefois, le maintien du lait dans des contenants propres et sa conservation au
réfrigérateur immédiatement après la traite peuvent retarder l'augmentation de la charge
microbienne initiale et éviter la multiplication des micro-organismes dans le lait entre la traite
à la ferme et le transport vers l‘usine de transformation (Adesiyun, 1994 ; Bonfoh et al.,
2003).

31
 2- Lait fermenté écrémé:

Les premières études sur la composition microbiologique des laits fermentés datent de
la fin du 19éme siécle (Obermann et al., 1998). A l'heure actuelle, des espèces de bactéries
lactiques des genres Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus et
Bifidobacterium ont été identifiées dans les laits fermentés. Des souches de Lactococcus,
Lactobacillus, Streptococcus, et Bifidobacterium sont principalement utilisées dans les
cultures commerciales d'amorçage (Mogensen et al., 1993). Très peu d'information est
disponible sur la flore microbienne impliquée dans la fabrication traditionnelle du lait
fermenté (Cogan et al., 1997 ; Bizzaro et al., 2000 ; Randazo et al., 2002 ; Caridi et al., 2003 ;
Fortina et al., 2003.).
Au Maroc, une étude de la flore microbienne impliquée dans la fermentation du lait
pour produire le « Lben » a montré que les bactéries lactiques mésophiles sont responsables
de la fermentation lactique et du développement de l‘arôme dans le « Lben », elles peuvent
atteindre 108 cfu.ml−1 .
Les espèces Lactococcus et Leuconostoc sont prédominantes dans le « Lben », les
Lactobacillus spp. sont présents à de faibles nombres. Les espèces dominantes sont
Lactococcus lactis subsp. lactis et subsp. lactis biovar diacetylactis, et Leuconostoc
mesenteroides subsp. cremoris et subsp. lactis. (Tantaoui-Elaraki et al (1983a) et Tantaoui-
Elaraki et al (1983b)

3- Fromage frais :

La composition microbiologique du fromage dépend de celle du lait de départ, du

processus de fabrication qu‘il a subi et de l‘âge du fromage (Ercolini et al. , 2009).
Généralement, elle est dominée par les bactéries lactiques en l‘occurence les Lactococcus et
les Enterococcus qui influencent les caractéristiques sensorielles du produit fini (Randazzo et
al . , 2009).
La microflore du « Jben » marocain est dominée par les bactéries lactiques (108-109
ufc.g-1) qui sont principalement représentées par L. lactis subsp. lactis, Leuc. mesenteroides
subsp. lactis et Lact. casei subsp. casei (Hamama, 1997). En plus des bactéries lactiques dans
le « Jben », d'autres micro-organismes peuvent être présents en assez grand nombre. Les
dénombrements des levures et moisissures peuvent dépasser 106 ufc.g-1. Bien que les levures
dans le « Jben » ne soulèvent pas d'inquiétude pour la sécurité du produit, leur nombre élevé

32
dans le produit est associé avec les principaux défauts du produit, tels que l'aspect visqueux,
la décoloration et la forte odeur d'alcool. Néanmoins, à des niveaux modérés, les levures
peuvent contribuer à la saveur du produit. Les coliformes et les entérocoques ont été
également signalés à des nombres dépassant 105 ufc.g-1 (Benkerroum et Tamime 2004).

V- Découverte et application industrielle des bactéries lactiques:

1- Découverte des bactéries lactiques :

Bien avant que l‘on soit conscient de l‘existence des bactéries lactiques, elles n‘ont été
utilisées que récemment dans la conservation des aliments à base de lait, de viande, de
poissons, de légumes et de fruits (Paul Ross et al., 2002). C‘est à l‘époque des grandes
découvertes de la microbiologie, à la fin du 19 éme siècle, que des chercheurs se sont penchés
sur la fermentation du lait pour trouver la cause de sa coagulation acide. Storch (1890), Conn
(1889) et Weigmann (1896) ont conclu que la présence de bactéries lactiques est responsable
de l‘acidification du lait et de la maturation de la crème (De Roissart et Luquet, 1994).

2- Application industrielle des bactéries lactiques :

Les bactéries lactiques furent et sont encore utilisées sous la forme de levains
artisanaux, mais le développement de l‘industrie de transformation, en particulier de
l‘industrie laitière, a conduit à la production de ferments industriels capable d‘assurer à la fois
la qualité et la constance du produit (Leveau et Bouix, 1993 ; Pfeiler et Klaenhammer 2007).
Les bactéries lactiques produites comme ferments commerciaux sont des cultures
pures ou un mélange appartenant aux genres : Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus,
Leuconostoc, Pediococcus et Bifidobacterium. (Leveau et Bouix, 1993)
On doit d‘emblée souligner la dualité qui existe entre les ferments lactiques naturels et
les ferments lactiques sélectionnés (De Roissart et Luquet, 1994; Wouters et al., 2002).

2.1- Les ferments lactiques naturels : proviennent du lait n‘ayant subi aucun
traitement thermique et sont de composition complexe et variable selon le terroir d‘ou ils
proviennent.

33
 2.2- Les ferments lactiques sélectionnés : sont composés d‘une souche pure ou d‘un
ensemble de souches pures. On entend par souche pure, suivant la définition classique, une
population formée à partir d‘une colonie isolée, développée sur boite de pétri sur un milieu de
culture gélosé, c‘est à dire une culture provenant en principe d‘une seule cellule bactérienne.
Normalement, les bactéries constituant ces ferments sont des espèces déterminées et
leur activité globale caractérise le ferment : l‘acidification, la protéolyse, la formation
d‘arômes. Actuellement, les souches commercialisées ont été isolées du lait ou des produits
laitiers et en particulier des levains artisanaux (Wouters et al., 2002).
Les qualités exigées des ferments lactiques sont multiples. Ces derniers doivent être
capables de transformer l‘aliment en un nouveau produit possédant des propriétés définies et
constantes et permettre une bonne conservation de l‘aliment en le protégeant en particulier
contre la détérioration par d‘autres micro-organismes par le biais de l‘acidification et / ou la
production d‘antibiotiques et de bactériocines (Wouters et al., 2002 ; Patrignani et al., 2006).
De nos jours, les bactéries lactiques sont, de plus en plus, recherchées pour d‘autres
qualités :
- nutritionnelles et thérapeutiques dans des préparations appelées probiotiques.
(Leveau et Bouix, 1993; Patrignani et al., 2006 ; Steijns et al., 2008),
- de production de bactériocines : substances actives inhibant la croissance d‘autres
microorganismes qui sont généralement pathogènes (Cleveland et al., 2001 ; Paul
Ross et al., 2002 ; Touré et al., 2003)

VI- Caractéristiques, classification et identification des bactéries lactiques :

1- Caractéristiques principales des bactéries lactiques :

Les bactéries lactiques sont des cellules vivantes, procaryotes, hétérotrophes et

chimio-organotrophes. A quelques exceptions près, les bactéries lactiques sont généralement
Gram positives, immobiles, asporulées, anaérobies mais aérotolérantes, et ne possédant pas de
catalase (certaines souches possèdent une pseudocatalase), de nitrate réductase, et de
cytochrome oxydase. Elles ont des exigences nutritionnelles nombreuses (acides aminés,
peptides, sels, acides gras et glucides) (Holzapfel et al., 2001 ; Gevers 2002)
Toutes les bactéries lactiques ont un métabolisme fermentaire strictement
saccharolytique qui, en utilisant les glucides, elles peuvent produire soit de :

34
 - l‘acide lactique exclusivement (bactéries homolactiques strictes),
- l‘acide lactique et de l‘acide acétique (bactéries hétérolactiques facultatives),
- l‘acide lactique, de l‘acide acétique ou de l‘éthanol et de CO2 (bactéries
hétérolactiques strictes) (Vandamme et al., 1996).
Certaines espèces ou certaines souches peuvent en outre produire de l‘acide formique ou de
l‘acide succinique (Voir figure 2) (De Roissart et Luquet, 1994).

35
 Voie homolactique voie hétérolactique

Glucose glucose

Glucose-6-phosphate Glucose-6-phosphate

6 phosphogluconate

Fructose-6-phosphate
CO2 ribulose-5-P

Fructose-1,6-diphosphate

Glycéraldéhyde-3- P dihydroxyacétone-P Glycéraldéhyde-3- P acétyl-P

2 1,3 acide di-phosphoglycérique 1,3 acide di-phosphoglycérique acétaldéhyde

2 3-acide phosphoglycérique 3-acide phosphoglycérique éthanol

2 phosphoenol pyruvate phosphoenol pyruvate

2 Acide pyruvique Acide pyruvique

2 Acide lactique Acide lactique

Figure 2 : Dégradation du glucose par les bactéries lactiques (De Roissart et Luquet,
1994).

36
 2- Classification des bactéries lactiques :

Traditionnellement, les bactéries lactiques ont été classées sur la base des propriétés
phénotypiques : la morphologie, le mode de fermentation du glucose, la croissance à
différentes températures, l‘isomére de l'acide lactique produit et la fermentation des différents
hydrates de carbone (De Roissart et Luquet, 1994; Holzapfel et al., 2001). Cependant, les
études basées sur la comparaison des séquences de l'ARN ribosomal 16S ont montré que
certains taxons générés sur la base de la caractérisation phénotypique ne concordent pas avec
les relations phylogénétiques suggérées. Ainsi, certaines espèces ne sont pas faciles à
distinguer par des caractéristiques phénotypiques (Gevers, 2002). Par conséquent, Les
méthodes de typage moléculaire telles que l'électrophorèse en champ pulsé (PFGE), la
réaction de polymérisation en chaine utilisant des éléments répétés (rep-PCR), ainsi que les
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) sont extrêmement précieux pour la
caractérisation et la détection des bactéries lactiques (Holzapfel et al., 2001).
Sur la base des données de séquençage de 16S et 23S de l‘ADNr, les bactéries Gram
positives forment deux embranchements (figure 3). Un embranchement composé de bactéries
Gram positives avec un pourcentage G + C inférieur à 50% (Clostridium) et un autre formé de
bactéries ayant une teneur en G + C supérieure à 50% (Actinomycétes) (Holzapfel et al.,
2001 et Gevers, 2002). Les bactéries lactiques typiques ont une teneur en G + C inférieure à
50% alors que le genre Bifidobacterium qui, d'un point de vue physiologique, fait partie des
bactéries lactiques, appartient à la branche des Actinomycètes qui comprend aussi
Propionibacterium et Brevibacterium (Vandamme et al., 1996). Il y a peu de corrélation entre
la classification traditionnelle et la parenté phylogénétique des bactéries lactiques. Des genres
morphologiquement distincts, Lactobacillus, Leuconostoc et Pediococcus sont
phylogénétiquement entremêlés (Schleifer et Ludwig, 1996 ; Gevers, 2002).
Les bactéries lactiques sont définies comme des bactéries qui fermentent le glucose
pour produire surtout l‘acide lactique. Cependant cette définition couvre plus de taxa que ceux
désignés par bactéries lactiques. C‘est surtout leur importance dans la fermentation des
aliments et produits alimentaires (viandes, végétaux, fruits, poissons, produits laitiers et
ensilage) qui les délimite (Vandamme et al., 1996). Ainsi le groupe des bactéries lactiques
renferme les genres suivants: Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus,
Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et
Weissella. Le genre Bifidobacterium est considéré comme appartenant aux bactéries lactiques

37
du fait de son effet probiotique sur l‘organisme et son utilisation dans les aliments
(Vandamme et al., 1996 ; Gevers 2002 ; Patrignani et al., 2006).

Figure 3: Arbre phylogénétique des bactéries Gram positives basé sur la comparaison des
séquences de l‘ARNr 16S. La barre indique une divergence de séquence à 10%. (Schleifer et
Ludwig, 1995)

38
 3- Identification et typage des bactéries lactiques :

L'approche classique de la taxonomie des bactéries lactiques a été toujours basée sur
les caractéristiques morphologiques et physiologiques. Cette identification a été élargie pour
inclure des marqueurs chimiotaxonomiques (acides gras cellulaires), analyse des protéines
totales de la cellule et autres caractéristiques de la cellule (Holzapfel et al., 2001 ;
Temmerman et al., 2004). Une identification fiable est dépendante de l'information
génotypique. Les méthodes génotypiques tels que le séquençage de l'ADNr, ribotypage,
Random Amplified polymorphic DNA (RAPD), rep-PCR fingerprinting, Amplified Fragment
Length Polymorphism (AFLP), électrophorèse en champ pulsé (PFGE) de l'ensemble de
l'ADN chromosomique digéré constituent aujourd'hui une partie importante de la taxonomie
moderne des bactéries lactiques (Holzapfel et al., 2001 ; Gevers, 2002 ; Temmerman, 2003 ;
Temmerman et al., 2004).
Ci-dessous, un aperçu concis des techniques les plus importantes utilisées pour la
classification et l'identification des bactéries lactiques.

3.1- Méthodes phénotypiques :

Les méthodes phénotypiques sont toujours utilisées dans les laboratoires de
microbiologie alimentaire appliquée. Différents tests clefs ont été largement adoptés et de nos
jours, les caractérisations morphologiques ainsi que les méthodes physiologiques,
métaboliques, biochimiques et chimiotaxonomiques sont pratiquées. Des tests physiologiques
simples, tels que la croissance à différentes températures, la tolérance aux acides et au sel
ainsi que la production de gaz sont utiles pour la différenciation des genres (Gevers, 2002 ;
Temmerman et al., 2004).
Parmi les méthodes biochimiques utilisées, les microméthodes ont connu un
développement important, avec la commercialisation de systèmes d‘identification associant,
pour un groupe bactérien donné, une galerie miniaturisée de tests biochimiques, et des
documents ou des programmes informatiques permettant d‘interpréter les résultats obtenus
(De Roissart et Luquet, 1994). La première galerie biochimique miniaturisée destinée à
l‘identification des bactéries lactiques a été la galerie API (Analytic Programme Index)
50 CHL, commercialisée en 1970 pour l‘étude des souches du genre Lactobacillus, puis
rapidement étendue à d‘autres genres (Leuconostoc et Lactococcus). Cette technique nécessite
une durée d‘incubation plus ou moins longue (12 heures à 48 heures) mais exige l‘emploi
d‘un inoculum de faible charge bactérienne.

39
 La comparaison des profils des protéines totales de la cellule obtenus par
electrophorése sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE), s'est révélée être extrêmement fiable
pour l'identification au niveau de l‘espèce voir même de la sous-espèce, à condition d‘avoir
une base de données des profils protéiques numérisés et normalisés de toutes les espèces
connues de bactéries lactiques (Pot et al., 1994 ; Vandamme et al., 1996). Pour certaines
espèces, le pouvoir discriminatoire de cette technique est limité, c‘est le cas du complexe
Lactobacillus acidophilus (Gancheva et al., 1999), et les espèces Lactobacillus plantarum,
Lactobacillus pentosus et Lactobacillus paraplantarum (Torriani et al., 2001).

3.2- Méthodes génotypiques :

Les techniques basées sur l‘analyse de l'ADN permettent une meilleure différenciation
des micro-organismes à différents niveaux, allant du genre jusqu‘à la souche en fonction des
méthodes utilisées. En général, elles ont l'avantage sur les méthodes d'identification
phénotypique de ne pas être influencé par les conditions de culture (Gevers, 2002). Le
séquençage direct du gène d'ARNr 16S est l'une des méthodes les plus puissantes pour
l‘identification en une seule étape d'une souche inconnue. Toutefois, il existe quelques limites
(Vandamme et al., 1996; Rossello-Mora et Amann, 2001). A titre d‘exemple certaines espèces
qui sont différentes peuvent avoir les même séquences de l'ADNr 16S (Fox et al., 1992) et la
fiabilité de certaines séquences hébergées dans la base de données peut être discutable.
Les méthodes de typage des souches deviennent de plus en plus importantes dans
l'étude des bactéries lactiques. Les méthodes génotypiques utilisées pour le typage
comprennent PFGE de l‘ADN chromosomique digéré, ribotypage, profil plasmidique et les
méthodes de typage (empreintes digitales) basées sur PCR telles que les RAPD, AFLP et rep-
PCR.

3.2.1- Le ribotypage :
Il associe l‘analyse de l'ADN chromosomique par des enzymes de restriction
avec l'utilisation de sondes ADN recombiné ; ce qui permet de différencier entre les
différentes espèces (Johansson et al., 1995a; Rodtong et Tannock, 1993; Zhong et al., 1998;
bjorkroth et Korkeala, 1996 ; Lyhs et al., 1999). Le pouvoir discriminatoire de la méthode
dépend du nombre et du type de sondes d'oligonucléotides et enzymes de restriction utilisées.
Le ribotypage a été particulièrement utilisé pour révéler les hétérogénéités entre des souches à
faible homologie (Roussel et al., 1993).

40
 3.2.2- Le profil plasmidique :
La variation du nombre et de la taille des plasmides hébergés par des souches
de la même espèce, est utile pour typer les bactéries lactiques car la plupart des souches de ce
groupe semblent contenir plusieurs plasmides (Hill et Hill, 1986; Ahrne et al., 1989, Tannock
et al., 1990 ; Dykes et von Holy, 1994 ; Holzapfel et al., 2001). Cependant, cette méthode de
typage est affectée par la capacité des souches à perdre ou à gagner des plasmides.

3.2.3- Méthodes des empreintes digitales (fingerprinting) :

3.2.3.1- L’électrophorèse en champs pulsé de l'ADN chromosomique
digéré (Puled Field Gel Electrophoresis) :
Cette technique est souvent considérée comme la meilleure des méthodes de
typage moléculaire, car elle a un pouvoir discriminatoire puissant et une plus grande
reproductibilité (Tenover et al., 1995). Cependant, cette méthode assez laborieuse nécessite
une approche spécifique à chaque espèce (différentes enzymes de restriction et conditions
d‘électrophorèse). Elle est donc principalement utilisée pour étudier la diversité intra-
spécifique et vérifier l‘origine des souches (clonalité) (McCartney, 2002).
3.2.3.2- Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD):
Considérée comme une méthode rapide, sensible et moins coûteuse pour le
typage des différentes souches de bactéries lactiques (BenAmor et al., 2007). Elle a été
utilisée avec succès pour différencier les bactéries lactiques au niveau intra-spécifique
(Johansson et al., 1995b ; Berthier et Ehrlich, 1999), au niveau inter-spécifique pour les
entérocoques (Descheemaeker et al., 1997), pediocoques (Nigatu et al., 1998), et les
lactobacilles (Du Plessis et Dicks, 1995; Gancheva et al., 1999; Khaled Daud et al., 1997 ;
Nigatu et al., 2001), et au niveau inter-genre (Cocconcelli et al., 1995 ; Moschetti et al., 2001 ;
Yost et Nattress, 2002). Cependant, des amorces avec un fort pouvoir discriminatoire et une
large applicabilité dans un grand groupe d'espèces de bactéries lactiques n'ont pas été décrites.
La RAPD n'est pas approprié pour la construction d‘une base de données pour l'identification.
3.2.3.3- Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) :
Cette technique a été signalée comme l'un des outils les plus reproductibles
permettant de discriminer les souches au niveau de l'espèce et intra-spécifique (Janssen et
al.,1996) et son utilisation est en augmentation (Torriani et al., 2001; Gancheva et al., 1999;
Bruinsma et al., 2002; Borgen et al., 2002 ; Vancanneyt et al., 2002).

41
 3.2.3.4- repetitive extragenic palindromic- Polymerase Chain Reaction
(rep-PCR):
Les séquences répétitives existent en multiples copies dans le génome de la
plupart des bactéries Gram négatives et Gram positives (Lupski et Weinstock, 1992). Trois
types de séquences répétitives ont été identifiés chez les bactéries : des séquences répétitives
inversées REP (Sharples et Lloyd, 1990), des consensus entérobactériens à séquences
répétitives intergéniques ERIC (Hulton et al., 1991) et les éléments BOX (Versalovic et
Lupski, 1998). Ces séquences sont localisées en orientation inverse dans des zones distinctes
sur le chromosome bactérien. Ces séquences paraissent hautement conservées chez les
souches apparentées et très distinctes entre les différentes espèces ou genres bactériens
(Versalovic et al., 1991, 1992). L‘amplification sélective des régions existant entre ces
séquences conservées générent des amplicons de tailles variables qui seront séparés par
électrophorèse sur gel d‘agarose ensuite comparés aux profils des souches de référence
(Heyndrickx et al., 2007). Pour les bactéries lactiques l‘amorce (GTG)5 est considérée comme
une très bonne approche pour le typage et l‘identification des Lactobacillus et des
Enterococcus (Gevers et al. 2001 ; Svec et al. 2005).

42
 Partie II
Matériel et méthodes

43
I- Protocole général de l’étude des différents produits laitiers marocains
(lait cru, « Jben » et « Lben ») :

1- Échantillonnage et isolement des bactéries lactiques:

1.1- Echantillonnage :
1.1.1- Lait cru :
Vingt neuf échantillons de lait cru ont été prélevés dans quatre régions
différentes du Maroc ; El-Jadida ⁄ Mohammedia, Kenitra, Rabat et Tétouan.
Un échantillon de lait pasteurisé a été inclus dans cette étude comme contrôle
positif.
1.1.2- Lait fermenté écrémé marocain « Lben » :
Un total de 8 échantillons de laits fermentés écrémés ―Lben‖ ont été prélevés
dans quatre régions différentes du Maroc ; El-Jadida ⁄ Mohammedia, Kenitra, Rabat et
Tétouan.
1.1.3- Fromage frais traditionnel marocain « Jben » :
Dix-sept échantillons de fromage blanc traditionnel ―Jben‖ ont été prélevés
dans huit villes différentes du Maroc (Agadir, Casablanca, Fès, Marrakech, Rabat, Safi,
Sefrou et Tetouan).

1.2- Analyse des échantillons et isolement des bactéries lactiques :

1.2.1- Analyse des échantillons :
Les échantillons des différents produits laitiers étudiés (lait cru, « Lben » et
« Jben ») ont été mis dans des pots stériles et ont été conservés à 4°C. Une fois au laboratoire,
le pH des échantillons de lait cru et du « Lben » a été déterminé en utilisant un pH mètre
(8521 Hanna Instruments, Amorim, Portugal), l‘acidité Dornic a été déterminée en titrant 20
ml de l‘échantillon contre NaOH 0.05 mol.l-1, la phénolphthaléine (à 1%) a été utilisée
comme indicateur et la concentration en protéines a été déterminée en dosant l‘azote total
selon la méthode Kjeldahl T90-110 (Afnor 1975).
1.2.2- Isolement des bactéries lactiques :
La solution mère a été préparée en prélevant 1 ml (lait cru et « Lben ») ou 1 g
(« Jben ») de chaque échantillon qui a été ajouté à 9 ml d‘eau physiologique stérile. A partir
de cette solution mère, des dilutions sériées allant de 10-1 à 10-7 ont été effectuées pour le lait

44
cru et le « Lben » et à 10-10 pour le « Jben ». 0.1 ml a été étalé sur milieu Man-Rogosa-
Sharpe (MRS) agar (Biolife, Milan, Italie) additionné d‘acide sorbique (Panreac quimica SA,
Barcelona, Espagne) et M17 agar (Biolife, Milan, Italie) additionné d‘acide sorbique (Panreac
quimica SA, Barcelona, Espagne) (voir composition des milieux en annexe1) et incubés à
30°C en condition d‘aérobie pendant 48-72 heures. Les colonies ont été comptées pour
chaque dilution pour déterminer le nombre d‘UFC/ml pour le lait cru et le « Lben » et
d‘UFC/g pour le « Jben » en utilisant la formule suivante :
UFC/ml = nombre de colonies x 1/Ve x 1/D
Ve étant le volume d‘ensemencement et D étant la dilution prise en compte.
Neuf échantillons (sur les 15 provenants de Kénitra) n‘ayant montré aucune croissance
après 72 heures d‘incubation, ont été incubés à 28°C pendant 5, 7, 9 et 16 jours. Après chaque
période d‘incubation, 0.1 ml d‘une dilution au 1/10 a été étalé sur milieu Man-Rogosa- Sharpe
(MRS) agar (Biolife, Milan, Italie) additionné d‘acide sorbique.

2- Analyse préliminaire des isolats :

Les isolats purifiés ont été différenciés par la coloration de Gram, la recherche de la
catalase et de l‘oxydase.

2.1- Coloration de Gram

La coloration de Gram a été effectuée selon le protocole décrit par Prescott et al., 2003
(voir annexe 2).

2.2- Test de la catalase :

Cette activité a été réalisée selon le protocole expérimental décrit par Prescott et al.,
2003. Ce test consiste à mettre une colonie prélevée du milieu MRS gélosé à l‘aide d‘une anse
stérile dans de l‘eau oxygénée. Le dégagement de bulles de gaz signifie qu‘il y‘a production
de l‘enzyme catalase et que le test est positif.

2.3- Test d’oxydase :

L‘activité oxydase a été déterminée selon le protocole décrit par Kovacs et al., 1995.
Une colonie pure prise du milieu MRS gélosé est mise sur papier Watman imbibé de réactif
oxydase. Le développement d‘une couleur bleue signifie que le test est positif ce qui signifie
que l‘isolat possède l‘enzyme oxydase.

45
 Seuls les isolats Gram positif, catalase et oxydase négatives ont été considérés comme
étant des bactéries lactiques potentielles et ont été conservée à -80°C dans le MRS bouillon
(Biolife, Milan, Italie) à 20% de glycérol pour les études ultérieures.

II- Identification des isolats de bactéries lactiques :

1- Identification biochimique et phénotypique:

1.1- Identification biochimique :

Les bactéries Gram positives, catalase et oxydase négatives ont fait l‘objet d‘une
analyse biochimique par le système API bioMérieux en utilisant la galerie API 50CH avec
API 50 CHL medium (bioMerieux, Marcy l‘étoile, France).
L‘ensemencement et la lecture de la galerie ont été réalisés selon les instructions du
fabricant. Ils se font de la façon suivante:
- cultiver la souche pure sur milieu MRS gélosé 24h à 30°C,
- ouvrir une ampoule de Suspension medium (2 ml), prélever toutes les colonies de
la culture, à l‘aide d‘un écouvillon, et réaliser une suspension dense dans
l‘ampoule,
- ouvrir une ampoule de Suspension medium (5ml) et réaliser une opacité égale à 2
McFarland en transférant un certain nombre de gouttes de la première suspension,
noter ce nombre de gouttes (n),
- ouvrir une ampoule de API 50 CHL Medium et inoculer avec deux fois le nombre
de gouttes trouvées (2n), homogénéiser,
- répartir API 50 CHL ainsi inoculé dans les tubules, et recouvrir avec de l‘huile de
paraffine stérile,
- incuber à 30°C en aérobiose pendant 48h.
- tous les tests sont lus à 24h et 48h (on recherche dans chaque tubule l‘acidification
produite qui se traduit par le virage au jaune du pourpre bromocrésol contenu dans
le milieu. Pour le test esculine, on observe un virage du pourpre au noir),
- enregistrer les résultats obtenus,
- le profil biochimique ainsi obtenu peut être lu grâce à un logiciel d‘identification
APILAB (bioMérieux, Marcy l‘étoile, France).

46
 1.2- Identification moléculaire par la méthode d’electrophorése des protéines
totales de la cellule (SDS-PAGE):
Cette identification a été faite par la technique SDS-PAGE des protéines totales de la
cellule. La préparation des extraits de protéines, leur électrophorèse sur gel de Polyacrylamide
additionné de Sodium Dodecyl Sulfate et le traitement des profils obtenus par le logiciel
GelCompar II (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgium) ont été faits comme décrits par
Pot et al. (1994).
Les solutions et tampons utilisés pour effectuer la technique de SDS-PAGE sont listés
dans l‘annexe 3.
Le protocole suivi pour effectuer la technique de SDS-PAGE des protéines totales des
cellules est cité ci-après:

1.2.1- Préparation des protéines totales :

- cultiver les bactéries sur milieu MRS agar pendant 48h à 30°C,
- mettre les cellules en suspension dans 1 ml de NaPBs,
- centrifuger 5 min à 10 000 rpm, enlever le surnageant,
- ajouter 900 µl de STB-SDS,
- traiter les bactéries avec un appareil ultrason « Labsonic 2000 » (B Braun,
Melsungen AG, 3508, Germany, aiguille, 127 mm de longueur, 4 mm de diamétre) pendant 3
min,
- fermer l‘eppendorf et le mettre dans la glace,
- ajouter 100 µl de SDS 20%,
- vortexer,
- mettre à 95°C pendant 10 min,
- mettre dans la glace pendant au moins 20 min,
- centrifuger à 10 000 rpm pendant 8 min
- répartir le surnageant sur deux eppendorfs et conserver à +4°C pour une
utilisation immédiate, ou à – 80°C pour conservation.

1.2.2- Assemblage de la cassette (plaques de verre et le support) et

préparation des gels de concentration et de séparation:
- utiliser des plaques de verres bien nettoyées et sèches,
- mettre les espaceurs (petites lattes en plastiques) de chaque côté de la plaque
de verre, mettre une autre plaque de verre au dessus,

47
 - serrer à l‘aide des deux vices de serrage et monter sur le support de
polymérisation,
- couler entre les deux plaques de verre 28 ml de la solution du gel de
résolution à 12 % préparé comme suit :
H2O pure …………………………….13.4 ml
1.5 M Tris-HCl, pH 8.8……………….10 ml (tampon du gel de séparation)
Bis-Acrylamide ………………..……..16 ml
SDS 10% ………………………..…….0.4 ml
Laisser reposer à 19 °C pendant une minute, ajouter:
TEMED ……………………...…………20 µl
(NH4)S2O8 10% ……………..……..0.14 ml
- charger la surface de la solution du gel de résolution de 2 ml d‘une solution
d‘isobutanol saturé en eau pure,
- mettre la cassette dans un bain thermostaté à 25 °C pendant une heure
- rincer le gel avec l‘eau pure,
- couvrir le gel avec 1.6 ml du tampon du gel de séparation dilué au ¼,
- laisser le gel polymériser la nuit à 19 °C,
- rincer le gel avec l‘eau pure
- couler entre les deux plaques la solution du gel de concentration à 5%
préparée comme suit :
H2O pure ……………………..………..5.7 ml
0.5 M Tris-HCl, pH 6.8…………..…..10 ml (tampon du gel de concentration)
Bis-Acrylamide ………………………..1.7 ml
SDS 10% ……………………………….0.1 ml
Laisser reposer à 19 °C pendant une minute, ajouter:
TEMED …………………………………10 µl
(NH4)S2O8 10% ……………………....0.5 ml
- mettre le peigne pour former les puits,
- laisser polymériser dans un bain marie à 19 °C pendant une heure
- enlever le peigne.

1.2.3- L’électrophorèse :
- ajouter 10 µl de l‘échantillon dilué dans le tampon utilisé pour ajuster le
volume final des puits

48
 - fixer le réservoir du tampon d‘électrode supérieure à la cassette et le remplir
de tampon d‘électrode Tris-Glycine-SDS
- mettre le tout dans le réservoir de l‘électrode inférieure qui contient 4 litres
de tampon d‘électrode,
- laisser migrer pendant la nuit à 6 mA

1.2.4- Décoloration :
- sortir la cassette et la démonter,
- mettre le gel de résolution dans une solution aqueuse de 3% TCA pendant 15
min
- colorer les protéines pendant au moins 60 minutes dans une solution de bleu
de commassie,
- mettre le gel pendant quelques heures en agitant dans la solution décolorante,
- mettre le gel dans le dessiccateur et laisser sécher pendant 3 heures,
- scanner les profils obtenus à l‘aide du logiciel GelCompar II version 4.2
(Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgium).
- L‘identification des isolats a été faite en comparant leurs profils avec ceux
des souches de références existant dans la base de données disponible au BCCM/LMG
en utilisant le logiciel GelCompar II version 4.2 (Applied Maths, Sint-Martens-Latem,
Belgium).

2- Etude génotypique :

L‘étude génotypique a été effectuée en utilisant les techniques suivantes: la rep-PCR

avec l‘amorce (GTG)5 et le séquençage du gène codant pour l‘ARNt Phenylalanyl- synthase.

2.1- La réaction (GTG)5-PCR :

2.1.1- Extraction de l’ADN :
L‘extraction de l‘ADN a été faite suivant le protocole décrit par Gevers et al.,
2001.
Les solutions et tampons utilisés pour effectuer l‘extraction de l‘ADN sont
listés dans l‘annexe 4.

49
 a- Préparation des cellules :
- mettre en culture les souches pures dans 10 ml de MRS bouillon (laisser croître
jusqu‘à une DO600 comprise entre 0.4 et 1)
- centrifuger pendant 10 min à 5000 rpm et à 4°C,
- enlever le surnageant et garder le culot à -20°C pendant une heure au
minimum,

b- Rinçage :
- décongeler le culot,
- ajouter 1 ml de TES,
- centrifuger pendant 10 min à 5000 rpm et à 4°C,

c- Lyse des cellules :

- ajouter 300 µl de STET
- ajouter 75 µl d‘une solution de lysozyme-mutanolysine (3mg lysozyme, 20 µl
mutanolysine à 5000 U.ml-1 et 55 µl TES),
- incuber à 37°C pendant 60 min,
- ajouter 40 µl de SDS 20%,
- ajouter une pincée de billes de glace (Sigma ALDRICH, Steinheim,
Allemagne),
- Vortexer 60 sec,
- Incuber 10 min à 37 °C et 10 min à 65 °C successivement,

d- Purification de l’ADN :
- ajouter 10 µl de TE,
- ajouter 515 µl d‘un mélange phénol/chloroforme/alcool isoamylique
(Amresco, Ohio, USA). Le mélange doit être dans les proportions de 49/48/1,
- melanger soigneusement et centrifuger 5 min, 15 000 rpm à température
ambiante.

e- Précipitation de l’ADN :
- ajouter 70 µl de NaCl 5M et 1 ml d‘isopropanol (Merck, Darmstadt,
Allemagne),
- mettre dans la glace pendant 15 minutes au moins

50
 - centrifuger pendant 30 min à 14 000 rpm et à 4 °C

f- Rinçage et séchage de l’ADN :

- ajouter 500 µl d‘éthanol (Merck, Darmstadt, Allemagne) à 70%,
- centrifuger à 14 000 rpm pendant 5 min à température ambiante,
- enlever le surnageant et laisser sécher sous vide pendant 15 min

g- Resuspension de l’ADN :
- ajouter TE (50 à 100 µl, cela dépend de l‘importance du culot),
- ajouter 1 à 2 µl de ribonucléase (10 mg/ml),
- incuber 10 min à 37 °C,
- mettre à 4 °C pendant une nuit.

h- Vérification de la qualité de l’ADN :

- préparer un gel d‘agarose (Amresco, Ohio, USA) à 1%,
- charger 5 µl de l‘ADN à tester plus 1µl de tampon de charge (Promega, USA)
et laisser migrer dans du TAE à 100 V pendant 30 min.
- les bandes obtenues donnent une idée sur la qualité et la quantité de l‘ADN
extrait.

2.1.2- La réaction (GTG)5-PCR :

La (GTG)5-PCR a été réalisée suivant la méthode décrite par Gevers et al.,
2001. La séquence de l‘amorce utilisée est (5‘-GTGGTGGTGGTGGTG-3‘).
Les solutions et tampons utilisés pour réaliser la (GTG)5-PCR sont listés dans
l‘annexe 5.

2.1.2.1- Réaction et programme d’amplification :

La réaction d‘amplification est réalisée dans le mélange réactionnel suivant :

5X Gitschier buffer…………………….. 5 µl
BSA (10 mg/ml)…………………….…0.4 µl
DMSO 100% ……………………….…2.5 µl
Eau pure …………………………….13.45µl
dNTP (25 mM chacun)………….……1.25 µl

51
 (GTG)5 (0.3µg/µl)……………….……....1 µl
Taq Polymerase (5U/µl) .………….…..0.4 µl
ADN (50 ng.µl-1)………………………….1 µl

Les réactions d‘amplification ont été faites en utilisant le thermocycleur Gene AmpR
PCR System 2700 (Applied biosystems, USA) avec le programme suivant :

30 cycles
Dénaturation
initiale
Dénaturation

7 min à 95°C élongation élongation finale

1 min à 94°C
Amplification 8 min à 65°C 16 min à 65°C
1 min à 40°C maintien
4°C

2.1.3- Electrophorèse des produits de la réaction PCR :

Les produits de la réaction (GTG)5-PCR sont séparés par électrophorèse sur gel
d‘agarose à 1.5 % préparé comme suit :
- peser 2.25 g d‘agarose,
- ajouter 150 ml de TAE (1X)
- chauffer jusqu‘à dissolution complète de l‘agarose,
- refroidir à 55 °C et couler la solution dans un moule de 15 cm sur 20 cm
contenant un peigne,
- laisser polymériser pendant 30 min minimum,
Puis, on charge les puits du gel avec 8 µl des produits PCR + 1.6 µl du tampon
de charge (Promega, USA). Les puits situés au début, au milieu et à la fin du gel sont chargés
de 6µl de marqueur de poids moléculaire (200bp) (Promega, USA). L‘électrophorèse est
effectuée dans du TAE 1X à 47 V et 100 mA pendant 16h et à 4 °C.
Une fois l‘électrophorèse terminée, le gel est coloré dans un un litre d‘une
solution de TAE (1X) contenant 100 µl de bromure d‘éthidium à une concentration de
(1µg/ml) et décoloré dans une solution du TAE (1X) pendant 10 min.

52
 Les profils obtenus sont visualisés sous lumière Ultra-violette. Une photo du
gel est prise avec une Camera CCD 570 LTV (GEL SMART, France).

2.1.4- Le logiciel Gel Compar II :

Le logiciel Gel Compar II est mis au point par le Prof. Kesters de l‘Université
de Gand en Belgique. C‘est un logiciel de bioinformatique utilisé pour le traitement des
photos des gels d‘eléctrophorése et la création et la gestion des bases de données. Il a
plusieurs fonctionalités. Il permet de traiter les photos des gels (ajuster luminosité et
contraste), de les standardiser (par rapport à des marqueurs de poids moléculaires) et d‘obtenir
un dendrogramme qui montre les degrés de similitude entre les différentes souches étudiées et
les souches de référence.

2.1.5- Traitement des gels :

Les photos des gels obtenus sont analysées par le logiciel GelCompar II
(Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgium). Les similitudes entre les profils obtenus sont
calculées en utilisant le coefficient de corrélation « Pearson », le dendrogramme est obtenu en
utilisant une liaison moyenne UPMGA. La base de données des souches de références des
bactéries lactiques disponible aux CCMM / LMBM / CNRST est utilisée pour l‘identification
des souches étudiées.

2.1.6- Les souches de références utilisées dans (GTG)5-PCR :

Les souches de référence utilisées pour l‘identification des bactéries lactiques
isolées et étudiées par la (GTG)5-PCR sont de deux types :
Les souches incluses dans la base de données CCMM (http://www.ccmm.ma),
Les souches disponibles dans les Collections Coordonnées Belges de Micro-
organismes / Laboratoire de Microbiologie de Gand (BCCM/LMG)
(http://www.belspo.be/bccm/lmg.htm) et qui sont: Carno. maltaromicum (LMG 9839T) ; Ent.
durans (LMG 12283, LMG 12903, LMG 10746T); Ent. faecalis (LMG 7937T, LMG 7938);
Ent. faecium (LMG 8147); Lact. brevis (LMG 11434); Lact. plantarum (LMG 6907T, LMG
18021); Lact. rhamnosus (LMG 6400T); Lact. sake subsp. carnosus (LMG 17302T); L. lactis
subsp. lactis (LMG 9441, LMG 7930); L. lactis subsp. cremoris (LMG 6897T); Leuc.
mesenteroides subsp. cremoris (LMG 6909T); Leuc. mesenteroides subsp. dextranicum (LMG
6908T) ; Ped. Damnosus (LMG 11484T).

53
 2.2- Séquençage du gène ARNt phenylalanyl synthase (pheS) :
2.2.1- Extraction de l’ADN :
L‘extraction de l‘ADN a été faite comme décrit par Gevers et al., 2001
(protocole détaillé ci-dessus).
2.2.2- Amorces et réaction PCR :
Les séquences des amorces utilisées pour l‘amplification et le séquençage du
gène (pheS) sont les suivantes :
pheS-21-F 5‘-CAYCCNGCHCGYGAYATGC-3‘
pheS-22-R 5‘-CCWARVCCRAARGCAAARCC-3‘
pheS-23-R 5‘-GGRTGRACCATVCCNGCHCC-3‘
La réaction PCR a été faite dans le mélange réactionnel suivant :
eau pure stérile ……………………..33.5 µl
PCR buffer 10X ……………………5.0µl
dNTP (2 mM chacun)………….…...5.0 µl
pheS-21-F (50 µM)…………………0.5 µl
pheS-22-R (50µM) ………………….0.5µl
Taq Polymerase 1U/µl) .……………0.5 µl
ADN (0.01 µg.µl-1)………….………5.0 µl
Les réactions d‘amplification ont été faites en utilisant le thermocycleur Gene
AmpR PCR System 9600 (Applied biosystems, USA) avec le programme suivant :
- denaturation initiale : 5 min à 95 °C
- amplification : 3 cycles (1 min à 95°C + 2 min15s à 46 °C + 1 min15s à 72 °C)
30 cycles (3 s à 95°C + 1 min 15 s à 46 °C + 1 min 15s à 72 °C)
- Elongation finale : 7 min à 72 °C
La vérification des produits de la réaction PCR permet de définir les produits
positifs donnant une bande de la taille requise qui sont purifiés avec le Nucleofast 96 PCR
clean-up membrane system (Macherey-Nagel). A l‘aide des amorces pheS-21-F et pheS-23-R,
on prépare le mélange réactionnel pour le séquençage comme suit :
produit PCR purifié ………………………………. (1 µl)
API Prism BigDye Terminator cycle sequencing Ready Reaction Mix version
3.1 (Applied Biosystems) …………………………………….. (3µl)
les amorces de séquençage 4µM …………………. (3µl)
5X tampon de dilution ...………………………. (1.5 µl)
eau pure ... ……………………………………… (1.5 µl).

54
 Le programme d‘amplification utilisé est le suivant (30 cycles):

Dénaturation

Élongation
15 sec à 96°C Amplification 4 min à 60°C
1 sec à 35°C

Les produits de séquençage sont purifiés avec Montage SEQ96 sequencing

reaction clean-up kit (Millipore).
Les produits rincés sont récupérés dans 20 µl de la solution d‘injection et
mélangés avec 20 µl de formamide deionisé. La séparation des fragments d‘ADN est obtenue
avec ABI PRISM 3100 Genetic Analyser (Applied Biosystems). La durée et le voltage de
l‘injection des échantillons sont de 20s à 1.25 kV. Chaque cycle a été effectué à 50 °C pour
6500 s à 0.1 mA et 12.2 kV.
Les séquences obtenues ont été transférées au GenBuilder (Applied Maths) ou
on a déterminé les séquences consensus qui ont été importées dans BioNumerics 4.2 (Applied
Maths).
Les séquences du gène phenylalanyl-tRNA synthase (pheS) des souches B427,
B428, B430, B550, B540, B521, B412 et B415 ont été déposés à EMBL sous les numéros
suivants: AM491822, AM491823, AM491824, AM491825, AM491826, AM491827,
AM491828 et AM 491829, respectivement.

55
 Partie III
Résultats et discussion

56
I- Etude du lait cru d’origine marocaine:

1- composition physico-chimique des échantillons:

La composition physico-chimique des échantillons de lait cru est variable selon les
régions (voir tableau 1). Pour tous les échantillons de lait cru analysés, le pH se situe entre
6.56 et 6.8 avec une moyenne de 6.67. L‘acidité Dornic varie entre 11.71°D et 17.25°D et la
teneur en protéines se situe entre 28.5 g.l-1 et 37.8 g.l-1avec une moyenne de 34.15 g.l-1. Pour
le lait pasteurisé inclus dans cette étude comme contrôle, le pH est de 6.69, l‘acidité Dornic
est de 12.15 °D et la teneur en protéines est de 30 g.l-1. Les échantillons de lait cru incubés à
28 °C et analysés après 5, 7, 9 et 16 jours d‘incubation, montrent qu‘après 16 jours le pH
varie de 4.50 à 4.89 et l‘acidité Dornic de 74.25 °D à 93.25 °D avec une moyenne de 85.13°D.
Auldist et al., 1998 ont reporté que la composition physico-chimique du lait cru
dépend essentiellement du stade de lactation, la période de l‘année et le régime alimentaire
des vaches. Les échantillons analysés dans cette étude ont été prélevés durant le printemps
(Mars – Juin), alors que les vaches étaient presque au même stade de lactation, à partir de 4
régions du Maroc réputées pour leur forte contribution à la production laitière nationale. Les
variations légères de pH, d‘acidité dornic et de teneur en protéines observées entre les
différentes régions, surtout entre Tétouan et les autres régions, peuvent être liées au type
d‘alimentation donnée aux vaches.

2- dénombrement, isolement et identification des bactéries lactiques :

Les bactéries lactiques ont été dénombrées dans tous les échantillons de lait cru
étudiés. Leur nombre varie de 8.2 x 103 UFC/ml à 2.1 x 107 UFC/ml (voir tableau 1). Pour le
lait cru réincubé, les teneurs moyennes en bactéries lactiques sont de 4.2 x 1010 UFC/ml.
Comme déjà cité en introduction, le lait dans les cellules de la mamelle est stérile (Tolle
1980), mais il peut être contaminé à partir de diverses sources (glandes mammaires, peau de
la mamelle, moyens de traite, qualité de l‘air dans la ferme et les pratiques des éleveurs) ; ce
qui explique les différences de nombre des bactéries lactiques dans les différents échantillons
analysés entre les différentes fermes ou régions puisque le niveau et les conditions d‘hygiène
n‘étaient pas les mêmes chez tous les éleveurs.

57
 Tableau 1: Incidence des bactéries lactiques dans le lait cru marocain et le lait pasteurisé

*lait cru incubé Lait

Lait cru de la région de pasteurisé
El Jadida /
Rabat Mohammedia Kenitra Tétouan Kenitra Rabat
Nombre de fermes 3 2 5 5 7 -
Nb d’échantillons (nb d’isolats) 5 (20) 4 (9) 6 (22) 5 (8) 9 (42) 1 (6)
Valeurs de pH 6.63 to 6.8 6.7 to 6.75 6.61 to6.76 6.56 to 6.77 4.50 to 4.89 6.69
Acidité dornic °D 15.9 17.25 17.42 11.71 85.13 12.15
Teneur en protéines (g/l) 36.2 34.1 37.8 28.5 N.D. 30
Dénombrement cfu/ml 1.4x105 1.1x105 2.1x107 8.2x103 4.2x1010 2x102
Ent. durans (2) 2
Espèces identifiées (nombre d’isolats)

Ent. faecium (11) 1 2 1 7

Ent. gilvus (3) 3
Ent. hirae (3) 2 1
Lact. brevis (1) 1
Lact. paracasei (2) 1 1
Lact. plantarum (12) 1 1 6 4
Lact. rhamnosus (1) 1
L. garvieae (6) 2 4
L. lactis (19) 8 3 3 5
Leuc. citreum (1) 1
Leuc. kimchii (2) 2
Leuc. mesenteroides (15) 2 10 1 2
Leuc. pseudomesenteroides (18) 3 3 3 7 2
Ped. pentosaceus (1) 1
W. cibaria (6) 1 2 3
W. confusa (1) 1
W. paramesenteroides (1) 1
W. viridescens (2) 2

°D: degré Dornic (1°D correspond à 0.1 mg d‘acide lactique par litre)
ufc/ml: unité formant colonie par millilitre.
* : pH, °D et ufc/ml sont donnés après 16 jours d‘incubation à température ambiante (28°C)
N.D.: non déterminé

58
Ces résultats indiquent que la variabilité de la qualité globale du lait en conditions marocaines
est surtout déterminée par les critères hygiéniques, dont les déterminants sont avant tout au
niveau des pratiques de traite et d‘hygiène adoptées par les éleveurs.
Dans ce travail, nous nous sommes intéressés uniquement aux bactéries lactiques qui
présentent un intérêt appliqué. 59 isolats de bactéries lactiques ont été isolés à partir des
différents échantillons de lait cru, 42 de ceux du lait cru réincubé et 6 isolats du lait
pasteurisé, 107 isolats de bactéries lactiques au total. Le nombre important d‘isolats obtenus à
partir des 9 échantillons de lait réincubé peut s‘expliquer par l‘isolement des bactéries après
incubation pendant 5, 7, 9 et 16 jours.
Les 65 isolats provenant du lait cru et pasteurisé ont été identifiés par API 50CHL, les
résultats obtenus figurent sur le tableau 2. D‘après ces résultats, on remarque une grande
diversité d‘espèce, mais dans certains cas, on trouve des identifications imprécises ou des
profils inexistants dans la base de données API ; ce qui génère des profils inacceptables. Dans
ce cas on considère les isolats comme non identifiés. Ainsi, on a obtenu sur les 65 isolats
étudiés par API 50CHL, 22 Leuc. mesenteroides, 19 L. lactis, 7 Lact. plantarum, 6 Lact.
paracasei, 2 Lact. coprophilus, 1 Lact. acidophilus, 1 Lact. rhamnosus, 1 Carno. Piscicola,
1 Ped. spp et 5 isolats non identifiées (profils inacceptables).
Etant donné que le systéme API ne donne pas une identification précise, les 107 isolats
obtenus ont été tous étudiés par (GTG)5-PCR. Les photos de 3 gels d‘électrophorèse des
produits de (GTG)5-PCR sont présentées dans les figures 4, 6, et 8 (les photos des autres gels
sont présentées dans l‘annexe 5). Sur la figure 4, on trouve le gel sur lequel on a chargé les
isolats identifiés par API 50CHL comme étant des L. lactis avec deux souches de référence L.
lactis LMG 9441 et LMG 7930. La comparaison des profils à l‘œil nu montre que les isolats
B-421, B-426, B-429, B-434, B-438 et B-444 ont des profils qui se ressemblent entre eux et
avec les deux souches de référence surtout pour la partie située entre 400 bp et 1200 bp alors
que les isolats B-423, B-432, B-435 et B-436 génèrent des profils différents entre eux et
différents des autres isolats. L‘utilisation du logiciel bioinformatique Gel Compar II nous
permet de mieux évaluer les ressemblances entre les différents profils. Figure 5 montre le
dendrogramme obtenu après traitement de ce gel, on remarque qu‘effectivement les isolats B-
421, B-426, B-429, B-434, B-438 et B-444 forment un groupe avec plus de 80% de similitude
entre leurs profils et que les souches de référence sont incluses dans ce groupe, ce qui permet
de les identifier comme des L. lactis alors que les 3 souches B-423, B-432, B-435 et B-436
montrent des profils différents avec une ressemblance inférieure à 50% comparativement aux
autres profils.

59
Tableau 2 : Résultats des identifications par API 50CHL

Souches Identification API 50CHL % I.D.

B-408 Leuc. mes.mes/dext 99.9
B-409 Leuc. mes.mes/dext 99.9
B-410 Non identifié -
B-411 Leuc. mes.mes/dext 99.9
B-412 Leuc. mes.mes/dext 99.9
B-413 Leuc. mes.mes/dext 99.9
B-414 Leuc. mes.mes/dext 99.9
B-415 Carnobacterium piscicola 96.1
B-416 Leuc. mes.mes/dext 97.0
B-417 Leuc. mes.mes/dext 99.9
B-418 Leuc. mes.mes/dext 99.9
B-419 Leuc. mes.mes/dext 99.7
B-420 Lact. plantarum 98.8
B-421 L. lactis 88.1
B-422 Lact. rhamnosus 99.9
B-423 L. lactis 96.9
B-424 Leuc. mes.mes/dext 99.9
B-425 Leuc. mes.mes/dext 90.8
B-426 L. lactis 99.9
B-427 Non identifiée -
B-428 Non identifiée -
B-429 L. lactis 89.3
B-430 Non identifiée -
B-431 Lact. paracasei paracasei 98.5
B-432 L. lactis 80.2
B-433 Lact. plantarum 70.0
B-434 L. lactis 99.8
B-435 L. lactis 99.0
B-452 Leuc. mes.mes/dext 99.9
B-453 L. lactis 99.9
B-454 Leuc. mes.mes/dext 99.9
B-455 Lact. paracasei paracasei 99.9
B-456 Lact. plantarum 99.9
B-457 Lact. plantarum 99.9
B-458 Lact. plantarum 99.9
B-459 Leuc. mes.mes/dext 93.6
B-460 Lact. plantarum 99.9
B-461 Leuc. mes.mes/dext 96.1
B-462 L. lactis 99.9
B-463 L. lactis 89.0
B-464 L. lactis 80.0
B-465 Leuc. mes.mes/dext 99.9
B-466 L. lactis 99.9
B-467 L. lactis 99.9
B-468 Non identifiée -

60
 B-469 L. lactis 99.9
B-470 Leuc. mes.mes/dext 99.9
B-471 L. lactis 90.6
B-472 L. lactis 97.9
B-473 Lact. plantarum 99.9
B-474 L. lactis 99.9
B-475 Lact. paracasei paracasei 99.9
B-476 Lact. paracasei paracasei 99.9
B-477 L. lactis 99.9
B-478 Lact. paracaei paracasei 85.0
B-489 Leuc. mes.mes/dext 99.9
B-516 Leuc. mes.mes/dext 99.9
B-541 Ped. spp 80.0
B-542 Leuc. mes.mes/dext 99.9
B-543 Leuc. mes.mes/dext 90.0
B-544 Lact. coprophilus 70.0
B-546 Lact. coprophilus 78.0
B-547 Lact. paracaei paracasei 99.9
B-548 L. lactis 70.0
B-549 Lact. acidophilus 80.0

% I.D. le pourcentage d‘identification

61
 A B C D E F G H I J K L M N O

Figure 4 : Gel d’électrophorése des produits de la (GTG)5-PCR des isolats

identifiés par API 50CHL comme des L. lactis

A : 200 bp I : LMG 7930, L. lactis lactis

B : LMG 9441, L. lactis lactis J : B-434 L. lactis
C : B-421 L. lactis K : B-435 L. lactis
D : B-423 L. lactis L : B-436 L. lactis
E : B-426 L. lactis M : B-438 L. lactis
F : B-429 L. lactis N : B-444 L. lactis
G : B-432 L. lactis O : 200 bp
H : 200 bp

Pearson correlation (Opt:0.75%) [0.0%-100.0%]

gtg5 gtg5
100
20

40

60

80

. B-423
. .
. B-436
. .
. B-429
. .
. B-444
. .
. B-438
. .
. B-421
. .
. B-434
. .
. LMG-7930
.
. LMG-9441
.
. B-426
. .
. B-435
. .
. B-432
. .

Figure 5 : Dendrogramme et profils (GTG)5-PCR de bactéries lactiques chargées sur le gel

de la figure 4. Les souches avec numéro LMG sont des souches de référence provenant des
BCCM/ LMG Bacteria Collection.

62
 La figure 6 montre la photo d‘un 2ème gel d‘électrophorèse des produits de (GTG)5-
PCR des isolats identifiés par API 50CHL comme étant Leuc. mesenteroides, avec deux
souches de référence Leuc. mesenteroides dextranicum LMG 6908T et Leuc. mesenteroides
cremoris 6909T. Sur le gel on remarque que les deux isolats B-408 et B-409 présentent des
profils similaires, même chose pour les paires d‘isolats (B-417 et B-419), (B-424 et B-425) et
(B-442 et B-443). Les autres isolats présentent des profils différents entre eux et avec les
autres. Le traitement de ce gel par le logiciel Gel Compar II confirme les ressemblances
observées directement sur le gel (figure 7).
La figure 8 montre la photo du troisième gel, donné comme 3ème exemple de
résultats obtenus, sur lequel on a chargé des isolats avec des identifications variées obtenues
par API 50CHL, et des souches de référence Lact. plantarum, Lact. sakei et Lact. brevis. On
remarque qu‘on a des profils présentant des bandes différentes en nombre, disposition et
intensité. La comparaison à l‘œil nu s‘avère trop difficile. Le traitement de ce gel par Gel
Compar II nous a permis d‘obtenir le dendrogramme illustré dans la figure 9 où on trouve
qu‘effectivement les isolats montrent des profils très différents, et seul l‘isolat B-441 montre
une similitude de 90% avec la souche de référence Lact. plantarum, ce qui permet de
l‘identifier comme étant Lact. plantarum.
En effet, vu que le nombre de souches étudiées est élevé (107), et que la comparaison
des profils électrophorètiques directement sur le gel s‘avère trop compliquée, on a utilisé
l‘outil bioinformatique. Le logiciel Gel Compar II qui nous a permis d‘analyser avec précision
les différents gels obtenus, afin de mieux comparer leur profil avec ceux des souches de
référence incluses dans la base de données disponible aux CCMM/LMBM/CNRST. Cette
comparaison nous a permis d‘identifier 62 isolats organisés en 6 groupes et représentant 6
espèces. L‘attribution d‘un isolat à une espèce définie est basée sur son degré de similitude
avec les différentes souches de l‘espèce et la présence d‘une souche type et / ou de référence
représentant l‘espèce dans le groupe défini. Les 6 groupes identifiés (voir figure 10) ont été
attribués aux espèces suivantes : L. lactis (groupe I, 19 isolats), Leuc. mesenteroides (groupe
II, 14 isolats), Lact. plantarum (groupe III, 12 isolats), Ent. faecium (groupe IV, 10 isolats),
L. garvieae (groupe VI, 4 isolats) et Ent. durans (groupe V, 3 isolats). Sur les 107 isolats
étudiés, 45 isolats ont été groupés avec (GTG)5-PCR mais n‘ont pas été identifiés. Ils ont alors
été étudiés par SDS- PAGE des protéines totales de la cellule. Bien que cette technique soit
difficile à mettre au point, plusieurs études de taxonomie polyphasique ont montré, qu‘elle
permet après la comparaison des profils obtenus avec ceux des souches de référence et de
souches types d‘une base de données, une très bonne identification des isolats au niveau de

63
 A B C D E F G H I J K L M NO

Figure 6 : Gel d’électrophorèse des produits de la (GTG)5-PCR des isolats

identifiés par API 50CHL comme des Leuc. mesenteroides

A : 200 bp I : LMG 6909T Leuc. mes / cremoris

B : B-408 Leuc. mesenteroides J : B-419 Leuc. mesenteroides
C : B-409 Leuc. mesenteroides K : B-424 Leuc. mesenteroides
D : B-416 Leuc. mesenteroides L : B- 425 Leuc. mesenteroides
E : B-417 Leuc. mesenteroides M : B-442 Leuconostoc
F : B-418 Leuc. mesenteroides N : B-443 Leuconostoc
G : LMG 6908T Leuc. mes / dext O : 200 bp
H : 200 bp

Pearson correlation (Opt:0.75%) [0.0%-100.0%]

gtg5 gtg5
100
40

60

80

. . B-417
. .
. . B-419
. .
. . B-418
. .
. . B-408
. .
. . B-409
. .
. . B-416
. .
. . B-442
. .
. . B-443
. .
. LMG-6908T
. LMG-6909T
. . B-424
. .
. . B-425
. .

Figure 7 : Dendrogrammes et profils (GTG)5-PCR de bactéries lactiques chargées sur

le gel de la figure 6. Les souches avec numéro LMG sont des souches de référence provenant
des BCCM/ LMG Bacteria Collection.

64
 A BC D E F G H I J K L M N

Figure 8 : Gel d’électrophorèse des produits de la (GTG)5-PCR de 7 isolats

(identifiés différemment par API 50CHL)

A : 200 bp H: 200 bp
B: LMG 18021 Lact. plantarum I: LMG 11434 Lacto. brevis
C: B-410 non identifiée J: B- 433Lacto. brevis
D: B- 420 Lact. plantarum K: B-441 Lacto. plantarum
E: B-422 Leuc. mesenteroides L: B-449 Lacto. acidophilus
F: B- 431 Lacto. paracasei M: LMG 6907T Lacto. plantarum
G: LMG 17302 Lacto. sakei O: 200 bp

Pearson correlation (Opt:0.75%) [0.0%-100.0%]

gtg5 gtg5
100
20

40

60

80

.
B-410 .
.
LMG-11434
.
B-431 .
.
LMG-17302
.
LMG-18021
.
B-420 .
.
B-441
.
LMG-6907
.
B-422
.
B-433
.
B-449

Figure 9 : Dendrogrammes et profils (GTG)5-PCR de bactéries lactiques chargées sur

le gel de la figure 8. Les souches avec numéro LMG sont des souches de référence provenant
des BCCM/ LMG Bacteria Collection.

65
 Pearson correlation (Opt:0.75%) [0.0%-100.0%]
gtg5 gtg5

100
20

40

60

80

.
Lactococcus lactis .
B-423 .
.
Lactococcus lactis .
B-468 .
.
Lactococcus lactis .
LMG 6897T
.
Lactococcus lactis .
B-477 .
.
Lactococcus lactis .
B-466 .
.
Lactococcus lactis .
B-467 .
.
Lactococcus lactis .
B-495 .
.
Lactococcus lactis .
B-426 .
.
Lactococcus lactis .
B-469 .
.
Lactococcus lactis .
B-462 .
.
Lactococcus lactis .
B-474 . Groupe I : L. lactis
.
Lactococcus lactis .
B-502 .
.
Lactococcus lactis .
B-434 .
.
Lactococcus lactis .
LMG 7930
.
Lactococcus lactis .
B-421 .
.
Lactococcus lactis .
B-429 .
.
Lactococcus lactis .
LMG 9441
.
Lactococcus lactis .
B-410 .
.
Lactococcus lactis .
B-515 .
.
Lactococcus lactis .
B-525 .
.
Lactococcus lactis .
B-531 .
.
Lactococcus lactis .
B-453 .
.
Leuconostoc mesenteroides .
B-516 .
.
Leuconostoc mesenteroides .
LMG 6908T
.
Leuconostoc mesenteroides .
B-413
.
Leuconostoc mesenteroides .
B-507 .
.
Leuconostoc mesenteroides .
B-517 .
.
Leuconostoc mesenteroides .
B-422 .
.
Leuconostoc mesenteroides .
B-463 .
.
Leuconostoc
.
Leuconostoc
mesenteroides
mesenteroides
.
B-414
.
B-411
.
.
Groupe II : Leuc. mesenteroides
.
Leuconostoc mesenteroides .
B-418 .
.
Leuconostoc mesenteroides .
*B-338
.
Leuconostoc mesenteroides .
B-542
.
Leuconostoc mesenteroides .
B-417 .
.
Leuconostoc mesenteroides .
B-419 .
.
Leuconostoc mesenteroides .
B-408 .
.
Leuconostoc mesenteroides .
B-409 .
.
Lactobacillus plantarum .
B-493 .
.
Lactobacillus plantarum .
B-497 .
.
Lactobacillus plantarum .
B-503 .
.
Lactobacillus plantarum .
B-498 .
.
Lactobacillus plantarum .
B-500 .
.
Lactobacillus plantarum .
B-458 .
.
Lactobacillus plantarum .
B-473 .
.
Lactobacillus plantarum .
B-494 . Groupe III : Lact. plantarum
.
Lactobacillus plantarum .
LMG 6907T
.
Lactobacillus plantarum .
B-420 .
.
Lactobacillus plantarum .
B-457 .
.
Lactobacillus plantarum .
B-460 .
.
Lactobacillus plantarum .
B-456 .
.
Enterococcus faecium .
LMG 8147
.
Enterococcus faecium .
B-464
.
Enterococcus faecium .
B-471
.
Enterococcus faecium .
B-506 .
.
Enterococcus faecium .
B-527 .
.
Enterococcus
.
Enterococcus
faecium
faecium
.
B-513
.
B-478
.
.
Groupe IV : Ent. faecium
.
Enterococcus faecium .
B-519 .
.
Enterococcus faecium .
B-505 .
.
Enterococcus faecium .
B-518 .
.
Enterococcus faecium .
B-491 .
.
Enterococcus durans .
B-520 .
.
Enterococcus durans .
B-526 . Groupe V : Ent. durans
.
Enterococcus durans .
*B-318
.
Lactococcus garvieae .
B-435 .
.
Lactococcus
.
Lactococcus
garvieae
garvieae
.
*B-266
.
B-431 .
Groupe VI : L. garvieae
.
Lactococcus garvieae .
B-530 .

Figure 10: Dendrogrammes et profils (GTG)5-PCR de bactéries lactiques, isolées du

lait cru, incubé et pasteurisé, groupées et identifiées au niveau de l‘espèce par (GTG)5-PCR.
Les souches avec asterisk ou numéro LMG sont des souches de référence provenant
soit des CCMM ou BCCM/LMG Bacteria Collection respectivement.

66
de l‘espèce. La comparaison des profils obtenus dans cette étude avec ceux des souches de
référence disponibles dans la base de données construite à partir des études antérieures par les
auteurs suivants : Svec et al., 2006; Vancanneyt et al., 2006 et De Bruyne et al., 2007 nous a
permis d‘identifier 37 isolats (la figure 11 montre le dendrogramme et les profils protéiques
des souches représentatives de chaque espèce identifiée par SDS-PAGE) comme étant : Lact.
brevis (1 isolat), Lact. paracasei (2 isolats), L. garvieae (2 isolats), Leuc. citreum (1 isolat),
Leuc. pseudomesenteroides (18 isolats), Ent. faecium (1 isolat), Ent. hirae (3 isolats), Ped.
pentosaceus (1 isolat), W. cibaria (4 isolats), W. confusa (1 isolat), W. paramesenteroides (1
isolat) et W. viridescens (2 isolats).
Malgré l‘utilisation des deux techniques (GTG)5-PCR et SDS-PAGE, 8 isolats
demeurent non identifiés. En se basant sur les groupes obtenus par l‘analyse numérique des
profils protéiques, on a choisi 4 bactéries représentatives des 8 non identifiées ni par (GTG)5-
PCR ni par SDS-PAGE, elles ont fait l‘objet d‘un séquençage partiel du gène codant pour
l‘ARNt de phenylalanine synthase, pheS, ce gène est considéré comme l‘un des gènes de
ménage « house keeping genes » et sa variabilité est fonction de l‘espèce (Naser et al., 2005).
L‘analyse des résultats de séquençage a permis d‘identifier 3 isolats appartenants à l‘espèce
Ent. gilvus, 2 isolats appartenant à l‘espèce Leuc. kimchii, 2 isolats appartenant à l‘espèce W.
cibaria et un isolat appartenant à Lact. rhamnosus (Naser et al. 2005, 2007; De Bruyne et al.
2007 ; De Vuyst et Vancanneyt 2007).
Vu les résultats des différentes techniques et bases de données utilisées dans cette
étude, les 107 isolats étudiés ont été classés dans 5 espèces majeures: Ent. faecium, Lact.
plantarum, L. lactis, Leuc. mesenteroides et Leuc. pseudomesenteroides. Des espèces
représentées par 2 à 6 isolats ont été trouvées : Ent. durans, Ent. gilvus, Ent. hirae, L.
garvieae, Lact. paracasei, Leuc. kimchii, W. cibaria et W. viridescens. Les espèces Lact.
brevis, Lact. rhamnosus, Leuc. citreum, Ped. pentosaceus, W. confusa et W.
paramesenteroides sont représentées par un seul isolat (Tableau 1).
6 isolats appartenant à des espèces déjà existantes dans la base de données (GTG)5-
PCR (L. garvieae: 2; Ent. faecium: 1; Lact. brevis: 1; et Lact. paracasei: 2) n‘ont pas pu être
identifiés par (GTG)5-PCR mais par SDS-PAGE des profils protéiques. D‘une manière
similaire, 2 isolats appartenant à une espèce déjà existante dans la base de données des profils
protéiques (W. cibaria: 2) ont été identifiés par le séquençage partiel du gène phe S. dans les
deux cas, ces souches représentent de nouvelles variantes de ces espèces qui ne figurent pas
encore dans les bases de données, chose qui a souvent été reportée dans des études antérieures
(Zamfir et al., 2006 ; Scheirlinck et al., 2007).

67
 Pearson correlation (Opt:1.00%) [9.4%-60.8%]
SDS-PAGE SDS-PAGE

100
40

60

80
.
Weissella cibaria . B-501
.
Weissella cibaria . B-549
.
Weissella paramesenteroides . B-543
.
Weissella confusa . B-472
.
Lactobacillus brevis . B-524
.
Weissella viridescens . B-511
.
Enterococcus hirae . B-432
.
Enterococcus hirae . B-433
.
Enterococcus faecium . B-548
.
Lactococcus garvieae . B-514
.
Lactococcus garvieae . B-522
.
unidentified . *B-428
.
unidentified . *B-430
.
unidentified . *B-427
.
Lactobacillus paracasei . B-528
.
Pediococcus pentosaceus . B-541
.
Leuconostoc pseudomesenteroides . B-454
.
Leuconostoc pseudomesenteroides . B-470
.
Leuconostoc citreum . B-546
.
unidentified . *B-415
.
unidentified . *B-521
.
unidentified . B-523

Figure 11 : Dendrogramme basé sur l‘analyse numérique des profils protéiques des
souches représentatives de chaque groupe identifié après l‘analyse SDS-PAGE.
Les souches marquées avec asterisk sont les souches sélectionnées pour être étudiées
avec le séquençage partiel du gène ARNt phenylalanine synthase.

68
 Les deux espèces Ent. gilvus et Leuc. kimchii identifiées par le séquençage partiel du
gène pheS représentent des espèces de bactéries lactiques ne figurant pas encore sur les deux
bases de données de (GTG)5-PCR et profils des protéines.
La comparaison des identifications obtenues par API 50CHL avec celles obtenues par
(GTG)5-PCR, SDS-PAGE et séquençage du gène pheS montre que sur les 65 isolats identifiés
par API 50CHL, seuls 29 ont été confirmés par les méthodes moléculaires, ce qui représente
un pourcentage de 45%, alors que 55 % ont été mal identifiés (voir tableau 3), ce qui confirme
que les techniques phénotypiques ne permettent pas une identification fiable des isolats et que
l‘étude génotypique est indispensable pour leur identification.

3- Bactéries lactiques dans le lait cru:

La majorité des bactéries lactiques isolées dans cette étude appartiennent aux espèces
L. lactis, Leuc. pseudomesenteroides, Leuc. mesenteroides et Lact. plantarum (Tableau 1). Le
lait cru de trois régions sur les quatre examinées contient 7 espèces différentes de bactéries
lactiques. Les échantillons du lait cru de Rabat et Kenitra ont été dominés par une seule
espèce L. lactis et Leuc. mesenteroides, respectivement. Le lait cru d‘El- Jadida ⁄
Mohammedia et Tétouan ne présente pas d‘espèce dominante.
Leuc. kimchii a été isolé deux fois des échantillons de Kenitra. Ped. pentosaceus et
Leuc. citreum ont été isolés une seule fois des échantillons de Tétouan. Dans cette étude, on a
isolé des souches du genre Weissella, W. cibaria, W. confusa, W. paramesenteroides et W.
viridescens et des souches de quatre espèces différentes d‘ Enterococcus : Ent. durans, Ent.
faecium, Ent. gilvus et Ent. hirae.
Pour le lait cru incubé, 13 espèces ont été isolées, les plus fréquentes sont Ent.
faecium, Lact. plantarum, L. garvieae, L. lactis et Leuc. pseudomesenteroides
Cette étude montre que la biodiversité du lait cru marocain est caractérisée par les
groupes suivants : entérocoques, lactobacilles, lactocoques, leuconostocs et Weissella. Les
bactéries lactiques les plus fréquentes appartiennent aux espèces L. lactis, Leuc.
pseudomesenteroides, Leuc. mesenteroides et Lact. plantarum (Tableau 1). La variabilité de
l‘incidence des bactéries lactiques observée au niveau des fermes pourrait être due au mode
de traite des vaches qui est toujours traditionnelle chez ces fermiers. Pendant
l‘échantillonnage, tous les fermiers traitaient les vaches à la main. Ils différaient par leur
manière de préparer les équipements qu‘ils utilisaient pour la traite, le niveau d‘hygiène et les

69
 Tableau 3 : Comparaison des résultats des identifications par API 50CHL et
identification par (GTG)5-PCR, SDS-PAGE et pheS

Souches Résultat API 50CHL Identification par les méthodes

moléculaires
B-408 Leuc. mes.mes/dext Leuc. mes.mes/dext
B-409 Leuc. mes.mes/dext Leuc. mes.mes/dext
B-410 Non identifié L. lactis
B-411 Leuc. mes.mes/dext Leuc. mes.mes/dext
B-412 Leuc. mes.mes/dext Leuc. mes.mes/dext
B-413 Leuc. mes.mes/dext Leuc. mes.mes/dext
B-414 Leuc. mes.mes/dext Leuc. mes.mes/dext
B-415 Carnobacterium piscicola Leuc. kimchii
B-416 Leuc. mes.mes/dext Leuc. kimchii
B-417 Leuc. mes.mes/dext Leuc. mes.mes/dext
B-418 Leuc. mes.mes/dext Leuc. mes.mes/dext
B-419 Leuc. mes.mes/dext Leuc. mes.mes/dext
B-420 Lact. plantarum Lact. plantarum
B-421 L. lactis L. lactis
B-422 Lact. rhamnosus Leuc. mes.mes/dext
B-423 L. lactis L. lactis
B-424 Leuc. mes.mes/dext Leuc. pseudomesenteroides
B-425 Leuc. mes.mes/dext Leuc. pseudomesenteroides
B-426 L. lactis L. lactis
B-427 Non identifiée Ent. gilvus
B-428 Non identifiée Ent. gilvus
B-429 L. lactis L. lactis
B-430 Non identifiée Ent. gilvus
B-431 Lact. paracasei paracasei L. garvieae
B-432 L. lactis Ent. hirae
B-433 Lact. plantarum Ent. hirae
B-434 L. lactis L. lactis
B-435 L. lactis L. garvieae
B-452 Leuc. mes.mes/dext Leuc. pseudomesenteroides
B-453 L. lactis L. lactis
B-454 Leuc. mes.mes/dext Leuc. pseudomesenteroides
B-455 Lact. paracasei paracasei W. cibaria
B-456 Lact. plantarum Lact. plantarum
B-457 Lact. plantarum Lact. plantarum
B-458 Lact. plantarum Lact. plantarum
B-459 Leuc. mes.mes/dext Leuc. pseudomesenteroides
B-460 Lact. plantarum Lact. plantarum
B-461 Leuc. mes.mes/dext Leuc. pseudomesenteroides
B-462 L. lactis L. lactis
B-463 L. lactis Leuc. mesenteroides
B-464 L. lactis Ent. faecium

70
B-465 Leuc. mes.mes/dext Leuc. pseudomesenteroides
B-466 L. lactis L. lactis
B-467 L. lactis L. lactis
B-468 Non identifiée L. lactis
B-469 L. lactis L. lactis
B-470 Leuc. mes.mes/dext Leuc. pseudomesenteroides
B-471 L. lactis Ent. faecium
B-472 L. lactis W. confusa
B-473 Lact. plantarum Lact. plantarum
B-474 L. lactis L. lactis
B-475 Lact. paracasei paracasei Leuc. pseudomesenteroides
B-476 Lact. paracasei paracasei Leuc. pseudomesenteroides
B-477 L. lactis L. lactis
B-478 Lact. paracaei paracasei Ent. faecium
B-489 Leuc. mes.mes/dext Leuc. pseudomesenteroides
B-516 Leuc. mes.mes/dext Leuc. mesenteroides
B-541 Ped. spp Ped pentosaceus
B-542 Leuc. mes.mes/dext Leuc. mesenteroides
B-543 Leuc. mes.mes/dext W. paramesenteroides
B-544 Lact. coprophilus W. cibaria
B-546 Lact. coprophilus Leuc citreum
B-547 Lact. paracaei paracasei Lact. paracaei
B-548 L. lactis Ent. faecium
B-549 Lact. acidophilus W. cibaria

71
conditions de stockage du lait trait. L‘ensemble de ces facteurs influencent la qualité et la
quantité de la charge microbienne du lait comme reporté par Chye et al., 2004 et Lafarge et
al., 2004.
Pour le lait cru incubé, on a isolé des souches appartenant à 13 espèces différentes,
cette grande diversité est le résultat de l‘enrichissement de certaines bactéries durant la
période d‘incubation, aussi à des isolements répétés après des périodes d‘incubation de 5, 7, 9
et 16 jours à température ambiante ce qui n‘est pas le cas pour le lait cru non incubé.
La présence de Leuc. Kimchii dans le lait cru de Kenitra doit être vérifiée pour voir si
c‘est un élement naturel de la flore du lait cru ou juste un contaminant provenant de
l‘environnement puisque cette espèce a été isolée pour la première fois de « kimchi », un
produit végétal traditionnel Koréen (Kim et al., 2000) et n‘a jamais été reporté comme étant
un constituant de la flore microbienne des produits laitiers. La présence de cette espèce dans
le lait cru de Kenitra peut être expliquée par le fait que Kenitra soit une zone verte riche en
légumes ; ce qui peut être à l‘origine de la contamination du lait de cette région par cette
espèce.
Ped. pentosaceus et Leuc. citreum ont été isolés une seule fois. La présence de ces
deux espèces dans les produits laitiers n‘est pas commune comme a été reporté par Beukes et
al., 2001.
Des membres du genre Weissella ont été isolés à partir de végétaux frais, canne à
sucre, viande et échantillons cliniques d‘hommes et animaux (Bjorkroth et al., 2002). Mathara
et al., 2004 ont reporté que les espèces de Weissella ont été trouvées occasionnellement dans
le lait cru, mais leur rôle technologique dans la fermentation n‘a pas été reporté. Dans cette
étude, on a isolé 4 espèces de Weissella (W. cibaria, W. confusa, W. viridescens et W.
paramesentroides), c‘est la première fois qu‘on reporte leur présence dans le lait cru de vache
marocain et probablement ce sont des contaminants de l‘environnement.
La présence d'entérocoques dans le lait cru doit être abordée avec précaution, puisque
les souches de ce genre peuvent contenir des facteurs de virulence et des gènes de résistance
aux antibiotiques (Franz et al., 1999) ; ce qui a d‘ailleurs permis de les classer comme souches
nosocomiales. 4 espèces d‘ Enterococcus ont été isolées dans la présente étude. Néanmoins,
selon Giraffa, 2003, les entérocoques doivent être considérés comme faisant partie de la flore
microbienne normale du lait cru.
Pour cette étude, plusieurs autres isolats de bactéries lactiques ont été identifiés dans le
lait cru de vache d‘origine marocaine. Ces isolats représentent des espèces qui ont parfois été
associées à des infections humaines, surtout des endocardites dues à Lact. rhamnosus, W.

72
confusa et L. garvieae (Avlami et al., 2001; Flahetry et al., 2003; Martin et al., 2005 ; Vinh et
al., 2006). Pourtant, il n'existe actuellement aucune preuve pour considérer leur présence
véritablement problématique pour la santé publique. Il est donc nécessaire de vérifier si toutes
les espèces, isolées dans cette étude, sont une composante naturelle de la flore microbienne du
lait cru ou si elles sont des contaminants environnementaux.

73
II- Étude du « Jben » d’origine marocaine:

1- Dénombrement, isolement et identification des bactéries lactiques :

Le tableau 4 montre que les bactéries lactiques sont présentes dans tous les
échantillons de ―Jben‖ analysés à des dénombrements de 108 à 109 ufc/g. Cette observation
est en accord avec celle déjà décrite par Hamama, 1997 et Beresford, 2004.
164 isolats de bactéries lactiques ont été obtenus dans cette étude. Ils ont tous été étudiés
par (GTG)5-PCR en utilisant la base de données CCMM/LMBM/CNRST ; ce qui a permis
d‘identifier 31 isolats (voir figure 12) comme étant des Lact. plantarum (12 isolats, groupe I)
et L. lactis (19 isolats, groupe : II). Etant donné que la technique (GTG)5-PCR n‘a permis
d‘identifier que 31 isolats, tous les isolats ont été analysés à nouveau par électrophorèse des
protéines totales de la cellule sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) en utilisant la base de
données BCCM/LMG ; ce qui a permis d‘identifier 162 isolats comme étant Lact. plantarum
(36 isolats), Lact. rhamnosus (8 isolats), Lact. paracasei (8 isolats), Lact. brevis (5 isolats),
Lact. buchneri (1 isolat), L. lactis (42 isolats), L. garvieae (1 isolat), L. raffinolactis (1 isolat),
Leuc. pseudomesenteroides (22 isolats), Leuc. mesenteroides (17 isolats), Leuc. citreum (5
isolats), Ent. durans (9 isolats), Ent. faecalis (6 isolats), Ent. faecium (1 isolat), Streptocouus
sp. (2 isolats) et deux isolats sont restés non identifiés. Le nombre réduit d‘isolats identifiés
par (GTG)5-PCR est dû au faible nombre de souches de référence et aussi au nombre réduit
d‘isolats identifiés en 2005 que renferme la base de données des CCMM/LMBM/CNRST.
Les deux isolats non identifiés ont été étudiés par le séquençage complet du gène codant
pour la sous unité ARNr 16S, la détermination du contenu en G+C et l‘hybridation ADN-
ADN ; ce qui a montré qu‘il s‘agit d‘une nouvelle espèce Ent. saccharominimus (Vancanneyt
et al., 2004).

2- Bactéries lactiques dans le « Jben » marocain :

A Casablanca et à Rabat, un nombre important d‘échantillons nous a permis d‘isoler

plus de bactéries lactiques, 36 et 44 bactéries lactiques respectivement permettant aussi
d‘identifier un éventail plus large d‘espèces que dans les autres villes. Dans le cas où on a
prélevé qu‘un seul échantillon par ville, on a pu isoler au minimum 3 espèces différentes de
bactéries lactiques.

74
 Pearson correlation (Opt:0.75%) [0.0%-100.0%]
gtg5 gtg5

100
20

40

60

80
.
Lactobacillus plantarum B-223
.
.
Lactobacillus plantarum B-224
.
.
Lactobacillus plantarum B-233
.
.
Lactobacillus plantarum B-239
.
.
Lactobacillus plantarum B-238
.
.
Lactobacillus plantarum B-231
.
.
Lactobacillus plantarum LMG
. 18021
.
Lactobacillus plantarum B-225
. Groupe I : Lact. plantarum
.
Lactobacillus plantarum B-222
.
.
Lactobacillus plantarum B-236
.
.
Lactobacillus plantarum B-226
.
.
Lactobacillus plantarum LMG
. 6907T
.
Lactobacillus plantarum B-227
.
.
Lactobacillus plantarum B-234
.
.
Lactococcus lactis .
B-305
.
Lactococcus lactis .
LMG 7930
.
Lactococcus lactis .
B-308
.
Lactococcus lactis .
B-295
.
Lactococcus lactis .
B-299
.
Lactococcus lactis .
B-276
.
Lactococcus lactis .
B-297
.
Lactococcus lactis .
LMG 9441
.
Lactococcus lactis .
B-300
.
Lactococcus lactis .
B-302
.
Lactococcus lactis .
B-279 Groupe II : L. lactis
.
Lactococcus lactis .
B-285
.
Lactococcus lactis .
B-301
.
Lactococcus lactis .
B-306
.
Lactococcus lactis .
LMG 9441
.
Lactococcus lactis .
B-274
.
Lactococcus lactis .
B-270
.
Lactococcus lactis .
B-287
.
Lactococcus lactis .
B-277
.
Lactococcus lactis .
B-281
.
Lactococcus lactis .
B-288
.
Lactococcus lactis .
B-294

Figure 12: Dendrogrammes et profils (GTG)5-PCR de bactéries lactiques, isolées du

Jben, groupés et identifiées au niveau de l‘espèce par (GTG)5-PCR.
Les souches avec numéro LMG sont des souches de référence provenant des
BCCM/LMG Bacteria Collection respectivement.

75
 Les résultats des identifications des isolats de bactéries lactiques de cette étude sont
reportés sur le tableau 4.
Au niveau des genres, les bactéries lactiques dominantes dans le « Jben » marocain
sont Lactobacillus (34%), Lactococcus (22%), Leuconostoc (27%) et Enterococcus (11%).
A l‘exception du genre Enterococcus, des résultats similaires ont été reportés par
Perez et al., 2000.
Au niveau de l‘espèce, seule Leuc. pseudomesenteroides est présente dans tous les
échantillons examinés. L‘espèce Lact. plantarum est présente d‘une façon dominante dans
tous les échantillons examinés à l‘exception d‘un seul. Cette espèce contribue au
développement d‘arôme comme reporté par Albenzio et al ., 2001 ; Amarita et al., 2001 et à la
production d‘agents antimicrobiens qui jouent un rôle protecteur de « Jben » d‘après Yiu,
1985 et Somers et al., 2001. Ces deux espèces avec L. lactis et Leuc. mesenteroides
constituent la grande majorité des isolats (71%).
Dans une étude antérieure, il a été reporté que la microflore dominante du « Jben »
comprend les espèces L. lactis, Leuc. mesenteroides et Lact. casei (Hamama, 1997). La
différence avec notre résultat vient du fait que les auteurs de cette étude ont utilisé des
techniques biochimiques et physiologiques classiques pour l‘identification des isolats ; ce qui
est insuffisant pour une identification fiable des bactéries lactiques (Ouadghiri et al., 2005 ;
2009).
Les espèces de bactéries lactiques les moins abondantes sont Lact. paracasei et Lact.
brevis, chaque espèce a été isolée dans au moins trois échantillons. Les espèces Lact.
rhamnosus et Lact. buchneri sont aussi moins abondantes que les autres espèces citées ci-
dessus. La présence de Lact. rhamnosus soulève quelques soucis puisque dans certains
rapports cette espèce a été associée à des syndrômes cliniques comme endocardites selon
Harty et al., 1993. Les espèces L. garvieae et L. raffinolactis ont été isolées une seule fois,
c‘est aussi la première fois qu‘on décrit la présence de la nouvelle espèce Ent.
saccharominimus dans le « Jben » marocain (Vancanneyt et al., 2004).
Les Etapes non standardisées du processus de fabrication du ―Jben‖ donne un produit
de qualité hygiénique variable, ce qui peut être un vecteur de pathogènes responsables de
maladies graves liées aux aliments comme Listeria monocytogenes comme décrits par
Benkerroum et al., 2000. L‘acidification due à la présence des bactéries lactiques dans le
―Jben‖ ne prèviendrait pas le développement et la propagation de Listeria monocytogenes
(Benkerroum et al., 2000). Selon les résultats des études déjà faites par Hamama, 1997, les
pathogènes menaçant la santé humaine comme Salmonella spp., Yersinia enterocolitica et

76
Tableau 4 : Incidence des bactéries lactiques dans le « Jben » marocain
Région Agadir Casablanca Fès Marrakech Rabat Safi Sefrou Tétouan identification

Nb. 1 3 1 2 6 1 2 1
d’échantillons Nb
d’isolats
Nb. d’isolats 17 36 10 18 44 15 12 12 Espèce a Genre
ufc/gb 2x109 5x108 109 7.5x108 2x108 7x108 8.3x108 3x109 ((nb d’isolats)
%
2 6 12 6 2 4 4 36 Lact. palntarum
8 8 Lact. rhamnosus
2 2 1 1 8 Lact. paracasei Lactobacillus
2 1 2 5 Lact. brevis (56) 34%
1 1 Lact. buchneri
11 7 16 7 1 42 L. lactis Lactococcus
1 1 L. garvieae (44) 27%
1 1 L. raffinolactis
2 5 3 2 2 2 5 1 22 Leuc.
pseudomesenteroides Leuconostoc
3 4 6 1 2 1 17 Leuc. mesenteroides (44) 27%
1 3 1 5 Leuc. citreum
2 1 2 4 9 Ent. durans
1 4 1 6 Ent. faecalis
1 1 Ent. faecium Enterococcus
2 2 Ent. saccharominimus (16) 10%
2 2 Streptocouus sp. Streptococcus
(2) 1%

a
Toutes les souches ont été déposées dans les collections coordonnées marocaines de microorganismes (CCMM).
b
le ufc/g correspond à une moyenne de l‘ensemble des échantillons analysés de la région.

77
Listeria monocytogenes ont été détectés dans le « Jben » traditionnel à des fréquences
respectives de 10%, 4.1% et 18.1%. Jusqu‘à présent, la listériose n‘a pas été associée avec le
―Jben‖ au Maroc. Pourtant, l‘absence d‘études épidémiologiques concernant ce sujet dans le
pays peut expliquer le manque de données sur les cas de listériose selon Benkerroum et al.,
2000.
La présence des espèces Lact. plantarum, L. lactis, Leuc. pseudomesenteroides et
Leuc. mesenteroides dans le « Jben » offre la possibilité d‘utiliser cette gamme de
microorganismes comme inoculum (levain naturel).

78
III- Étude du « Lben » d’origine marocaine:

1- Composition physico-chimique des échantillons:

Les échantillons du lait fermenté écrémé ―Lben‖ montrent un pH variant de 4.25 à

4.57 avec une moyenne de 4.38 et une acidité dornic variant de 73.12 à 112.5 °D avec une
moyenne de 83.05 °D. La moyenne de la teneur en protéine est de 24.7 g.l-1 (Tableau 5).
Benkerroum et Tamime, 2004 ont reporté que la composition chimique du « Lben » dépend
de la qualité du lait cru utilisé et varie entre les différentes localités, régions et fermes.
Néanmoins, en dépit des variations dans la composition chimique du « Lben », certains
paramètres comme l‘acidité et la teneur en protéines et en lipides sont considérés comme de
bons indicateurs de sa qualité. Les dits paramètres doivent être inclus dans un intervalle bien
précis. Dans la présente étude, le pH et la teneur en protéines des échantillons analysés sont
en général en accord avec les précédantes études reportées par Tantaoui-Elaraki et El
Marrakchi , 1987.

Tableau 5: Incidence des bactéries lactiques dans le « Lben » marocain

“Lben” de

Rabat Kenitra
Nb de fermes 1 7
Nb d’échantillons (Nb d’isolats) 1 (16) 7 (23)
pH 4.50 4.25 to 4.57
°D 73.12 84.47
Teneur en protéines (g/l) 25.7 22 to 26.4
cfu/ml 4.9x109 6.4x1010
Lact. paracasei (1) 1
identifiées

Lact. plantarum (6) 4 2

espèces

L. lactis (16) 6 10
Les

Leuc. mesenteroides (2) 1 1

Leuc. pseudomesenteroides (14) 5 9

2- Dénombrement, isolement et identification des bactéries lactiques :

Les bactéries lactiques ont été dénombrées dans tous les échantillons de « Lben »
analysés, leur nombre dépasse 109 ufc/ml (Tableau 5).

79
 39 isolats de bactéries lactiques ont été isolés des échantillons de « Lben » (Tableau
5). Ces isolats ont été étudiés par (GTG)5-PCR. Les photos des gels d‘électrophorèse des
produits de (GTG)5-PCR sont présentées dans l‘annexe 3. Les profils obtenus ont été traités
par le logiciel Gel Compar II et comparés aux profils de la base de données disponible aux
CCMM/LMBM/CNRST. Cette comparaison nous a permis d‘identifier 23 isolats
représentant 3 espèces différentes (figure 12): L. lactis (groupe I, 16 isolats), Lact. plantarum
(cluster II, 6 isolats) et Leuc. mesenteroides (groupe III, 1 isolat). 16 isolats n‘ont pas pu être
identifiées par (GTG)5-PCR, et ont été étudiés par SDS-PAGE des protéines totales de la
cellule. La comparaison des profils obtenus dans cette étude avec ceux des souches de
référence disponibles dans la base de données des BCCM/LMG nous a permis d‘attribuer 6
isolats aux espèces suivantes : Lact. paracasei (1 isolat) et Leuc. pseudomesenteroides (5
isolats).
Après l‘utilisation des deux techniques (GTG)5-PCR et SDS-PAGE, 10 isolats restent
non identifiés. En se basant sur les groupes obtenus par l‘analyse numérique des profils
protéiques, on a choisi 2 souches représentatives des 10 isolats non identifiés par (GTG)5-
PCR et SDS-PAGE pour être étudiées par le séquençage partiel du gène codant pour l‘ARNt
phenylalanine synthase phe S et elles ont été identifiées comme étant Leuc.
pseudomesenteroides (9 isolats) et Leuc. mesenteroides (1 isolat).
Les techniques d‘identification utilisées nous ont permis de classer les isolats dans 3
espèces majeures: L. lactis, Leuc. pseudomesenteroides et Lact. plantarum. Les espèces Lact.
paracasei et Leuc. mesenteroides sont représentées respectivement par 1 et 2 isolats (Tableau
5).
Comme pour le lait cru, un isolat appartenant à une espèce déjà existante dans la base
de données (GTG)5-PCR (Lact. paracasei: 1) n‘a pas pu être identifié par (GTG)5-PCR mais
par SDS-PAGE des profils protéiques. Aussi, 10 isolats appartenant à deux espèces déjà
existantes dans la base de données des profils protéiques (Leuc. pseudomesenteroides: 9 et
Leuc. mesenteroides: 1) ont été identifiés par le séquençage partiel du gène phe S. dans les
deux cas, ces souches représentent de nouvelles variantes de ces espèces qui ne figurent pas
encore dans les bases de données disponibles au CCMM/LMBM/CNRST et BCCM/LMG.

80
 Pearson correlation (Opt:0.75%) [0.0%-100.0%]
gtg5 gtg5

100
50
.
Lactococcus lactis .
B-436 .
.
Lactococcus lactis .
LMG 6897T
.
Lactococcus lactis .
B-539 .
.
Lactococcus lactis .
B-545 .
.
Lactococcus lactis .
B-480 .
.
Lactococcus lactis .
B-445 .
.
Lactococcus lactis .
B-537 .
.
Lactococcus lactis .
LMG 7930
.
Lactococcus lactis .
B-438 .
.
Lactococcus lactis .
B-444 . Groupe I : L. lactis
.
Lactococcus lactis .
LMG 9441
.
Lactococcus lactis .
B-481 .
.
Lactococcus lactis .
B-488 .
.
Lactococcus lactis .
B-440 .
.
Lactococcus lactis .
B-484 .
.
Lactococcus lactis .
B-486 .
.
Lactococcus lactis .
B-483 .
.
Lactococcus lactis .
B-487 .
.
Lactococcus lactis .
B-439 .
.
Leuconostoc mesenteroides .
LMG 6908T
.
Leuconostoc mesenteroides .
B-538 Groupe II : Leuc. mesenteroides
.
Lactobacillus plantarum .
B-534 .
.
Lactobacillus plantarum B-443
.
Lactobacillus plantarum .
B-479 .
.
Lactobacillus plantarum B-442 Groupe III : Lact. plantarum
.
Lactobacillus plantarum .
LMG 6907T
.
Lactobacillus plantarum .
B-441 .
.
Lactobacillus plantarum .
B-449 .

Figure 13: Dendrogrammes et profils (GTG)5-PCR de bactéries lactiques, isolées du

« Lben », groupées et identifiées au niveau de l‘espèce par (GTG)5-PCR.
Les souches avec un numéro LMG sont des souches de référence provenant des
BCCM/ LMG Bacteria Collection

81
 3- Bactéries lactiques dans le « Lben »:

Le ―Lben‖ est typiquement dominé par les espèces L. lactis (16 sur 39 isolats ; 41%),
Leuc. pseudomesenteroides (14 sur 39 isolats ; 36%) et Lact. plantarum (6 sur 39 isolats ;
15% ). Leuc. mesenteroides a été trouvé moins fréquemment (5%).
Les espèces isolées du ―Lben‖ sont L. lactis, Leuc. pseudomesenteroides, Lact.
plantarum et Leuc. mesenteroides. La présence de souches appartenant au genre Leuconostoc
peut être liée à une contamination post-préparation, puisque Mathara et al., 2004 ont reporté
que les souches de Leuconostoc ont des exigences nutritionnelles complexes et sont peu
compétitives durant la fermentation du lait. Les souches d‘Enterococcus n‘ont pas été isolées
du ―Lben‖.
A l‘exception de ce genre espèce, les bactéries lactiques dominantes dans le ―Lben‖
marocain sont les mêmes que celles décrites dans le lait fermenté et les produits laitiers de
l‘Afrique du Sud, Kenya et Romania (Beukes et al., 2001; Mathara et al., 2004; Zamfir et al.,
2006). L‘absence des entérocoques peut être liée à la présence de souches productrices de
bactériocine (Benkerroum et al., 2000) bien que cette caractéristique n‘a pas été vérifiée dans
cette étude.
La présence de lactobacilles dans le « Jben » et leur faible présence dans le « Lben »,
en dépit du fait que les deux produits sont fermentés de la même façon et en utilisant les
mêmes matières premières, peut être expliqué par le retard de croissance des lactobacilles
sous conditions mésophiles
Dans une étude antérieure faite par Tantaoui-Elaraki et al., (1983a,b), il a été démontré
que les bactéries lactiques mésophiles dominées par L. lactis et Leuc. mesenteroides sont les
espèces responsables de la fermentation et le développement de l‘arôme dans le « Lben ». La
présence d‘un nombre limité d‘espèces de bactéries lactiques dans le « Lben » peut être
expliquée par le processus de fermentation qui génére une importante baisse de l‘acidité
inhibant ainsi le développement de nombreuses espèces comme reporté par Wouters et al.,
2002.

82
 Partie IV
Conclusions et perspectives

83
 Conclusions

Cette étude nous a permis d‘avoir une idée sur la composition de la flore
microbiologique en bactéries lactiques du lait cru marocain et ses deux dérivés « Jben » et
« Lben ». Ces produits montrent une très grande diversité d‘espèces qui dépend des régions et
des fermes. Au total 24 espèces ont été identifiées avec des incidences différentes. La
comparaison des résultats obtenus dans ce travail avec ceux des autres travaux sur des
produits similaires, mais dans d‘autres pays, permet de conclure que le Maroc dispose d‘une
biodiversité riche et particulière, et que ses produits laitiers traditionnels peuvent être une
source précieuse de souches avec des propriétés technologiques intéressantes. Les profils
obtenus par (GTG)5-PCR montrent que la grande majorité des souches isolées sont différentes
et qu‘il n‘y a pas de relation de clonalité entre elles, ce qui signifie qu‘on dispose d‘un
ensemble de souches avec des propriétés potentielles différentes.
Grâce au statut « GRAS » «Generally Regarded As Safe» attribuée aux bactéries
lactiques suite à leur utilisation pendant des années sans qu‘elles ne présentent aucun risque
pour la santé, sauf dans certains cas ou le patient avait des antécédents de maladie sous-
jacente et devrait être considéré comme immunodéprimé, on peut considérer la collection de
bactéries lactiques isolée dans ce travail comme un réservoir national de bactéries a grande
valeur nutritionnelle, biotechnologique et probiotique.
L‘identification des souches isolées dans cette étude a nécessité l‘utilisation de
plusieurs techniques phénotypique et génotypique. La comparaison des résultats des deux
types de techniques a montré que les méthodes phénotypiques ne donnent pas une
identification fiable et sûre, et que les techniques génotypiques sont indispensables pour une
meilleure identification mais là aussi, chacune d‘elles a un pouvoir discriminatoire spécifique.
L‘utilisation de méthodes de typage moléculaire, que ce soit phénotypique ou génotypique,
nécessite l‘utilisation d‘un grand nombre de souches de référence et une très grande base de
données qui doit inclure des représentants de toutes les espèces et le maximum de variantes de
chaque espèce.

84
 Perspectives

Pour compléter ce travail sur la flore microbienne du lait cru et ses dérivés, nous
proposons :
Sur le plan technique
L‘utilisation des techniques moléculaires non culture dépendante comme la
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) pour détecter même les bactéries non
cultivables.
La généralisation du séquençage du gène codant pour l‘ARNt de la phenylalanine
synthase pour bien caractériser le maximum de souches et pour pouvoir les comparer.

Sur le plan technologique

1) Les souches de bactéries lactiques isolées peuvent faire l‘objet:
- d‘une recherche de certaines propriétés biotechnologiques appréciées par le
consommateur,
- d‘une recherche de souches probiotiques et d‘un criblage de souches qui
produisent les bactériocines,
- d‘une étude de leur résistance aux antibiotiques.

2) les compétences acquises dans ce domaine peuvent être utilisées pour étudier la
biodiversité des bactéries lactiques du lait cru d‘autres espéces animales (chévre, chamelle) et
leurs dérivés traditionnels consommés au Maroc.

85
 Références
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104
Annexes

105
 Annexe 1
Composition des milieux:
Man Rogosa Sharp Agar (Merck 10660)
Peptone..................................................10 g
Extrait de viande......................................5 g
Extrait de levure......................................5 g
Glucose..................................................20 g
Tween 80...............................................1 ml
Diammonium hydrogen citrate................2 g
Acetate de Sodium...................................5 g
MgSO4.7H2O.......................................0,2 g
MnSO4.H2O.......................................38 mg
K2HPO4..................................................2 g
Agar.......................................................12 g
Eau distillée QSP.....................................1 L
pH............................................................6,5

M17
- Tryptone........................................................2,50 g
- Peptone pepsique de viande .........................2,50 g
- Peptone papaïnique de soja ..........................5,00 g
- Extrait autolytique de levure.........................2,50 g
- Extrait de viande ...........................................5,00 g
- Lactose ..........................................................5,00 g
- Glycérophosphate de sodium ......................19,00 g
- Sulfate de magnésium ...................................0,25 g
- Acide ascorbique ...........................................0,50 g
- Agar bactériologique....................................15,00 g
pH du milieu prêt à l‘emploi à 25°C : 7,1 ± 0,2.

106
 Annexe 2
Coloration de Gram :

1- Déposer une goutte d‘eau physiologique stérile sur une lame bien propre
2- Prélever un échantillon de colonie et mélanger avec la goutte d‘eau, strier et sécher
par passage rapide sur la flamme d‘un bec benzène
3- Couvrir le frottis par du cristal violet pendant 60 secondes
4- Laver l‘excès du colorant avec de l‘eau distillée
5- Couvrir de lugol pendant 30 secondes
6- Laver à l‘eau distillée pendant 5 secondes
7- Rincer immédiatement le frottis avec le mélange alcool - acétone en inclinant la
lame et par goutte à goutte jusqu‘à disparition complète de la coloration violette
8- Laver à l‘eau distillée pendant 5 secondes
9- Couvrir avec de la fuschine pendant 15 secondes
10- Laver à l‘eau distillée pendant 10 secondes
11- Déposer une goutte d‘huile à immersion sur le frottis et observer au microscope à
un fort grossissement.
Les cellules Gram+ absorbent la couleur du cristal violet et demeurent bleues violettes en
apparence, contrairement aux cellules Gram- qui apparaissent distinctement rosâtres.

107
 Annexe 3
Les tampons et solutions utilisés pour SDS-PAGE

Tampon NaPBS (solution saline tamponnée avec du phosphate de sodium) :

0.2 M Na2HPO4 40.5 ml
0.2 M NH2PO4.2H2O 9.5 ml
NaCl 8g
H2O qsp 1000 ml
pH 7.3 (ajuster avec HCl à 1.72N)
Conserver à 4°C.

Tampon de traitement des échantillons sans SDS (tampon STB)

Tris 0.75 g
Mercaptoéthanol 5.0 ml
Saccharose 5.0 g
H2O qsp 1000 ml
Conserver à -18°C.

Solution SDS 20% :

20 g de Sodiumdodécylsulfate / 100 ml d‘eau pure

Bleu de bromophénol 0.001% :

Solution stock : 10 mg / 100 ml de tampon STB + 2% SDS
Faire une dilution 1/10 dans le tampon STB + 2% SDS

Tampon d’électrode du réservoir anionique (tampon tris-glycine) :

Tris 12 g
Glycine 57.5 g
SDS 4.0 g
H2O qsp 4000 ml
pH 8.6 à 19 °C
Conserver à température ambiante

108
 Tampon d’électrode du réservoir cathodique (tampon tris-glycine) :
Tris 1.5 g
Glycine 7.2 g
SDS 10% 5.0 ml
H2O qsp 500 ml
pH 8.6 à 19 °C
Conserver à température ambiante

Solution pour la dénaturation des protéines :

3 g de l‘acide trichloroacétique (TCA) / 100 ml d‘eau distillée
Conserver à température ambiante

Solution colorante:
Solution colorante; stock 2%
Serva blue R (bleu de commassie) 10 g
H2O qsp 500 ml
Solution colorante :
Solution colorante stock 125 ml
Méthanol 500 ml
Acide acétique 100 ml
H2O qsp 1000 ml
Conserver à température ambiante

Solution décolorante :
Ethylène glycol 60 ml
Méthanol 500 ml
Acide acétique 200 ml
H2O qsp 2000 ml
Conserver à température ambiante

Tampon pour ajuster le volume final dans les puits :

0.8 ml du tampon de traitement des échantillons (STB) additionné de 0.1 ml
SDS 20% et de 0.1 ml de bleu de bromophénol 0.001%.
Conserver à -20°C.

109
 Annexe 4
Les tampons et solutions nécessaires à l’extraction d’ADN

TES (pH 8.0)

50 mM tris-base
1 mM EDTA
6.7% saccharose
Filtrer et conserver à température ambiante

STET (pH 8.0)

50 mM Tris-base
50 mM EDTA
8% saccharose
5% Triton-X-100
Filtrer et conserver à température ambiante

Tampon TE :
1mM EDTA
10 mM Tris-Hcl
Autoclaver et conserver à 4 °C

EDTA (0.5 M ; pH 8.0) :

Dissoudre 93.06 g EDTA dans 400 ml d‘eau pure, ajouter 15-20 g NaOH pour
avoir un pH 8.0 et ajuster avec l‘eau pure à 500 ml.
Autoclaver, réajuster le niveau avec eau pure stérile et conserver à 4 °C

Tris-HCL :
Dissoudre 31.5 g de tris dans 180 ml d‘eau pure, ajouter HCL concentré pour
avoir un pH de 8.0 et ajuster le volume à 200 ml avec l‘eau pure.
Autoclaver, réajuster le niveau avec l‘eau pure stérile et conserver à 4 °C

SDS 20% dans TE :

10 g SDS

110
 40 ml de tampon TE (10 mM, pH 8.0)

Lysozyme (Amresco, Ohio, USA) :

Pour chaque échantillon, dissoudre 5 mg de lysozyme dans 150 µl de TE.

Mutanolysine (Sigma ALDRICH, Steinheim, Allemagne):

Dissoudre dans de l‘eau pure à une concentration de 5000 U.ml-1

Ribonucléase (Sigma ALDRICH, Steinheim, Allemagne):

Dissoudre dans de l‘eau pure à une concentration de 10 mg.ml-1

NaCl 5M :
Dissoudre 29.22 g dans 100 ml d‘eau pure.

50X TAE :
242 g Tris-base
57.1 ml acide acétique glacial
18.61 g Na2 EDTA
Autoclaver, réajuster le niveau avec de l‘eau pure et conserver à 4 °C

111
 Annexe 5
Les solutions nécessaires pour la réaction (GTG)5-PCR

5X Gitschier buffer ( pour 200 ml):

(NH4)SO4 (1 M) 16.6 ml
Tris (1 M; pH 8.8) 67 ml
MgCl2 (1 M) 6.7 ml
EDTA (0.5 M; pH 8.8) dilué au 1/100 1.3 ml
ß-mercapto-ethanol (14.4 M) 2.08 ml

dNTP ultra pure (Promega, USA):

100 mM dATP, dCTP, dGTP, dDTP (Promega, USA):
Les solutions 100 mM de chaque désoxyribonucléotide sont mélangées à
volumes égaux pour avoir une solution de 25 mM chacun.

L’amorce (GTG)5 :
A la concentration de 0.3µg/µl

T aq polymerase (Promega, USA)

500 U (5U/µl)

112
 Annexe 6
Les gels d’eléctrophorése des produits de PCR en utilisant (GTG)5
comme amorce
A B C D E F G H I J K L

Gel 4 : Gel d’électrophorése des produits de la (GTG)5-PCR des isolats de

bactéries lactiques obtenues dans cette étude

A: 200 bp
B: B- 427
C: B- 428
D: B- 430
E: LMG 7930 Lactococcus lactis
F: 200 bp
G: B-433
H: B-440
I: B-445
J: B- 447
K: LMG 9441 Lactococcus lactis
L: 200 bp

113
 A B C D E F G H I J K L M N

Gel 5: Gel d’électrophorése des produits de la (GTG)5-PCR des isolats de bactéries

lactiques obtenues dans cette étude

A: 200 bp
B: B- 433
C: B- 456
D: B- 463
E: B-475
F: LMG 6907T Lact. plantarum
G: 200 bp
H: B-476
I: LMG 6907T Lact. plantarum
J: B- 477
K: B-478
L: B-488
M: LMG 13087T Lact. plantarum
N: 200 bp

114
 A B C D E F G H I J K L M N O

Gel 6: Gel d’électrophorése des produits de la (GTG)5-PCR des isolats de bactéries

lactiques obtenues dans cette étude

A: 200 bp
B: B- 411
C: B- 415
D: B- 416
E: B- 469
F: B- 450
G : LMG 6908T Leuc. mesenteroides dextranicum
H: 200 bp
I: B-451
J: B-456
K: B- 465
L: B-466
M: LMG 6909T Leuc. mesenteroides cremoris
N: LMG 8894T Leuc. lactis
O: 200 bp

115
 A B C D E F G H I J K L M N O

Gel 7: Gel d’électrophorése des produits de la (GTG)5-PCR des isolats de bactéries

lactiques obtenues dans cette étude

A: 200 bp
B: LMG 9198T Lact. curvatus curvatus
C: LMG 7942T Lact. delbrueckii lactis
D: LMG 6902T Lact. fermentum
E: B- 484
F: LMG 13087T Lact. paracasei paracasei
G: B-453
H : 200 bp
I: LMG 9433T Lact. acidophilus
J: B- 449
K: LMG 6907T Lact. plantrum
L: B-467
M: B-461
N: B-460
O: 200 bp

116
 A B C D E F G H I J K L M N O

Gel 8 : Gel d’électrophorése des produits de la (GTG)5-PCR des isolats de bactéries

lactiques obtenues dans cette étude

A: 200 bp
B: LMG 6890T L. lactis lactis
C: B-432
D: B-439
E: B-454
F: B-468
G: B-483
H : 200 bp
I: LMG 13095T L. raffinolactis
J: B-474
K: B-486
L: B-444
M: B-453
N: LMG 6897T L. lactis cremoris
O: 200 bp

117
 A B C D E F G H I J K L M N

Gel 9 : Gel d’électrophorése des produits de la (GTG)5-PCR des isolats de bactéries

lactiques obtenues dans cette étude

A: 200 bp
B: LMG 6908T Leuc. mesenteroides dextranicum
C: B-414
D: B-448
E: LMG 6893T Leuc. mesenteroides mesenteroides
F: LMG 8894T Leuc. lactis
G: LMG 6909T Leuc. mesenteroides cremoris
H : 200 bp
I: B-472
J: LMG 6890T L. lactis lactis
K: B-428
L: LMG 6907T Lact. plantarum
M: LMG 7937T Ent. facieum
N: 200 bp

118
 A B C D E FG H I J K L M N

Gel 10 : Gel d’électrophorése des produits de la (GTG)5-PCR des isolats de bactéries

lactiques obtenues dans cette étude

A: 200 bp
B: LMG 6907T Lact. plantarum
C: B-479
D: LMG 6890T L. lactis lactis
E: B-483
F : B-468
G: LMG 6897T Leuc. lactis cremoris
H : 200 bp
I: LMG 9839T Carno. maltaromicum
J: B-415
K: LMG 11484T Ped. damnosus
L: B-462
M: LMG 6890T L. lactis lactis
N: 200 bp

119
 A B C D E F G H I J K L M NO

Gel 11: Gel d’électrophorése des produits de la (GTG)5-PCR des isolats de bactéries
lactiques obtenues dans cette étude

A : 200 bp
B : B-412
C : B-457
D : LMG 6909T Leuc. mesenteroides
E : LMG 6908T Leuc. mesenteroides
F : LMG 6893T Leuc. mesenteroides mesenteroides
G : 200 bp
H : B-432
I : B-439
J : LMG 6890T L. lactis lactis
K : LMG 13095T L. raffinolactis
L : B- 479
M : LMG 6907T Lact. plantarum
N : 200 bp

120
 A B C D E F G H I J K L M N

Gel 12: Gel d’électrophorése des produits de la (GTG)5-PCR des isolats de bactéries
lactiques obtenues dans cette étude

A : 200 bp
B : B-427
C : B-430
D : LMG 6400T Lact. rhamnosus
E : LMG 6412T Lact. delbrueckii
F : LMG 6907T Lact. plantarum
G : 200 bp
H : B-480
I : B- 483
J : LMG 6908T Leuc. mesenteroides
K : LMG 9839T Carno. maltaromicum
L : LMG 6413T Lact. helveticus
M : LMG 6897T Leuc. lactis cremoris
N : 200 bp

121
 A B C D E F G H I J K L M N O

Gel 13 : Gel d’électrophorése des produits de la (GTG)5-PCR des isolats de bactéries

lactiques obtenues dans cette étude

A : 200 bp
B : LMG 6907T Lact. plantarum
C : B-479
D : B-493
E : B-494
F : B-498
G : LMG 18021T Lact. plantarum
H : 200 bp
I : LMG 18021T Lact. plantarum
J : B-534
K : B-503
L : B- 481
M : B-500
N : LMG 6907T Lact. plantarum
O : 200 bp

122
 A B C D E F G H I J K L M N O

Gel 14 : Gel d’électrophorése des produits de la (GTG)5-PCR des isolats de bactéries

lactiques obtenues dans cette étude

A : 200 bp
B : LMG 6908T Leuc. mesenteroides
C : B-489
D : B-490
E : B-507
F : B-510
G : B-516
H : LMG 6893T Leuc. mesenteroides mesenteroides
I : 200 bp
J : LMG 6909T Leuc. mesenteroides
K : B-517
L : B- 529
M : B-532
N : LMG 8894 Leuc. lactis
O : 200 bp

123
 A B C D E F G H I J K L M N O

Gel 15 : Gel d’électrophorése des produits de la (GTG)5-PCR des isolats de bactéries

lactiques obtenues dans cette étude

A : 200 bp
B : LMG 8894 Leuc. lactis
C : B-535
D : LMG 6908T Leuc. mesenteroides
E : B-536
F : B-538
G : B-540
H : B-542
I : 200 bp
J : LMG 6893T Leuc. mesenteroides mesenteroides
K : B-543
L : B- 482
M : B-485
N : LMG 6909T Leuc. mesenteroides
O : 200 bp

124
 A B C D E F G H I J K L M N O

Gel 16 : Gel d’électrophorése des produits de la (GTG)5-PCR des isolats de bactéries

lactiques obtenues dans cette étude

A : 200 bp
B : LMG 6890T L. lactis lactis
C : B-480
D : B-483
E : B-484
F : B-486
G : B-487
H : 200 bp
I : LMG 6897T Leuc. lactis cremoris
J : B-491
K : B-495
L : B- 505
M : B-518
N : LMG 13095T L. raffinolactis
O : 200 bp

125
 A B C D E F G H I J K L M N O

Gel 17 : Gel d’électrophorése des produits de la (GTG)5-PCR des isolats de bactéries

lactiques obtenues dans cette étude

A : 200 bp
B : LMG 6890T L. lactis lactis
C : B- 520
D : B-526
E : B-531
F : B-537
G : B-488
H : 200 bp
I : LMG 6897T Leuc. lactis cremoris
J : B-506
K : B-513
L : B- 515
M : B-525
N : LMG 13095T L. raffinolactis
O : 200 bp

126
 A B C D E F G H I J K L M N O

Gel 18 : Gel d’électrophorése des produits de la (GTG)5-PCR des isolats de bactéries

lactiques obtenues dans cette étude

A : 200 bp
B : LMG 6890T L. lactis lactis
C : B-499
D : B-548
E : B-545
F : : LMG 6908T Leuc. mesenteroides
G : B-496
H : 200 bp
I : B-533
J : B-550
K : B-552
L : B- 553
M : LMG 6909T Leuc. mesenteroides
N : LMG 6893T Leuc. mesenteroides mesenteroides
O : 200 bp

127
 A B C D E F G H I J K L M N O

Gel 19 : Gel d’électrophorése des produits de la (GTG)5-PCR des isolats de bactéries

lactiques obtenues dans cette étude

A : 200 bp
B : LMG 13087T Lact. paracasei paracasei
C : B-508
D : B-522
E : B-528
F : B-530
G : B-547
H : B-551
I : 200 bp
J : LMG 6412T Lact. delbrueckii
K : B-492
L : B- 511
M : LMG 6906 Lact. brevis
N : B-524
O : 200 bp

128
 A B C D E F G H I J K L M N O

Gel 20: Gel d’électrophorése des produits de la (GTG)5-PCR des isolats de bactéries
lactiques obtenues dans cette étude

A : 200 bp
B : LMG 11484 Ped. damnosus
C : B-504
D : B-541
E : LMG 6411 Ped. acidilactici
F : B-523
G : LMG 6400T Lact. rhamnosus
H : 200 bp
I : LMG 7937T Ent. faecalis
J : B-501
K : B-512
L : B- 544
M : B-546
N : LMG 9198 Lact. curvatus curvatus
O : 200 bp

129
 A B C D E F G H I J K L M N O

Gel 21 : Gel d’électrophorése des produits de la (GTG)5-PCR des isolats de bactéries

lactiques obtenues dans cette étude

A : 200 bp
B : LMG 6907T Lact. plantarum
C : B-497
D : B-519
E : B-539
F : LMG 6897T Leuc. lactis cremoris
G : B-502
H : LMG 9198 Lact. curvatus curvatus
I : 200 bp
J : LMG 6902 Lact. fermentum
K : B-521
L : LMG 6908T Leuc. mesenteroides
M : LMG 6909T Leuc. mesenteroides
N : B-509
O : 200 bp

130
 A B C D E F G H I J K L M N

Gel 22 : Gel d’électrophorése des produits de la (GTG)5-PCR des isolats de bactéries

lactiques obtenues dans cette étude

A : 200 bp
B : LMG 13087T Lact. paracasei paracasei
C : B-528
D : LMG 9433T Lact. acidophilus
E : B-549
F : LMG 6896 Str. thermophilus
G : B-514
H : 200 bp
I : B-524
J : LMG 6906 Lact. brevis
K : LMG 17302 Lact. sakei carnosus
L : LMG 6413T Lact. helveticus
M : LMG 6908T Leuc. mesenteroides
N : 200 bp

131
 UNIVERSITÉ MOHAMMED V – AGDAL
FACULTÉ DES SCIENCES
Rabat

DOCTORAT
Résumé de la thèse

Discipline : Biologie
Spécialités : Microbiologie et Biologie Moléculaire
UFR : Biodiversité et aquaculture (SV 01/01)
Responsable de l’UFR : Prof. Ahmed Yahyaoui
Période d’accréditation : 2006/2009

Titre de la thèse : Biodiversité des bactéries lactiques dans le lait cru et ses dérivés « Lben »
et « Jben » d’origine marocaine.

Prénom, nom : Mouna Ouadghiri

Résumé :
Un total de 54 échantillons de produits laitiers (lait cru (29), Jben (8) et Lben (17))
provenant de différentes fermes et régions marocaines ont fait l‘objet d‘une analyse
microbiologique pour déterminer leur diversité en bactéries lactiques.
300 bactéries lactiques ont été isolées et identifiées par des méthodes biochimiques
(API50 CHL), moléculaires (SDS-PAGE) et génotypiques ((GTG)5-PCR et séquençage du
gène codant pour l‘ARNt phenylalanine synthase PheS). Cette étude a montré que
l‘identification fiable des 300 isolats nécessite l‘utilisation d‘une approche polyphasique
incluant des techniques moléculaires de pointes et des logiciels bioinformatiques utilisant de
larges bases de données.
La biodiversité du lait cru marocain est caractérisée par des entérocoques, des
lactobacilles, des lactocoques, des leuconostocs et des Weissella. Les bactéries lactiques les
plus fréquentes appartiennent aux espèces Lactococcus lactis, Leuconostoc
pseudomesenteroides, Leuconostoc mesenteroides et Lactobacillus plantarum.
Les bactéries lactiques dominantes dans le « Jben » marocain appartiennent au genre
Lactobacillus (34%), Lactococcus (22%), Leuconostoc (27%) et Enterococcus (10%). Au
niveau de l‘espèce, Leuconostoc pseudomesenteroides est présente dans tous les échantillons
examinés. L‘espèce Lactobacillus plantarum est présente d‘une façon dominante dans la
quasi-totalité des échantillons examinés.
Le ―Lben‖ est typiquement dominé par les espèces Lactococcus lactis (41%),
Leuconostoc pseudomesenteroides (36%) et Lactobacillus plantarum (15%). Leuconostoc
mesenteroides a été trouvé moins fréquemment (5%).
Le lait cru et les produits laitiers traditionnels marocains sont caractérisés par une riche
biodiversité en bactéries lactiques. Cependant, sa prévalence est fonction des fermes, de la
région, des pratiques courantes des producteurs et du mode de production.

Mots-clefs : lait cru, produits laitiers traditionnels, biodiversité, bactéries lactiques,

(GTG)5-PCR, séquençage, bioinformatique.

132