Tópicos Selectos de Bioquímica

Editores:
María del Rosario Peralta Pérez
Beatriz Adriana Rocha Gutiérrez
Francisco Javier Zavala Díaz de la Serna
 Tópicos Selectos de Bioquímica

Copyright©2015

Editores:

María del Rosario Peralta Pérez

Beatriz Adriana Rocha Gutiérrez

Francisco Javier Zavala Díaz de la Serna

Todos los derechos reservados

ISBN-13: 978-1507637111

ISBN-10:150763711X

Las ideas plasmadas en cada capítulo son responsabilidad única y exclusiva del
autor.
A los estudiantes de Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad
Autónoma de Chihuahua quienes son la principal motivación para
realizar este trabajo.

A nuestras familias que con paciencia y amor nos han apoyado en todo
momento.

A Pilar, un ángel en el cielo. A Mercedes y Francisco, ángeles en la

tierra.
 AGRADECIMIENTOS

Estamos en deuda con todos los profesores investigadores

que creyeron en el proyecto y tuvieron paciencia mientras
éste fue desarrollado.
Agradecemos a la L.D.G. Leticia Mora Ortiz, cuyo trabajo en
el diseño y adecuación de todas las imágenes durante el
proceso de edición nos permitió concluir esta obra.
Reconocemos también el trabajo de la L.D.G. Verónica
Martínez Trujillo, encargada del diseño de la portada.
Una especial mención al Dr. Mariano Gutiérrez Rojas, que se
tomó la molestia de leer el texto y escribir el prólogo.

A la Universidad Autónoma de Chihuahua, especialmente a

la Facultad de Ciencias Químicas, agradecemos todo el apoyo
que nos ha sido brindado.
 INDICE
Prólogo……………………………………………………….. 1

Dr. Mariano Gutiérrez Rojas

Capítulo 1. Uso de las herramientas computacionales del siglo

XXI en el estudio de la bioquímica…………………………… 5

Francisco Javier Zavala-Díaz de la Serna., María del Rosario Peralta-Pérez y

Beatriz Adriana Rocha-Gutiérrez

Capítulo 2. Guía práctica para la medición de enzimas

lignocelulolíticas en fermentación en sustrato sólido………… 36

Isabel Membrillo-Venegas, Mayola García-Rivero y María Aurora Martínez-

Trujillo

Capítulo 3. Degradación microbiana de hidrocarburos………. 60

Manuel Alejandro Lizardi-Jiménez

Capítulo 4. El papel de los biosurfactantes en la

biorremediación de sitios contaminados con hidrocarburos….. 87

Olivia Tzintzun-Camacho

Capítulo 5. Degradación de hidrocarburos por plantas………. 116

Areli Cruz-Hernández

Capítulo 6. Metabolismo de fármacos………………………... 131

José Carlos Espinoza-Hicks

PRÓLOGO
En general, los estudiantes universitarios conocen poco de las
aplicaciones derivadas de las Ciencias Bioquímicas. En sentido estricto
son educados en torno a una disciplina con más matices de ciencia
básica que de ciencia aplicada. Tópicos Selectos de Bioquímica ofrece al
lector un panorama actual del posicionamiento de la Bioquímica a
través de la palabra escrita de los expertos en diferentes temas. Este
enfoque es la parte más valiosa del libro que no pretende ser un texto
guía que acompañe a los estudiantes de Bioquímica. El libro pretende
ser la expresión de opiniones en el campo de las aplicaciones del
conocimiento básico adquirido y formar parte de todo aquello
complementario que permita entender otros libros o publicaciones
científicas.
El libro busca como lectores a estudiantes de Bioquímica, de pregrado
y posgrado, pero los investigadores en formación y los consolidados
también son blanco de los diferentes capítulos que conforman el libro.
En la elaboración del libro no se sigue un formato predeterminado
dejando en libertad a los autores, que hacen uso tanto de su personal
estilo de redacción como del estricto estilo que se exige en una
publicación científica. Se distinguen dos tipos de participantes: (i) los
que quieren que el libro sea referencia para los estudiantes de
licenciatura y el aspecto de la enseñanza los mueve como su principal
motor interno y (ii) los que también quieren lo anterior pero le
confieren un mayor peso específico a la investigación que realizan en el
laboratorio.

1
Tópicos Selectos de Bioquímica comienza con un llamado a recurrir a las
nuevas tecnologías informáticas, desde lo más general y atractivo en el
internet, hasta los detalles de la Bioquímica que demandan palabras
clave y conectores, todo ilustrado con ejercicios que apoyan los
procesos de enseñanza-aprendizaje respondiendo a la pregunta ¿Cómo
buscar información relevante en el internet? En seguida se desarrolla un
detallado ejercicio didáctico, con información experimental de los
autores, en la búsqueda de la cuantificación de actividades enzimáticas,
totales o específicas, en los complejos sistemas de cultivo en fase sólida.
El libro atiende aspectos relacionados con el conflicto del ser humano y
el medio ambiente que deteriora con rapidez. Con la revisión del estado
del arte de aspectos relacionados con el metabolismo, en
microorganismos y en plantas, de hidrocarburos derivados de
actividades petroleras que contaminan suelos y cuerpos acuíferos, se
cubre la cuota ambiental. En las revisiones se incluyen las diferentes
rutas bioquímicas que le permiten a un microorganismo utilizar a los
hidrocarburos contaminantes como única fuente de carbono y energía.
Además de una amplia exposición acerca de la utilización de
biorreactores neumáticos que favorecen la transferencia de masa. Sobre
el mismo eje de ideas se destaca cómo los microorganismos que
participan en la biorremediación producen metabolitos que contribuyen
en la mejora de los procesos bioquímicos, las rutas metabólicas y la
regulación de la síntesis. En el libro se ofrece una revisión del papel que
juegan ciertas plantas en la descontaminación de suelos contaminados
con hidrocarburos: la fitorremediación. Los mecanismos que se
conocen tanto de fitotransformación como de asimilación de

2
contaminantes. Las tres revisiones se aderezan con una exhaustiva
selección de conceptos y referencias bibliográficas siempre útiles en
toda investigación del tema ambiental.
Finalmente, con un enfoque clínico-químico, se revisa con detalle el
metabolismo de fármacos y xenobióticos en humanos. Se ilustra con
ejemplos que incluyen las reacciones bioquímicas implicadas.

Dr. Mariano Gutiérrez Rojas

Profesor Distinguido.
Universidad Autónoma Metropolitana (Iztapalapa)
Ciudad de México, 18 de Febrero de 2015

3
4
 Capítulo 1
USO DE LAS HERRAMIENTAS
COMPUTACIONALES DEL SIGLO XXI EN EL
ESTUDIO DE LA BIOQUIMICA

Francisco Javier Zavala-Díaz de la Serna*, Ma. Rosario

Peralta-Pérez y Beatriz Adriana Rocha-Gutiérrez
Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de Chihuahua.
Circuito Universitario s/n. Campus Universitario II, Chihuahua, Chih.,
México. C.P. 31125, Apartado Postal 669.
*Autor para correspondencia, correo electrónico: fzavala@uach.mx

Palabras claves: bioinformática, internet, bioquímica.

Minino de Cheshire, ¿podrías decirme, por favor, qué camino debo seguir para salir de
aquí?/-Esto depende en gran parte del sitio al que quieras llegar - dijo el Gato./-No me
importa mucho el sitio... -dijo Alicia./-Entonces tampoco importa mucho el camino que
tomes - dijo el Gato./- ... siempre que llegue a alguna parte - añadió Alicia como
explicación./- ¡Oh, siempre llegarás a alguna parte - aseguró el Gato -, si caminas lo
suficiente!
“Alicia en el país de las maravillas” Lewis Carroll

EN UNA GALAXIA MUY, MUY ANTIGUA

Hace no mucho tiempo la mayoría tenía un libro de referencia, que
bien podría ser en el área “Bioquímica General” o “Los Fundamentos
de Bioquímica” de Albert Lenhinger, “Bioquímica” de José Laguna o
de Lubert Stryer y así se podrían seguir añadiendo ejemplos. Por
economía, movilidad o simple y sencillamente por disponibilidad se
utilizaba uno, dos o un máximo de tres libros de referencia. Era una
bioquímica del renacimiento: un solo hombre o libro, poseía la
información que usted requería para esta materia. Pero eso implicaba o
5
implica que la visión de ese libro de referencia era la única que tenían
muchos interesados en el tema; es decir, si Lenhinger era experto en
bioenergética, Laguna en la bioquímica y la medicina y Stryer en
transferencia de energía, esas áreas podrían ser las que favorecieran en
sus libros. Lo podían compensar invitando a sus amigos expertos en las
otras áreas y de hecho los libros que llevan sus nombres ya no tienen
más que su recuerdo en el nombre pues Lenhinger murió en 1986,
Laguna en 2011 y Stryer, todavía estaba vivo pero ya retirado en Junio
del 2015. Curiosamente, este último se dedica a otras actividades
diferentes a la bioquímica.
Pero en la actualidad, dado que cualquiera puede ver en vivo y a todo
color lo que pasa en un mundo cambiante, ¿por qué tendrían que ser
los campos de estudio zonas estáticas? La aparición y venta de un libro
es un proceso que lleva un periodo mínimo de seis meses a casi dos
años y, siendo sinceros, la mayoría de los libros interesantes en la
ciencia se escriben en el inglés, idioma que para la mayoría de los
estudiantes latinoamericanos de nuestra área no resulta comprensible
en una primera lectura y eso implica una traducción, lo que conlleva
generalmente otros seis meses y, de esa manera, para cuando el
estudiante o profesor utiliza el libro, la información más actual es de
por lo menos un año de antigüedad. ¿Se acuerda usted cuál fue la
noticia relevante de hace un año?
Además, los libros suelen ser y presentar figuras bidimensionales y esto
hace que ideas básicas que solemos suponer conocidas, y que a veces
son la base para entender conceptos importantes, sean difíciles de
imaginar y por tanto de comprender. Las moléculas tienen volumen,

6
diferentes áreas de exposición, profundidad, por lo tanto escribir H2O y
ver una molécula de agua puede ser una experiencia muy diferente. Ver
estructuras en tercera dimensión permite darnos una idea mejor de sus
propiedades y hace mucho más sencillo entender cuestiones como por
ejemplo, puentes de hidrogeno. En un mundo, donde las películas 3D y
las imágenes reales dominan y empiezan a establecerse patrones básicos
en la mayoría de las generaciones nuevas, aprovechar esas tecnologías
favorecería una mejor comprensión de materias como bioquímica.
Un viejo refrán dice que “una imagen puede sustituir mil palabras”,
pero también otro refrán dicta que “uno no puede correr sino sabe
caminar”. Hans Krebs describió el ciclo del ácido cítrico en 1937, y uno
debe conocerlo, para poder entender los datos que se generan hoy en
día. Leer un libro con los fundamentos es importante para poder sacar
el provecho a estas nuevas tecnologías. Este capítulo pretende ser un
complemento y una ayuda para poder utilizar las tecnologías de la
información sacándoles el mayor provecho posible; empezaremos con
conceptos básicos, tanto de búsqueda como auxiliares básicos de
internet, luego tomaremos algunas áreas de la bioquímica estructural y
metabólica y mencionaremos algunos programas, páginas web y
utilidades que pueden usarse para que leídos y estudiados previamente
estos mismos conceptos, ya sea en un libro o artículo, se puedan
entender mejor.

7
 REGLAS BÁSICAS DE OPERACIÓN: CONÉCTESE ANTES
DE ENCENDER.
El mundo del internet es uno solo, pero las personas que lo usan no. Se
dividen, de acuerdo al sistema operativo que pueden usar, en cuatro
grandes grupos:
a) los usuarios de MICROSOFT: WINDOWS
(http://www.microsoft.com/)
b) los que utilizan aparatos de APPLE: OS, (https://www.apple.com/)
c) los utilizados en otras plataformas, como tabletas o celulares:
ANDROID de GOOGLE (https://www.google.org/)
d) los diseñados por usuarios, que son llamados “de fuente libre”, es
decir cualquiera puede modificar el sistema: UNIX
(http://www.unix.org/) y su derivación LINUX
(http://www.linux.com/)
En este último grupo los sistemas son gratuitos mientras que los
diseñados por compañías tienen un costo. Hay dos cosas importantes a
revisar: 1) las versiones cambian y, a veces, de una forma tan radical
que dificulta el seguir usando algunos programas o paqueterías; 2) hay
programas que permiten una compatibilidad entre los sistemas
operativos, es decir, emulan el ambiente para que un programa que
utilice Windows pueda ser usado en una maquina con sistema
operativo OS.
Tenga entonces esto muy en cuenta y cuando baje cualquier programa
o paquetería de programas de cualquier sitio, si su computadora está
usando Windows 9 trate de bajar programas que digan que son para
Windows 9 y si no, entonces trate de revisar la presencia de “parches

8
informáticos” es decir archivos que incorporándolos al programa
permitan solucionar la incompatibilidad. Si su programa favorito no
tiene la versión adecuada para su sistema operativo, siempre queda la
opción de probar o hacer una búsqueda, tema que trataremos más
adelante. Trate siempre de entender que hace o porque está usando un
programa, pues muy probablemente en menos de tres años ya tenga un
sistema operativo nuevo y tenga que buscar nuevamente un programa
similar.
La recomendación básica al momento de bajar un programa o cualquier
archivo de internet, es la misma que con cualquier situación
informática: consígase un buen antivirus, y actualícelo, los hay de costo
y los hay gratuitos, dependerá de usted la selección, pero consígalo de
cualquier manera antes de empezar a trabajar en internet.
Una vez obtenido un antivirus revise lo siguiente de su plataforma: el
espacio libre disponible en el disco duro y la memoria RAM que
maneja. Generalmente los programas ocupan un espacio muy pequeño
y permiten, en la mayoría de los sistemas operativos, realizar diferentes
funciones mientras ellos operan. Pero en ocasiones no es así, y antes de
tener un problema, lea los requisitos de operación de todos los
programas, o haga una prueba.
Cuando descargue del internet un archivo o programa, asígnele un
lugar determinado generalmente una carpeta que usted pueda localizar,
por si es necesario modificarlo o eliminarlo. En la actualidad muchos
programas crean su propia carpeta y la colocan en lugares específicos
dentro del sistema operativo, pero si no es el caso, usted podría tener
30 archivos en su escritorio y estaría preguntándose cuáles son los del

9
programa, estaría tratando de unirlos en una carpeta que no sabe si
contiene toda la información, también tendría algunos archivos (sobre
todo artículos) que se guardan con nombres que no tienen nada que ver
con lo que usted descargó. Téngalo en cuenta siempre y evite después
eliminar archivos claves del sistema o de la paquetería.
Otro punto interesante es que la mayoría de la gente que trabaja en
estas áreas de la computación ha preferido el idioma inglés para dar a
conocer lo que hace, esto no quiere decir que tengamos poca
información en el idioma español simplemente encontrará mayor
cantidad de datos, programas y utilerías buscándolas con palabras clave
en inglés. En ocasiones los programas permiten varios idiomas, pero
trate de estudiar o entender por lo menos un poco de inglés técnico,
para tener suerte como dice Google.
Finalmente, y siempre que pueda tenga respaldo de su información, en
sitios diferentes a los que usa con mayor frecuencia. Pueden ser discos
duros portátiles o la nube informática, pero siempre guarde los datos
que más le interesan en dos o más lugares. En un mundo donde los
virus informáticos, los golpes o simple y sencillamente la electricidad
pueden ser variables, evite que todo su trabajo o la información que
acaba de obtener se pierdan en segundos y a veces ante su propia vista.
Hay más recomendaciones, más observaciones pero donde y como
encontrarlas es el siguiente punto de este capítulo.
DE CHARLAS DE GATOS Y NIÑAS
¿Puede Juanito buscar la información que necesita?, esa pregunta hecha
en 2011 por el Dr. Gustavo Viniegra durante la conferencia “¿Por qué
es tan difícil transferir la tecnología en México?” refleja la situación

10
actual de muchos estudiantes. Se puede tener acceso a toda la
información que se quiera, en el momento en que lo quiera y en el lugar
donde lo quiera. Pero de esa información ¿qué le sirve? ¿Qué es real y
cuál no es un hoax o invento de la red? ¿Cómo puede usted llegar a lo
que realmente busca y no perderse en el camino?
a) Dónde buscar
INTERNET ha hecho que la herramienta principal del mismo sean los
buscadores. Las grandes empresas en 2014, pueden tener sistemas
operativos dominantes pero el negocio son los famosos algoritmos de
búsqueda. Un algoritmo se puede definir como los pasos o
instrucciones para resolver un problema, un ejemplo se observa en la
Figura 1.

Figura 1. Las diferentes partes que componen un algoritmo: problema,

pasos y solución, en un diagrama de flujo. En este caso solucionando la
pregunta: ¿Qué es un algoritmo?

11
En el algoritmo se pueden agregar o quitar pasos y mejorar por tanto el
tiempo de respuesta u obtener una solución alternativa. Google, Yahoo
y Bing son algunos de los buscadores más conocidos y por tanto más
usados, de hecho en el inglés americano la palabra “googlear” se usa
como sinónimo de búsqueda en el internet. Sin embargo, no son los
únicos buscadores y de hecho hay tantos buscadores que se han
generado los buscadores de buscadores llamados “metabuscadores”,
algunos de los cuales se presentan en la Tabla 1.

12
 EJERCICIO
Escriba en su buscador de preferencia la palabra “metasearch” o “metabuscador”.
Revise las 20 primeras entradas, seleccione tres metabuscadores, ponga en cada uno
las palabras “ciclo del ácido cítrico” y compare los resultados.

b) Cómo buscar
Con millones de páginas en internet podríamos pensar que la búsqueda
de información es fácil, pero no es así. La mayor parte del tiempo
13
cualquier palabra que se introduce da como resultado millones de
páginas, lo que dificulta la revisión, aunque tuviéramos una página que
contestará la pregunta de la manera en que la necesitamos, nosotros no
encontraríamos la respuesta sino hasta después de una búsqueda que
podría abarcar toda una tarde, justo lo que se quiere evitar.
Para buscar la aguja en el pajar informático, sugerimos dos estrategias:

1) Escriba lo que busca, ponerle toda la información le ayudara a

encontrar lo que realmente necesita. Por ejemplo: En Google, la
palabra “ciclo” da como resultado 131 millones de páginas; pero al
escribir “ciclo ácido” se obtienen 9 millones y medio; ser más
específico y poner “ciclo ácido cítrico” permite obtener 74,000
resultados; finalmente poner “explicación del ciclo del ácido cítrico” da
57,000 opciones. En conclusión, entre más información le proporcione
al buscador menos páginas y menos opciones obtendrá para encontrar
la información adecuada.

14
2) Uso de conectores, algunos de los cuales se presentan en la tabla 2.
Tabla 2. Algunos conectores de INTERNET

En el último caso hay que vigilar mucho la redacción, no es lo mismo

escribir “Ciclo de la Urea” que “Ciclo Urea”, pues mientras el primero
sugiere 70,000 páginas, el segundo sólo 3,000.
EJERCICIO
Ponga las palabras ciclo, acido, Krebs en un buscador. Haga todas las
combinaciones posibles y revise la cantidad de resultados obtenidos. Compare esa
cantidad y por último revise los 10 primeros de la combinación que le haya resultado
más útil. ¿Con cuál búsqueda obtuvo la información adecuada?
Ahora trate de contestar la siguiente pregunta mediante una búsqueda en internet:
¿Cuál es la energía libre de Gibbs liberada en la formación del ácido cítrico
mediante la unión del oxalacetato y la acetil coenzima A?

15
c) Buscadores científicos
Entre los buscadores enfocados en temas particulares, la diversidad
también es grande, hay muchas bases especializadas, algunas
directamente relacionadas con los temas de bioquímica estructural o
metabólica se mencionaran más adelante. Por el momento presentamos
algunas bases relacionadas con química, biología y temas afines (Tabla
3). Es importante aclarar que muchas de ellas son dependientes de
asociaciones, editoriales y compañías diversas que cobran por
revisarlas, una suscripción que suele ser costosa como estudiante.

16
Tabla 3. Algunos buscadores científicos

17
En Latinoamérica, las diferentes dependencias encargadas de fomentar
la investigación científica y tecnológica han realizado convenios para
que las diferentes Instituciones de Educación Superior (IES) puedan
permitir que sus estudiantes revisen estos buscadores, además de poder
consultar revistas especializadas por lo menos dentro del área física de
las IES. Algunas de las dependencias gubernamentales donde se
pueden revisar son: Argentina, CONICET
(http://www.conicet.gov.ar/); Brasil, CAPES
(http://www.capes.gov.br/ ); Bolivia, Academia Nacional de Ciencias,
(http://www.aciencias.org.bo/); Chile, CINCEL,
(http://www.cincel.cl/); Costa Rica, CONICIT,
(http://www.conicit.go.cr/); Ecuador, SENESCYT
(http://www.educacionsuperior.gob.ec/); México, CONRICYT,
(http://www.conricyt.mx/); Panamá, SIBIUP,
(http://www.sibiup.up.ac.pa/); Uruguay, TIMBÓ,
(http://www.timbo.org.uy/) y Venezuela, IVIC,
(http://www.ivic.gob.ve/) además de instituciones internacionales
como IAP (http://www.interacademies.net/) e ICSU
(http://www.icsu.org/). También destaca el movimiento “Open
Access”, el cual consiste en que el material digital educativo,
académico, científico o de cualquier otro tipo principalmente artículos
de investigación científica sea de acceso inmediato, sin ninguna
restricción (Suber 2004). Entre los principales promotores de esta
iniciativa están Public Library of Science (PLOS)
(http://www.plos.org/), Open Access Publishing in European
Networks (OAPEN) (http://www.oapen.org/home ) entre otros, que

18
sumados a Proyecto Gutenberg (http://www.gutenberg.org/),
permiten tener a disposición material en cualquier punto donde se
pueda uno conectar al INTERNET. Todas estas iniciativas y esfuerzos
respetan los derechos legales de los autores y editoriales, el famoso
copyright o derecho de autor y evitan el plagio, es decir “copiar en lo
sustancial obras ajenas, dándolas como propias” según lo define el
diccionario de la lengua española
(http://www.rae.es/recursos/diccionarios/drae). ¿Cómo saber si algo
es libre y lo puedo difundir? ¿Dónde puedo pedir permiso? ¿Hay
alguna regla de cortesía para citar algo? Los derechos de autor varían de
país en país pero normalmente establecen un periodo de tiempo en el
cual, si se quiere utilizar todo o alguna parte de un producto, se tienen
que pagar por su permiso y se tiene que recibir un documento que
garantice la cesión temporal de ese derecho
(http://www.copyright.gov/espanol/faq-espanol.pdf) y su página
principal http://www.copyright.gov/ para Estados Unidos y en
México http://www.indautor.gob.mx/?navegador2=%271%27&valor.
Para citar información incluyendo páginas e imágenes de internet hay
diferentes modelos, uno de los más utilizados es APA
(http://www.apastyle.org/) y en estas páginas podemos ver ejemplos
muy prácticos de cómo se pueden citar imágenes y textos
(http://www.bidi.uam.mx/index.php?option=com_content&view=arti
cle&id=62:citar-recursos-electronicos-normas-apa&catid=38:como-
citar-recursos&Itemid=65 y otra opción es
http://www.unipiloto.edu.co/descargas/publicaciones/Como_citar_c
orrectamente_una_imagen.pdf ). Para saber si algo es del dominio

19
público o puede ser citado sin pagar derechos, recomiendo el siguiente
PDF “El dominio público y los límites del derecho de autor” que
puede consultar en el siguiente link http://www.mecd.gob.es/cultura-
mecd/dms/mecd/cultura-mecd/areas-cultura/propiedad-
intelectual/mc/guia-ompi/capitulos/DominioPublico-C.pdf.
EJERCICIO
El texto con que inicia este capítulo, proviene del libro “Alicia en el país de las
maravillas” de Lewis Carroll, averigüe que parte de la obra de Lewis Carroll
(libro, traducciones, películas, imágenes, música, etc.,) es del dominio público y que
parte implica el pago de derechos de autor.

Para encontrar bases especializadas en temas científicos se puede desde

preguntarle a los expertos en el tema, hasta hacer búsquedas en los
buscadores y metabuscadores, pasando por revistas con números
especializados como NUCLEIC ACID RESEARCH
(http://nar.oxfordjournals.org/ ) que es una revista Open Access o
libre para ser consultado y que tiene tanto un número dedicado a bases
de datos que sale en enero (versión 2015
http://nar.oxfordjournals.org/content/43/D1.toc) y otro en julio
dedicado a servidores en INTERNET (versión 2014
http://nar.oxfordjournals.org/content/42/W1.toc), BMC
BIOINFORMATICS
(http://www.biomedcentral.com/bmcbioinformatics) también Open
Access, BIOINFORMATICS
(http://bioinformatics.oxfordjournals.org/ ) que a veces tiene artículos
o ejemplares Open Access y finalmente la revista de las bases de datos

20
biológicas, DATABASE (http://database.oxfordjournals.org/),Open
Access también.
EJERCICIO
Escriba en su metabuscador las palabras “base de datos científica” o “Scientific
database”. Revise los primeras 10 resultados. ¿Cómo puede hacer para encontrar
bases de datos que tengan que ver con estructuras químicas? Pruebe con la
información que ya conoce.

d) Todo lo que digo es verdad a menos que sea un mentiroso

Antes de continuar es necesario revisar un punto importante: ¿puedo
confiar en la información que está disponible en la página Z? Este
punto es muy delicado, en el mundo de la ciencia y en cualquier área se
establece un vínculo de confianza, que se basa en dos principios:
1) todo se debe y puede comprobarse, 2) todos son inocentes hasta que
se demuestre lo contrario. Pero no todo se puede probar y no todos
son tan inocentes como pensamos. Acciones de internet como las
páginas WIKI, donde los usuarios pueden participar en el proceso de
construcción de la página dando y editando información puede
presentar ambas situaciones. Un ejemplo es Wikipedia
(http://es.wikipedia.org/) que en los últimos años ha sido la principal
fuente de información en muchos ambientes estudiantiles. Aunque ha
habido intentos de curar la información, es decir revisarla dato por
dato, nunca falta el dato erróneo o la página que muestra que el editor,
que debería ser neutral, tiene una ligera o muy marcada inclinación;
además suele haber una disparidad entre lo escrito en un idioma o lo
que se pone en otro. Un ejemplo, la entrada “Citric acid cycle”, en

21
inglés (http://en.wikipedia.org/wiki/Citric_acid_cycle) presenta 21
referencias (14 artículos publicados en revistas científicas, el último de
2013; 4 libros incluyendo el Stryer; y 3 ligas) además de 4 ligas externas;
y en español “Ciclo del ácido cítrico”
(http://es.wikipedia.org/wiki/Ciclo_del_ácido_cítrico) muestra sólo 8
referencias (6 artículos, el último del 2003; y dos libros, incluyendo
también el Stryer) además de 7 ligas externas. ¿Qué se puede hacer?
Como en todos los casos, si la información es importante, consulte más
de una referencia: Wikipedia, uno o más libro, además de cualquiera
otra fuente de información. Los proyectos WIKI, aunque carecen de
un líder particular, presentan un consejo editorial a quienes usted les
puede escribir para corregir, editar, aumentar información y ayudar
(http://es.wikipedia.org/wiki/Ayuda:Introducción). En esta sección
utilizamos Wikipedia como un ejemplo pero hay muchos sitios que
comparten esta idea de que cualquiera pueda poner información como
SLIDESHARE (http://www.slideshare.net/), MONOGRAFIAS
(http://www.monografias.com/), SCRIBD (http://es.scribd.com/), y,
quizás uno de los más conocidos, EL RINCON DEL VAGO
(http://www.rincondelvago.com/ ).
EJERCICIO
Baje de tres sitios información sobre el Ciclo de la Urea y compare la información
obtenida. ¿Presentan todos los mismos datos? ¿Hay datos o información que sea
contradictoria? ¿Cómo puede conocer cuál es la información que corresponde a lo que
en realidad se conoce?
Revise finalmente las referencias utilizadas por las páginas consultadas de los
diferentes sitios y compárelas entre sí.

22
 TODOS LOS SERES VIVOS ESTÁN HECHOS IGUALES
ANTE LA NATURALEZA…
Dentro de la bioquímica hay dos áreas muy definidas: la estructural y la
metabólica. La primera se refiere a las moléculas y sus estructuras, la
segunda a los procesos de conversión de una o más estructuras en
energía y otras estructuras o viceversa. Ambas están interrelacionadas
pero se pueden estudiar por separado para mayor facilidad, así que
primero estableceremos los lugares donde analizar, revisar y encontrar
estructuras.
Los programas, relacionados a estructuras en general se pueden basar
en dos premisas, aunque algunos pueden combinarlas:

a) Los que permiten el diseño de las estructuras:

Estos permiten añadir átomo por átomo, para lograr construir
moléculas posibles y a veces imposibles en la naturaleza. Algunos
siguen las reglas básicas de la bioquímica, por ejemplo que el átomo de
carbono solo tenga 4 enlaces como máximo y no 5. Otros, por el
contrario, permiten tomar en cuenta las diferentes teorías moleculares,
atómicas y cuánticas y por tanto regulan la construcción de las mismas
moléculas. Estos últimos permitirían hacer las estructuras con
resonancia, ángulos correctos, enlaces y atracciones definidos. En
muchos casos se pueden meter los parámetros a analizar y entonces se
puede llegar a predecir la estructura molecular. La imagen puede
presentarse en diferentes formas.

23
b) Los que permiten visualizar moléculas ya descritas:
Generalmente se basan en bases de datos que guardan archivos para ser
leídos por programas particulares. Este tipo de programas suelen tener
la capacidad de leer más de un tipo de archivos y suelen fungir como
traductores. Leen un archivo en un formato M y lo pueden guardar en
un formato N. Una vez en el formato adecuado ya se le puede trabajar
de una manera adecuada a los intereses propios. Hay muchos
programas de los dos estilos, de hecho cada compañía que tenga
equipos que generen datos como imágenes, espectros, secuencias, etc.,
suele presentar un programa propio. De ahí la necesidad de tener
programas que puedan leer varios formatos. En la Tabla 4 se muestran
algunos de los programas disponibles:

Tabla 4. Algunos programas para diseño de estructuras moleculares

24
Glúcidos:
Los Carbohidratos o glúcidos son la tercera molécula en importancia
de estudio en bioquímica después de las proteínas y los ácidos
nucléicos. Antes la principal metabase era Carbank, que fue conocida
posteriormente como Complex Carbohydrate Structure Database
(CCSD); esta base, CCSD, inició como un esfuerzo colectivo en los
años 80 del siglo XX y desapareció, o mejor dicho dejó de actualizarse
desde 1997, debido a la carencia de fondos económicos que le
permitieran mantenerse (Ranzinger et al., 2011)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3013643/). Ha
habido varios intentos de realizar otra metabase tan importante como
CCSD, pero ninguna ha tenido su relevancia y, como se ve en la Tabla
5, lo que hay en la actualidad son sitios como Glycomics, un portal que
contiene ligas a las diferentes bases.
Tabla 5 Algunos programas y bases de datos relacionados con glúcidos

25
Tabla 5 (Continuación). Algunos programas y
bases de datos relacionados con glúcidos

26
Lípidos:
Si los glúcidos carecen de una metabase que los agrupe, los lípidos
presentan todavía menos información y si no fuera por el surgimiento
de las ciencias ómicas y por tanto de la lipidómica, careceríamos de
bases especializadas. En la tabla 6 se muestran algunas de las bases de
datos y programas en general.

Tabla 6. Algunos programas y bases de datos de lípidos

27
Proteínas y enzimas:
En los últimos años las tecnologías basadas tanto en los ácidos
nucléicos como en las proteínas, principalmente enzimas, le han dado
un valor estratégico a las informaciones que se puedan generar sobre
estas moléculas. Por esta razón hay iniciativas gubernamentales
dedicadas a las bases de datos que contengan información de
secuencias tanto nucleotídicas como aminoacídicas. El Centro Nacional
para la Información Biotecnológica (NCBI Nacional Center for
Biotechnology Información) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) con sede
en Bethesda, Estados Unidos; el Laboratorio de Biología Molecular
Europeo (EMBL European Molecular Biology Laboratory)
(http://www.embl.de/) con sede en Heidelberg, Alemania; el Banco de
Datos de DNA de Japón (DDBJ DNA Data BANK of Japan)
(http://www.ddbj.nig.ac.jp/) en Tokio, Japón han enfocado grandes
recursos para desarrollar, mantener y apoyar proyectos que permitan un
mayor conocimiento. Los tres han firmado convenios para compartir
información en temas como secuencias haciendo de ellos lo que se
denomina “espejos”, es decir, que entrando en uno se pueden consultar
las bases de datos de los tres y lo que los diferencía son las
herramientas informáticas con las que se puede trabajar.
Expasy, (http://www.expasy.org/) el sitio de programas para análisis
de proteínas que tiene EMBL, es una de las páginas más utilizada
precisamente por la enorme diversidad de programas que tiene. En las
Tablas 7, 8 y 9 se presentan algunos de estos sitios para el análisis,
búsqueda y manejo de datos de proteínas, enzimas y ácidos nucléicos
respectivamente.

28
Tabla 7 Algunos programas y bases de datos para proteínas

29
Tabla 8. Algunos programas y bases de datos para enzimas

30
Tabla 9. Algunos programas y bases de datos para ácidos nucléicos

31
PERO ACTÚAN DIFERENTES ANTE LA NATURALEZA Y
SU ENTORNO
Alguna vez se comentó que un ladrillo podía ser parte tanto de un
castillo como de una choza, el saber qué hay no implica saber cuál es la
función de cada uno de los componentes, ese es el reto de la
bioquímica del siglo XXI, lo que han realizado Hans Krebs, Melvin
Calvin y otros grandes investigadores debe continuarse con las técnicas
y herramientas actuales. En la Tabla 10 se muestran las bases de datos
actuales que existen con respecto al metabolismo y algunos programas
que empiezan a permitir in silico, es decir por medio de computadoras, a
unir los productos para predecir las vías metabólicas.

Tabla 10. Algunos programas y bases de datos para vías metabólicas

32
Tabla 10 (continuación). Algunos programas y bases de datos para vías
metabólicas

El futuro es algo que está en el siguiente paso, es algo que sólo se va a

lograr mediante experimentación, observación y mucho análisis. La idea
de poder utilizar las tecnologías actuales y combinarlas tanto con el
conocimiento que se puede lograr leyendo las experiencias pasadas
como con la capacidad de análisis que permite el ver el panorama
completo muestra una perspectiva interesante. En este capítulo hay
aproximadamente 100 páginas que se pueden revisar hasta por medio
de celulares, tabletas o lo que el nuevo tiempo establezca como
herramientas de computación. Ser curioso es la primera virtud del
científico, en la Tabla 11, dejamos una diversidad de sitios como un
primer paso para seguir buscando más información. No deje de buscar,
apenas estamos en la orilla de un océano profundo de conocimientos.
33
Tabla 11. Más programas y bases de datos de bioquímica en general

34
 NOTA FINAL
Hay muchas páginas de las que abrevamos para poder hacer este
pequeño compendio, casi todas ellas son citadas directamente y las que
no es porque han desaparecido de la red. Todas ellas fueron páginas de
gente que trata o trató de hacer lo mismo que nosotros queremos:
apoyar los procesos educativos con las tecnologías modernas.
Apoyémoslas difundiéndolas y visitándolas.
Esto avanza y seguirá avanzando, si hay alguna sugerencia de páginas o
información que se quiera compartir, dejamos nuestro email
fzavala@uach.mx, para poder mejorar y en un futuro tener la versión
2.0 mejorada.
REFERENCIAS
Ranzinger R., Herget S., von der Lieth C.-W. y Frank M. 2011.
GlycomeDB—a unified database for carbohydrate structures. N.
A. R. 39: D373-D 376
Suber P. 2004. Open Access Overview.
http://legacy.earlham.edu/~peters/fos/overview.htm revisado el 13
de septiembre de 2014
Viniegra G. 2011. “¿Por qué es tan difícil transferir la tecnología en
México?”. Conferencia impartida en la Facultad de Ciencias
Químicas. Universidad Autónoma de Chihuahua. 1 de diciembre
de 2011.
Nota. Todas las ligas fueron revisadas por última vez el 7 de junio de
2015.

35
 Capítulo 2

GUÍA PRÁCTICA PARA LA MEDICIÓN DE

ENZIMAS LIGNOCELULOLÍTICAS EN
FERMENTACIÓN EN SUSTRATO SÓLIDO.

Isabel Membrillo-Venegas, Mayola García-Rivero y Ma.

Aurora Martínez-Trujillo*
División de Ingeniería Química y Bioquímica, Tecnológico de Estudios
Superiores de Ecatepec. Av. Tecnológico S/N., col Valle de Anáhuac,
Ecatepec, Estado de México.
*Autor para correspondencia, correo electrónico:
amartinezt@tese.edu.mx

Palabras clave: xilanasas, lacasas, hongos de la podredumbre blanca,

residuos agroindustriales.

RESUMEN
Este trabajo presenta un ejercicio didáctico que puede servir como una
guía para estudiantes de licenciatura de las áreas químico-biológicas. En
una pequeña introducción, revisa el contexto de la naturaleza de la
fermentación en sustrato sólido para la obtención de enzimas de interés
en diversos procesos. Posteriormente, se detalla la metodología
empleada para obtener extractos enzimáticos producidos por un hongo
de pudrición blanca en fermentación en sustrato sólido, cuantificar las
actividades contenidas en estos y reportar los resultados. Con datos
experimentales, se profundiza en el análisis para el cálculo de una
actividad hidrólitica y otra oxidativa mediante el empleo de técnicas
espectrofotométricas. Los resultados obtenidos se plasman en tablas o
gráficos, utilizando para su construcción tres formas convencionales de
reportar las actividades enzimáticas contenidas en un extracto: actividad

36
volumétrica, específica respecto al sustrato y específica respecto a la
proteína.
INTRODUCCIÓN
Los sustratos
La generación de residuos sólidos urbanos se ha incrementado de
manera paralela al crecimiento de las ciudades y al aumento en la
densidad poblacional. En México se generan más de 10 millones de
toneladas al año, de estos residuos, 15% son derivados de papel y de
cartón, de las cuales únicamente el 10% se reciclan y el otro 6% es
desechado sin darle otro uso (SEMARNAT, 2014). Por otro lado, en
México se cultivan anualmente alrededor de 740 mil Ha de caña de
azúcar, 32 mil Ha de arroz, casi 7 millones de Ha de maíz y 580 mil Ha
de trigo en promedio; el procesamiento de estos productos agrícolas
provoca una generación considerable de bagazos y rastrojos
(SAGARPA, 2012).
De manera particular, los residuos o subproductos orgánicos que se
generan de la transformación de productos agrícolas representan una
fuente de contaminación, dado su contenido considerable de celulosa y
otros carbohidratos. Sin embargo, esta misma propiedad los vuelve
potencialmente atractivos como fuente de carbono para el desarrollo de
cultivos microbianos.
En las últimas dos décadas, muchos de los estudios en fermentación
sólida (FS) se han concentrado en aprovechar los residuos
agroindustriales para la producción de enzimas (Pandey et al., 2000;
Mazutti et al., 2006). Esto se debe a que en estos procesos los residuos
pueden ser de manera simultánea la fuente de nutriente y el soporte

37
físico para el crecimiento microbiano. Cuando así sucede, dicho
crecimiento se logra por la acción de las enzimas extracelulares sobre
los componentes de estos sustratos (Nandakumar et al., 1994).
Los microorganismos
Dada su compleja composición química, la degradación biológica de
celulosa, hemicelulosa y lignina ha atraído el interés de microbiólogos y
biotecnólogos por muchos años. De todas las especies capaces de
degradar estos tres polímeros, los hongos son la variedad más
estudiada. En general, la degradación microbiana de estos materiales
sucede gracias a la capacidad de los microorganismos para producir dos
sistemas enzimáticos extracelulares: el hidrolítico, responsable de la
degradación de celulosa y hemicelulosa; y el oxidativo, específicamente
llamado ligninolítico, encargado de depolimerizar a la lignina (Pérez et
al., 2002). Microorganismos como los hongos de la pudrición café y
blanca son los principales degradadores de la lignina, celulosa y
hemicelulosa de los residuos agroindustriales (Sun & Cheng, 2002).
La mayoría de los microorganismos con capacidad para degradar
celulosa pertenecen a los géneros de las eubacterias y los hongos,
aunque también se han reportado algunos protozoarios anaerobios y
mohos. Los sistemas celulolíticos de los hongos Trichoderma reesei,
Phanerochaete chrysosporium, Sclerotium rolfsii, y especies de Trichoderma,
Aspergillus, Schizophyllum y Penicillium son los más ampliamente
estudiados. En lo que se refiere a las bacterias aerobias celulolíticas, las
especies de los géneros Cellulomonas, Pseudomonas y Streptomyces son las
más estudiadas (Pérez et al., 2002; Sun & Cheng, 2002).

38
La degradación biológica de la hemicelulosa es un proceso más
complicado, debido a la complejidad estructural de este material. La
especie hemicelulósica más representativa es la xilana, y son las
xilanasas el sistema enzimático encargado de dicha degradación. Los
hongos aerobios Trichoderma, Aspergillus y P. chrysosporium secretan una
amplia variedad de hemicelulasas en altas concentraciones, aunque
también se ha reportado extensivamente la producción de xilanasas por
bacterias, tanto de especies aerobias como las ruminales (Dashtban et
al., 2009).
En lo que respecta a la degradación biológica de la lignina, los hongos
son los microorganismos más eficientes. En este grupo destacan
algunos hongos como Phlebia radiata, Pleurotus ostreatus Coriolus versicolor,
P. chrysosporium y Trametes versicolor, además de algunas bacterias aisladas
de composta (Pérez et al., 2002; Kiiskinen et al., 2004; Dashtban et al.,
2009).
Las enzimas
Las xilanasas son un complejo enzimático producido principalmente
por microorganismos. Catalizan la hidrólisis del xilano, que es un
heteropolisacárido constituyente de la pared celular vegetal, hasta sus
compuestos monoméricos constituyentes (Polizeli et al., 2005).
Varios estudios han demostrado que las xilanasas son co-inducidas en
respuesta al xilano o por sustratos que contienen hemicelulosa o
celulosa pura. Los resultados obtenidos en el uso de materiales de
desechos vegetales como fuente de carbono han sido vislumbrados
como una estrategia de bajo costo para la producción de las enzimas.
La producción industrial de xilanasas se efectúa principalmente por

39
fermentación sumergida (FSm), aunque existe un creciente interés por
producirlas a través de fermentación sólida (FS). Para la producción de
xilanasas pueden emplearse diferentes sustratos. Una excelente opción,
en términos de rendimientos, es el xilano; sin embargo, para una
producción a gran escala una mejor alternativa son los sustratos
lignocelulósicos como la cascarilla de cebada, la mazorca de maíz, el
salvado o la paja de trigo, el bagazo de caña, cascarilla de arroz y
residuos de madera. Las condiciones de la FS son por sí mismas
adecuadas para el crecimiento de los hongos y por tanto con su empleo
se han logrado producciones de enzima mayores (Loera-Corral &
Villaseñor-Ortega, 2006).
Las lacasas (EC 1.10.3.2, bencendiol:oxígeno reductasas) son una
familia de polifenol oxidasas que contienen cobre en sus sitios activos.
Se producen por los hongos de la pudrición blanca como parte de un
complejo enzimático encargado de la despolimerización de la lignina
(Wong, 2009). Las lacasas son generalmente producidas durante el
metabolismo secundario de diferentes hongos, pueden ser constitutivas
o inducibles y también intracelulares o extracelulares. Varios factores
incluyendo el tipo de cultivo (sólido o sumergido), la limitación de
carbono, fuente de nitrógeno y concentración de microelementos
pueden influir en su producción (Galhaup et al., 2002).
La producción de lacasas para aplicaciones industriales requiere de la
reducción de costos durante el bioproceso encargado de su obtención,
lo que abre un nicho de oportunidad para la investigación en busca de
procesos que permitan incrementar la producción.

40
El punto de partida para la optimización de un proceso productor de
enzimas es lograr su caracterización. Para lo anterior, resulta
indispensable contar con técnicas analíticas que permitan la adecuada
medición de las enzimas producidas. El presente capítulo tiene como
objetivo presentar una guía práctica para la cuantificación de xilanasas y
lacasas en una FS.
MATERIALES Y MÉTODOS
Producción de enzimas
Se utilizó la cepa Phanerochaete chrysosporium H298. El bagazo de caña se
utilizó como sustrato, para lo cual dicho material se secó a temperatura
ambiente, se molió y se hizo pasar por un tamiz, recuperando los
residuos de malla 60. El cultivo en fermentación sólida se desarrolló en
tubos de fondo cónico que contenían 0.5 g del bagazo de caña
hidratados con agua destilada para conseguir una humedad del 80%.
Luego de la esterilización, se agregó a cada tubo el medio basal, cuya
composición, en g/L, era: KH2PO4, 2; K2HPO4, 2; y (NH4)2SO4, 5; a
pH 5.0, ajustando con NaOH o H2SO4. Los cultivos se inocularon con
1 X 108 esporas/g de la fuente de carbono, y se incubaron a 37°C
durante 300 h. Por rigor científico, los experimentos se desarrollaron
en unidades experimentales independientes, y cada 24 h se realizaba un
muestreo, retirando dos unidades experimentales de manera aleatoria.
Así, para cada muestra se analizaron los duplicados a y b.
Para obtener los extractos enzimáticos (ECE), se agregó a cada unidad
experimental 5 mL de regulador de acetatos 100 mM pH 5.0 frío, y se
agitó vigorosamente la mezcla generada. Luego de centrifugar por 5
min, se recuperó el sobrenadante, que se mantuvo en refrigeración para

41
su posterior análisis, durante el cual se cuantificó su contenido de
proteína y de las actividades enzimáticas de xilanasas y lacasas.
Métodos analíticos
Cuantificación de Proteína del ECE
Para cuantificar la proteína obtenida en los extractos enzimáticos se
empleó la técnica descrita por Bradford (1976). Se toman 200 μL del
sobrenadante de las muestras centrifugadas y se agregó 1 ml del
reactivo de Bradford, para permitir el desarrollo del color la muestra se
incubó a temperatura ambiente por 5 min. La absorbancia de las
muestras se leyó a 595 nm contra un blanco preparado con 200 μL de
agua destilada más 1 ml de reactivo de Bradford.
El contenido de proteína se estimó a partir de la interpolación de las
lecturas en la curva patrón de proteína, la cual se obtuvo con una serie
de muestras de concentración entre 0 y 1 mg/L de seroalbumina.
Xilanasas
La actividad de xilanasas puede detectarse con base en la cantidad de
azúcares reductores del tipo xilosa liberados por la reacción de la
enzima con una solución de xilano ante condiciones específicas de pH
y temperatura. El xilano de abedul es ideal en una concentración de
0.5% (p/v) suspendido en amortiguador de citrato (50 mM, pH 5.3). La
xilosa liberada se cuantifica con precisión mediante el método
espectrofotométrico del ácido dinitrosalicílico (DNS) (Miller et al.,
1960).
A partir de lo anterior una unidad de xilanasas es la cantidad de enzima
que produce 1mol de azúcar reductor (expresado como equivalentes
de xilosa) por minuto (Mendicutti et al., 1997).

42
Es decir, necesitamos conseguir unidades de µmol de azúcar liberado/min.
Si se quiere la actividad específica, entonces será µmol de azúcar
liberado/min mg proteína.
La mezcla de reacción se preparó con 1.8 mL de sustrato y 0.2 mL de
extracto crudo enzimático (ECE), con lo que el ECE se diluyó 10
veces. Después se incubó a 50°C durante 5 minutos y posteriormente
se agregaron 3 mL de reactivo DNS para detener la reacción (XR).
como el ECE también puede contener xilosa libre, fue necesario hacer
un blanco para cada muestra, que se consiguió poniendo únicamente el
sustrato en las condiciones de reacción y después de agregar el reactivo
DNS se adicionó el ECE (XBM). Además, el xilano puede hidrolizarse
por las condiciones de incubación, lo que genera también respuesta
positiva a la reacción con DNS. Así, fue necesario hacer también un
blanco de sustrato que permitió cuantificar la xilosa liberada en este
caso (XBS).
El color se desarrolló hirviendo las muestras (XM, XBM y XBS) durante 5
minutos y poniéndolas inmediatamente en hielo. La absorbancia de las
muestras se leyó a 575 nm contra un blanco preparado sólo con 2 mL
del regulador y los 3 mL del DNS.
El cálculo de la actividad de cada ECE se obtuvo restando al contenido
de azúcares de XM el de XBM y XBS, que provenía de la interpolación de
las lecturas en la curva patrón de xilosa.

Ecuación 1
43
Para conocer los µmoles contenidos en M, BM y BS, se empleó la
siguiente ecuación:

Ecuación 2
La curva patrón de xilosa se obtuvo preparando diluciones de una
solución patrón de xilosa de concentración inicial 10 mM, cuyas
lecturas se muestran en la Tabla 1.

La relación lineal que existía entre la absorbancia y la concentración se

expresó en la Ecuación 3:

Ecuación 3
Lacasas
La actividad de lacasas puede detectarse con base en el efecto
fuertemente oxidante que tiene esta enzima sobre diversas sustancias de

44
composición química semejante a la lignina. Tal es el caso del 2-
Dimetoxifenol, conocido también como guayacol.
A partir de lo anterior, cuando se utilizó guayacol como el sustrato para
la reacción enzimática, una unidad de actividad de lacasas se definió
como la cantidad de enzima necesaria para oxidar una solución de
guayacol 10 mM ante las condiciones de incubación (Forchiassin,
2005).
Así, para cuantificar la actividad de lacasas en las muestras, se utilizó
una solución de guayacol 10 mM preparada en regulador de acetatos
100 mM pH 5. La mezcla de reacción se preparó adicionando 0.05 mL
de muestra a 0.950 ml de la solución de guayacol, con lo que se
consideró que la enzima contenida en la muestra fue diluida 20 veces.
Esta mezcla se incubó a temperatura ambiente durante diez minutos,
registrando inmediatamente la densidad óptica de la misma a 470 nm
(L1).
Cuando la muestra contenía actividad de lacasas generaba un
incremento considerable en la densidad óptica de la mezcla de reacción,
debido a la oxidación del guayacol. Hay que tomar en cuenta que el
guayacol es un compuesto que puede ser oxidado también por efecto
del oxigeno del aire, por lo que para descartar dicho efecto, se preparó
un control, en el cual se mezclaban 0.05 mL de agua en vez de muestra
con la solución de guayacol. Como sucedió con las muestras, este
blanco se incubó también a temperatura ambiente durante 10 min y se
registró la densidad óptica resultante a 470 nm (L0).
Debido a la naturaleza química del guayacol, no es posible preparar una
curva patrón de guyacol oxidado. Sin embargo, recordemos que la

45
densidad óptica de una muestra a cierta longitud de onda es
proporcional a la cantidad total de material que absorbe la luz incidente
con base en tres componentes: las propiedades del material absorbente
relacionadas con la longitud de onda a la que se realiza la medición,
conocido como coeficiente de extinción molecular o absortividad
molar (ξ), la longitud de la trayectoria que la luz atraviesa por la muestra
b y la concentración del material que absorbe la luz c, según lo establece
la Ley de Lambert y Beer:

Ecuación 4
Los valores que toma ξ dependen de la longitud de onda a la que se
lleve a cabo la medición (Rubinson & Rubinson, 2000). Así, el valor del
coeficiente de extinción molar del guayacol oxidado a 470 nm es ξ470 nm
= 26600 M-1cm-1 (Forchiassin, 2005). La longitud de la trayectoria de la
luz que atraviesa por la muestra b se refiere al ancho de la celda con la
que se hace la medición. Este valor se expresa en cm, y depende de la
celda utilizada para la medición. En este caso específico b = 1 cm.
A partir de lo anterior, la concentración del guayacol oxidado se pudo
conocer mediante un simple despeje:

Ecuación 4a
Entonces, para conocer la actividad de lacasas que contiene nuestra
muestra, se empló la siguiente fórmula:

46
 Ecuación 5
Donde:

METODOLOGÍA PARA LA GENERACIÓN DE

RESULTADOS
En esta sección se describe a detalle los cálculos que se realizan al
analizar un experimento de producción de enzimas en fermentación de
sustrato sólido.
Xilanasas
Para analizar el contenido de xilanasas de los ECE, se obtuvieron tres
lecturas: la del blanco de muestra (BM) y las de la muestra (Ma y Mb),
además de una general, que correspondía al blanco de sustrato (BS =
0.008). Las lecturas obtenidas se muestran en la Tabla 2.

47
 Tabla 2. Lecturas obtenidas durante la fermentación sólida
de P. chrysosporium sobre bagazo de caña

Veamos la forma de calcular la actividad a partir de los datos.

Tomaremos para ello los valores correspondientes a las muestras de las
24 h. Así, al sustituirlos en la ecuación 2 tenemos:

48
Los valores obtenidos se resumen en las columnas 2 a 4 de la Tabla 3.
Regresando a la Ecuación 1 para sustituir estos valores, se tiene:

Los valores obtenidos se muestran en las columnas 5 y 6 de la Tabla 3.

Para reportar los resultados es necesario obtener el promedio ± la
desviación estándar (DE) de ambas muestras. A partir de lo anterior, en
la columna 7 de la Tabla 3 se muestran las actividades promedio de
xilanasas que se obtuvieron a lo largo del cultivo:
Tabla 3. Cálculo de la actividad de xilanasas contenidas en las
muestras obtenidas durante la fermentación sólida de P.
chrysosporium sobre bagazo de caña

49
Cuantificación de la actividad de lacasas
En lo que respecta a la actividad de lacasas, luego de seguir la
metodología descrita en la sección correspondiente, se obtuvieron tres
lecturas: la del blanco (correspondiente al guayacol oxidado por las
condiciones ambientales, L0) y las de la muestra (L1a y L1b), mismas
que se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4. Lecturas de guayacol oxidado obtenidas por acción de las
muestras provenientes de la fermentación sólida de
P. chrysosporium sobre bagazo de caña

Veamos la forma de calcular la actividad a partir de los datos.

Tomaremos para ello los valores correspondientes a las muestras de las
24 h. Así, al retomar las ecuaciones 5a y 5b tenemos:

50
Los valores obtenidos al realizar estos cálculos se muestran en las
columnas 2 a 4 de la Tabla 4. Cuando estos valores se sustituyen en la
Ecuación 5, se tiene:

51
Los resultados de dichos cálculos se muestran en las columnas 5 y 6 de
la Tabla 5. Como en el caso de las xilanasas, para reportar los
resultados es necesario obtener el promedio ± la desviación estándar de
ambas muestras. A partir de lo anterior, vemos en la columna 7 de la
Tabla 5 las actividades de lacasas que se obtuvieron a lo largo del
cultivo:
Tabla 5. Cálculo de la actividad de lacasas en las muestras obtenidas
durante la fermentación sólida de P. chrysosporium sobre
bagazo de caña

Expresión de actividades específicas.

Es común reportar los resultados de la actividad enzimática producida
durante un cultivo sólido con base en la cantidad de sustrato inicial,
cuando se desea conocer el rendimiento enzimático de dicho sustrato
en el sistema de cultivo. Aunque también se pueden reportar con base
en la cantidad de proteína contenida en el ECE, como una forma de
estandarización cuando se desea comparar los datos del cultivo con los
de otros generados ante diferentes condiciones de operación.
Recordemos que en este caso los ECE se obtuvieron a partir de 0.5 g
de bagazo de caña. Regresemos a los datos que tenemos a las 24 h. Si
52
queremos expresar los resultados con base en los g de sustrato inicial,
bastaría con dividir las actividades entre el valor correspondiente:

Para reportar los valores con base en la cantidad de proteína, la

operación involucraría al contenido de proteína en el ECE del tiempo
correspondiente, mismo que se muestra en la Tabla 6. En este caso, los
cálculos para las 24 h de cultivo serían:

Entonces, los resultados expresados como actividad específica se

muestran en la Tabla 6:

53
Tabla 6. Actividades específicas de xilanasas y lacasas expresadas con
base en 1 g de sustrato utilizado en el cultivo o en los g de proteína del
ECE en cada tiempo

* Este dato está expresado en mU/g de sustrato

Los reportes de este tipo de experimentos muestran los resultados en

una gráfica, que se construye a partir de los datos que se calcularon.
Así, tomando los valores calculados en las tablas 1-6, se generaron las
gráficas presentadas en la Figura 1.

54
Figura 1. Producción volumétrica (A), específica por g de sustrato (B) y
por g de proteína (C) de las lacasas () y xilanasas () por
Phanerochaete chrysosporium en fermentación sólida

55
 CONCLUSIONES
A partir de la información revisada en este trabajo aprendimos que la
metodología empleada para cuantificar las actividades depende, en
primera instancia, de la reacción que cataliza la enzima, y de la facilidad
de cuantificación del sustrato residual o del producto liberado. En este
caso, cuantificamos primero una actividad hidrolítica evaluando la
cantidad de producto liberado por acción de la enzima sobre su
sustrato. Para ello, fue necesario comparar los resultados con una curva
patrón. Por otra parte, aunque para cuantificar la actividad de la enzima
oxidativa también se evaluó el producto obtenido en la reacción, la
naturaleza química de éste obligaba al uso de la ecuación de Lambert-
Beer, empleando el coeficiente de extinción molar.
Además de revisar las fórmulas para el cálculo, hay que recordar que el
reporte de los resultados dependerá del objetivo para el que se
diseñaron los experimentos. Así, se revisó con detenimiento la forma
de reportar las actividades enzimáticas referidas al volumen de ECE, a
la cantidad de sustrato inicial que dio origen al ECE, o a la cantidad de
proteína del ECE.
Por último, se mostró que los resultados pueden ser presentados de
diversas formas, que dependen también del objetivo que tuvo el
experimento analizado. Aquí se revisaron dos de las modalidades más
empleadas para reportar actividades enzimáticas: las tablas y las
gráficas. Sin embargo, hay recordar que la presentación de los
resultados en un reporte debe ser clara y concisa, por lo que habrá que
elegir de entre los dos modelos (tablas o gráficas) el material que
cumpla con ambas características.

56
 REFERENCIAS
Bradford Marion. (1976): A rapid and sensitive method for the
quantitation of microgram quantities of protein utilizing the
principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72: 248-
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Miller, G. L.; Blum; R.; Glannon, W. E. & Burton, A.L. (1960).
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59
 Capítulo 3
DEGRADACIÓN MICROBIANA DE
HIDROCARBUROS

Manuel Alejandro Lizardi-Jiménez*

Universidad Politécnica de Pachuca, Carretera Pachuca-Cd. Sahagún,
km 20, Ex-Hacienda de Santa Bárbara, Municipio de Zempoala
Hidalgo.
*Autor para correspondencia: chamarripas@yahoo.com.mx

Palabras clave: hidrocarburos, degradación, microorganismos

CONTAMINACIÓN POR HIDROCARBUROS

Debido a la necesidad energética global, el sector petrolero ha crecido
de manera acelerada (González, 2009). En México se reconoce la
presencia de ductos de petróleo y tuberías de gas, entre otros, que
atraviesan por toda la República Mexicana (Orozco, 2010); con
frecuencia estos ductos están deteriorados y se producen derrames
(Schmidt-Etkin, 2010). El deterioro que resulta en agua y suelos ha
llegado a ser evidente en los años recientes; la explotación de pozos
petroleros, derrames no controlados así como procedimientos
inadecuados de disposición final de hidrocarburos de petróleo, son
algunas causas frecuentes de este deterioro (Saval, 2000). El petróleo
derramado en agua y suelo es susceptible a los procesos microbianos de
degradación (Lizardi-Jiménez et al.., 2009) generando un gran interés
industrial y de investigación por el desarrollo de tecnologías capaces de
recuperar agua y suelos contaminados con petróleo tales como la
excavación y confinamiento, extracción con vapor, estabilización y
solidificación, lavado de suelos, precipitación química, vitrificación,

60
incineración, entre otras (Skladany & Metting, 1993). Muchos de estos
tratamientos no destruyen a los hidrocarburos contaminantes sino que
los transfieren de un lugar a otro, además de que algunos de estos
métodos son costosos y generan subproductos en ocasiones más
tóxicos que requieren tratamientos posteriores. La alternativa
biotecnológica presentada en este capítulo se refiere al uso de
consorcios microbianos degradadores de petróleo, alternativa que no
tiene estas desventajas.
CONSUMO MICROBIANO DE HIDROCARBUROS
Algunas de las opciones biotecnológicas más comunes relacionadas con
la biorremediación de aguas y suelos contaminados por petróleo y sus
derivados se basa en el uso de microorganismos. Se ha reportado que el
contacto directo con los contaminantes del petróleo actúan como una
presión selectiva que elige a los consorcios con mayor capacidad
degradadora dentro de una comunidad microbiana nativa (Röling et al.,
2002) mejorando la eficiencia de remoción del petróleo en suelos y la
limpieza y descontaminación de efluentes acuosos (Gargouri et al.,
2011).
Los consorcios microbianos degradadores de hidrocarburos pueden ser
aislados de las raíces de algunas plantas que crecen de manera natural
en sitios contaminados con petróleo, ya que el microambiente que se
desarrolla en la rizósfera de estas plantas promueve el crecimiento de
poblaciones microbianas que han demostrado ser eficaces degradadoras
(Díaz-Ramírez et al., 2003).

61
I) Consumo por contacto directo
La adhesión de las células a las gotas de hidrocarburos puede minimizar
la distancia de difusión y facilitar la difusión de los sustratos
hidrofóbicos al interior de las células microbianas. La alta
hidrofobicidad celular es un prerrequisito para la remoción de alcanos
por contacto directo.
II) Consumo vía formas emulsificadas
La emulsificación consiste en el incremento del área superficial de la
fase de los hidrocarburos mediante la formación de gotas
microscópicas en emulsiones estables. Al parecer el consumo de las
formas emulsificadas es preponderante sobre el contacto directo
(Medina-Moreno et al., 2013).
RUTAS MICROBIANAS DE DEGRADACIÓN DE
HIDROCARBUROS
Los hidrocarburos derivados del petróleo pueden ser divididos en
cuatro clases de acuerdo a su estructura y configuración molecular:
 Alifáticos.
 Aromáticos.
 Asfaltenos: fenoles, ácidos grasos, cetonas, ésteres y porfirinas.
 Resinas: piridinas, quinoles, carbazoles, sulfóxidos y amidas.
La creciente utilización de hidrocarburos en actividades cotidianas
deriva en un constante problema de contaminación. Sin embargo
existen microorganismos que han desarrollado la capacidad de degradar
este tipo de compuestos, siendo este un método práctico que pudiera
ser eficaz para disminuir el problema en los sitios contaminados. La
extraordinaria versatilidad de las bacterias para utilizar diferentes
62
hidrocarburos como única fuente de carbono y de energía se evidenció
debido a su potencial para oxidar diferentes compuestos xenobióticos.
Estos compuestos son de origen natural o químicamente sintetizados
por las actividades humano-industriales, sin embargo, diariamente son
descargados al medio ambiente, generando un gran problema de
contaminación.
La presencia de los compuestos aromáticos en la biosfera a través de la
historia, explica por qué los microorganismos han desarrollado
diferentes vías metabólicas usando estos compuestos como un sustrato
y una fuente de energía para su crecimiento, consiguiendo así que una
gran variedad de microorganismos puedan mineralizar los compuestos
de interés (Widdel & Rabus, 2001).
Para tratar de disminuir la contaminación de estos compuestos
aromáticos se han empleado bacterias que utilizan una amplia variedad
de rutas catabólicas. Por tanto, la biodegradación es definida como el
proceso mediante el cual los microorganismos transforman o alteran la
estructura química de los contaminantes en el ambiente mediante
reacciones de óxido-reducción. Este es un proceso complejo que
depende de la estructura molecular y de la concentración de los
hidrocarburos en los sitios contaminados.
Se conocen varios factores que inciden en la degradación de los
hidrocarburos pero uno de los más importantes es su baja
biodisponibilidad para los microorganismos, ésta se define como el
grado de interacción de los compuestos o contaminantes con los
microorganismos (Harms et al., 2010). Por lo que los hidrocarburos del
petróleo difieren entre sí por su susceptibilidad al ataque microbiano en

63
función de la complejidad estructural del hidrocarburo y el orden es el
siguiente:
Alcanos lineales> alcanos ramificados> aromáticos pequeños> ciclo
alcanos> hidrocarburos aromáticos policíclicos
Cabe destacar que los hidrocarburos de alto peso molecular,
generalmente, HAPs no son completamente mineralizados. Mientras
que los alcanos al ser hidrocarburos saturados y también estar entre los
principales constituyentes del petróleo (20-25%) son degradables de
manera más eficaz (Tzintzun–Camacho, 2012).
En la Figura 1 se presentan, de manera breve y general, los sistemas
que utilizan los microorganismos para degradar los diferentes tipos de
hidrocarburos. Algunos microorganismos son capaces de formar o
“sintetizar” biomasa utilizando al oxígeno como aceptor final de
electrones en reacciones de óxido-reducción (quimíotrofos aeróbicos)
mediante las cuales degradan o consumen hidrocarburos. Otros en
cambio utilizan aceptores finales de electrones distintos (quimíotrofos
anaérobicos). Estos dos tipos de microorganismos generan bióxido de
carbono como producto final de la degradación. Finalmente, otro
grupo de microorganismos son capaces de incorporar el bióxido de
carbono para la formación de biomasa (anoxigénica fotótrofa).

64
 Figura 1. Sistemas que utilizan los microorganismos para degradar
hidrocarburos

HIDROCARBUROS ALIFÁTICOS EN PRESENCIA DE

OXÍGENO
La Figura 2 muestra la ruta de la oxidación terminal (oxidación de un
carbono terminal) de los alcanos y la ruta de la oxidación subterminal
(oxidación de un carbono subterminal). Los alcanos de cadena corta
son metabolizados también por una oxidación subterminal, donde el
alcohol secundario se transforma a una cetona, para después ser
oxidada por una monooxigenasa del tipo Baeyer-Villiger (aquella que
oxida una cetona para obtener un éster). El éster es hidrolizado por una
esterasa a un alcohol y a un ácido graso. En algunos casos ambos
extremos del alcano son oxidados y se produce un ácido dicarboxílico,

65
generalmente esta reacción se lleva a cabo en levaduras y bacterias
(Tzintzun–Camacho, 2012).

Figura 2. Principales rutas metabólicas en la degradación de alcanos

La mayoría de los microorganismos que son capaces de sobrevivir en

presencia de oxígeno podrían degradar hidrocarburos de cadena larga
sin problemas. Por lo que podemos afirmar que los microorganismos
que son capaces de degradar alcanos primero deben de oxidar el último
carbono de la molécula con ayuda del complejo multienzimático que
no hacen más que incorporar una molécula de oxígeno. Así se obtiene
un hidrocarburo con un grupo alcohol el cual es más reactivo.
Mediante otras enzimas este grupo alcohol se oxida hasta aldehído y
finalmente a un ácido carboxílico. Así se obtiene una molécula similar a
66
un ácido graso y puede ser degradado a acetil-CoA por β-oxidación.
Este proceso de oxidación también puede darse en carbonos no
terminales dando lugar a dos ácidos grasos que se procesarán por β-
oxidación como se muestra en la Figura 3 (Ashraf et al., 1994) en dónde
el alcano se oxida a alcohol secundario para sufrir una
deshidrogenación a metilcetona, ésta se oxida a acetil éster para
producir ácido acético y un alcohol primario. El ácido acético entra a β-
oxidación y el alcohol primario se oxida primero a aldehído y luego a
ácido carboxílico que entra a su vez a β-oxidación. El género con más
posibilidades y el más estudiado en el campo es Pseudomona.

Figura 3. Oxidación de alcanos a ácidos carboxílicos para su ingreso a

la β-oxidación hidrocarburos
67
 HIDROCARBUROS AROMÁTICOS
El principal problema para degradar los hidrocarburos aromáticos es
romper el anillo bencénico. Los microorganismos que utilizan estos
compuestos aromáticos como fuente de carbono, utilizan rutas
bioquímicas llamadas vías altas o periféricas que consisten en modificar
los diferentes anillos aromáticos absorbidos en protocatecuate y catecol
en lugar de usar monooxigenasas específicas para cada tipo de
compuesto.

Figura 4. Ruta metabólica de vías bajas

68
Es decir, la gran variedad de compuestos aromáticos que se pueden
encontrar son modificados y convertidos a estas dos moléculas; a partir
de estas dos moléculas en donde convergen todos los compuestos, se
puede llevar a cabo el rompimiento del anillo mediante enzimas
específicas. Esta segunda fase en la degradación se conoce como vías
bajas (Figura 4).
Se han diseñado distintos procesos para llevar a cabo la remoción de
compuestos aromáticos, algunos tales como: métodos físicos
(adsorción por carbón activado), químicos (por extracción con
solventes, oxidación química) y biológicos (utilizando microorganismos
aerobios y/o anaerobios) (Shan-Gen, 2002). Los procesos
microbiológicos, por su versatilidad bioquímica y molecular así como
por razones de protección ambiental, son la mejor alternativa para la
remoción de los compuestos aromáticos, ya sea en condiciones
aerobias o anaerobias (Tabla 1) (Kleerebezem et al., 1999).
Tabla 1. Comparación de los procesos aerobios y anaerobios en la
degradación de compuestos aromáticos

69
 CATABOLISMO AEROBIO DE COMPUESTOS
AROMÁTICOS
En los procesos aerobios, la remoción de los compuestos aromáticos
puede llevarse a cabo por hongos, actinomicetos y bacterias que
contienen mono o di-oxigenasas, utilizando el oxígeno para la
activación y ruptura del anillo aromático. El oxígeno sirve también
como aceptor final de electrones para la oxidación completa de estos
compuestos. Sin embargo, la disminución del oxígeno disuelto de los
sitios contaminados limita la biodegradación del benceno, tolueno,
etilbenceno y xileno (BTEX) (Grbic-Galic & Vogel, 1986).
Las enzimas (mono-oxigenasas y di-oxigenasas), llevan a cabo el primer
paso que es la activación para la conversión de los compuestos
aromáticos. Posteriormente, los compuestos son transformados a un
número ilimitado de productos intermedios como son protocatecuate y
catecol (Figura 5).
La ruptura del catecol es catalizada por la 1, 2 dioxigenasa y la del
protocatecuate por la 3,4 di-oxigenasa, convirtiéndolos en piruvato o
acetaldehído. Cuando el anillo del catecol o protocatecuate se rompe en
su posición meta u orto, se convierten a β-cetoadipato. Dos pasos
adicionales completan la conversión de β-cetoadipato a productos
intermedios del ciclo de los ácidos tricarboxilicos.

70
 Figura 5. Formación de protocatecuate en condiciones aerobias y
degradación a succinil-CoA y acetil CoA

Si el anillo se rompe en su posición para, se convierte en piruvato o

acetaldehído y entran directamente al ciclo de los ácidos tricarboxilicos
(Heinaru et al., 2000). Los estudios filogenéticos de la secuencia de
aminoácidos de las proteínas relacionadas con la biodegradación de los
BTEX demostraron una alta similitud en sus secuencias, lo cual indica
que estas proteínas provienen de un gen ancestral común.
71
 CATABOLISMO ANAEROBIO DE COMPUESTOS
AROMÁTICOS
Algunas bacterias mencionadas como nitrato- y sulfato- reductoras
(Thauera aromática y Rhodopseudomonas palustris) así como fototróficas, han
sido estudiadas para establecer las vías metabólicas. Para que un
compuesto pueda ser utilizado como nutriente y degradado a través de
una ruta catabólica es necesario que exista un mecanismo de
introducción de los compuestos aromáticos hacia el interior de la célula
bacteriana.
El transporte de las moléculas a través de la membrana bacteriana
puede ocurrir mediante tres procesos diferentes: difusión simple,
difusión facilitada y/o transporte activo por medio de la proteína
permeasa. El transporte activo como bien se sabe se realiza en contra
del gradiente de concentración con intervención de la permeasa. Esta
enzima presenta alta especificidad por el sustrato y es capaz de
introducir en la célula dichos compuestos. Sin embargo, los
compuestos aromáticos primero deben de ser activados antes de ser
introducidos a la célula, por ejemplo la deshidrogenación mediante la
etilbenceno deshidrogenasa (Figura 6).

72
 Figura 6. Incorporación de los compuestos aromáticos al catabolismo
celular

En la degradación de los hidrocarburos se han estudiado dos rutas, la

vía del fumarato y la vía del Benzoil CoA:
Vía del fumarato. En esta vía se adiciona el fumarato a los
compuestos aromáticos como paso inicial para la activación del
proceso catabólico, mismo que es llevado a cabo por la enzima benzoil
succinato sintetasa, homologa a la enzima benzoil CoA ligasa. Sin
embargo, otras reacciones alternas dependen del aceptor de electrones
utilizado o del tipo de compuesto que se degrada (Chakraborty &
Coates, 2004).

73
Vía del Benzoil CoA
I. Activación de la reacción: los compuestos aromáticos son
activados con sustituyentes como el grupo carboxil (carboxilación),
metil (metilación) o hidroxil (hidroxilación) (Figuras 6 y 7). Las enzimas
que llevan a cabo esta reacción son hidroxilasas y la benzoil CoA ligasa,
respectivamente. Por último, los productos son incorporados al
material celular.

Figura 7. Reacciones de activación de hidrocarburos aromáticos para

su degradación por la vía del benzoil CoA

74
II. Metabolismo periférico: en esta etapa se lleva a cabo la reducción
del anillo aromático por la benzoil CoA reductasa. El benzoato CoA es
el producto intermedio de mayor relevancia. También se forman
fluoroglucinol y resorcinol.
III. Metabolismo central: reacción de β oxidación (reacción final que
produce acetil CoA o ácidos grasos volátiles). Después de la formación
del producto intermedio, el anillo del benzoato o benzoil CoA es
degradado por medio de dos vías:
a. Vía pimílica: algunas bacterias reutilizan la CoA para pimelil
CoA. En algunos casos este se utiliza para producir ácidos grasos
volátiles o acetil CoA. Por último la acetil CoA entra al ciclo del ácido
cítrico. Está vía es utilizada por bacterias sintróficas.
b. Vía adípica: los productos finales son convertidos hasta ácidos
grasos. Para las reacciones posteriores se requiere de una asociación
sintrófica (sintrofía, en el contexto del metabolismo microbiano, se
refiere a la colaboración de varias especies para realizar una reacción
química que, de otra forma, sería desfavorable energéticamente). entre
las acetogénicas (productoras de hidrogeno y acetato), las
metanogénicas (hidrogenotróficas o acetoclásticas) y/o nitrato- sulfato-
reductoras. Estas bacterias llevan al acetato y al hidrógeno a productos
metabólicos comunes como CO2, CH4 y H2S.

75
 BIORREMEDIACIÓN MICROBIANA
Para algunas de las opciones biotecnológicas relacionadas con la
biorremediación de aguas y suelos contaminados por petróleo, la
alternativa se basa en el uso de microorganismos.
El contacto directo con los contaminantes del petróleo selecciona a los
consorcios con mayor capacidad degradadora dentro de una
comunidad microbiana nativa (Röling et al., 2002), mejorando la
eficiencia de remoción del petróleo en suelo y efluentes acuosos
(Gargouri et al., 2011). Los consorcios microbianos degradadores de
hidrocarburos pueden ser aislados de las raíces de algunas plantas que
crecen de manera natural en sitios contaminados con petróleo, ya que
el microambiente que se desarrolla en la rizósfera de estas plantas
promueve el crecimiento de poblaciones microbianas que han
demostrado ser eficaces degradadoras. Tzintzun-Camacho et al. (2012),
cultivaron un consorcio constituido por: Xanthomonas sp, Acinetobacter
bouvetii, Shewanella sp y Defluvibacter lusatiensis y enfatizaron que la
dinámica de poblaciones y la interrelación entre las cepas
constituyentes confieren a los consorcios una cierta capacidad especial
para degradar hidrocarburos, en su caso hexadecano (HXD). Una de
las cepas al poseer el gene que codifica para la síntesis de la enzima
alcano monooxigenasa, alk-B (Xanthomonas sp), degradó el 46 % del
HXD inicial y otra de las cepas del consorcio (Acinetobacter bouvetii)
produjo un bioemulsificante que favoreció el consumo de HXD (72%).
El HXD es un sustrato de baja solubilidad en agua (~10-7 mg/L) que
puede presentarse en formas libres (gotas macroscópicas y soluble) y/o
en formas emulsificadas (microgotas) (Mehrnia et al., 2005), siempre y

76
cuando se encuentre en presencia de agentes emulsificantes, con lo que
aumenta su concentración en la fase acuosa (62 mg/L) (Lizardi-
Jiménez et al., 2012) y con esto su biodisponibilidad. Una vez
biodisponible, el HXD es una fuente de carbono y energía para
muchos microorganismos tanto en cultivos puros (Pepi et al., 2005)
como como en los consorcios microbianos (Medina-Moreno et al.,
2005). La biodegradación de HXD usualmente requiere la cooperación
de varias especies microbianas, con diferentes capacidades metabólicas,
de este modo el uso de consorcios microbianos produce un aumento
en la tasa de consumo de los hidrocarburos (Ghazali et al., 2004). En
los consorcios, algunas cepas poseerían el genotipo para degradar
hidrocarburos y otras la capacidad de producir biosurfactantes
(Saravanan et al., 2009). En un trabajo de investigación (Lizardi-Jimenez
et al., 2012) se utilizó al HXD como molécula modelo de fácil
seguimiento en el laboratorio. Este hidrocarburo alifático posee un
peso molecular de 226 g/mol, un punto de ebullición 151 oC y una
densidad relativa de 0.773 ensayando con un consorcio constituido por
cinco cepas bacterianas: Achromobacter (Alcaligenes) xylosoxidans, Bacillus
cereus, Bacillus subtilis, Brevibacterium luteum y Pseudomonas pseudoalcaligenes se
utilizó hexadecano (HXD) como única fuente de carbono, para la
producción de biomasa microbiana degradadora de petróleo en un
biorreactor de columna de burbujas; sin embargo, aunque los niveles de
producción (medidos como gramos de consorcio por litro de reactor)
fueron mejorados con respecto a trabajos previos (Medina-Moreno et
al., 2005) el rendimiento y la productividad se vieron disminuidas aun
con un pequeño cambio de escala del biorreactor (de 0.5 a 10 L), es

77
decir, la producción con fines industriales de los consorcios
microbianos degradadores de petróleo se ve limitada en este tipo de
biorreactores neumáticos. Es posible que otro biorreactor del tipo
neumático i.e. airlift, con distintas características hidrodinámicas y de
transferencia de masa corrija estas deficiencias.
BIORREACTORES AIRLIFT COMO ALTERNATIVA DE
BIORREMEDIACIÓN
Un biorreactor airlift (BAL) es un equipo agitado neumáticamente que
se caracteriza porque el suministro de energía para mantener
homogeneidad en su interior tiene lugar mediante la expansión
isotérmica de la fase gaseosa introducida (Chisti, 1989). Los BAL tienen
amplias ventajas sobre los demás biorreactores; la ventaja principal
sobre los biorreactores de columna de burbujas y los tanques agitados
es que producen un menor daño celular, aceptan mayores tasas de
aireación y menores costos energéticos (Chisti & Jáuregui-Haza, 2002).
En los BAL, la fluidización de sólidos no es una consecuencia directa
del burbujeo del gas sino que es debida a la circulación del líquido
dentro del biorreactor. Debido a lo anterior, estos equipos ofrecen la
posibilidad de una fluidización de sólidos muy simple, de alta eficiencia
y permiten establecer ambientes internos con esfuerzos de corte
aproximadamente constantes en todo el contenido del biorreactor.
Esto se debe a que la distribución de la energía suministrada para
agitación y mezclado se realiza por expansión del gas inyectado y no se
transfiere mediante la energía cinética de una propela en movimiento;
por lo que se evitan cambios morfológicos y metabólicos en las células
de cultivo (Chisti & Jáuregui-Haza, 2002). Con respecto a las columnas

78
de burbujas las ventajas son: mayores capacidades de transferencia de
masa, mayores velocidades superficiales de líquido y gas, y los patrones
de flujo bien definidos que se obtienen en ellos (Chisti, 1989).
Los BAL se han utilizado ampliamente para la producción en escala
industrial de proteína unicelular desde hace casi tres décadas y de
levaduras desde hace más de una. El número de aplicaciones de los
BAL en tecnologías de biorremediación ambiental se ha incrementado,
generando un nicho en bioprocesos que requieren alta transferencia de
oxígeno, bajos consumos de potencia y agitación no mecánica (Kilonzo
et al., 2006). La hidrodinámica y la transferencia de masa de un BAL
dependen fuertemente de su configuración geométrica.
Existen dos configuraciones básicas de los BAL (Chisti, 1989):
circulación externa y circulación interna (Figura 8). El BAL con
circulación externa presenta al menos un “loop” o brazo de descenso
con un diámetro generalmente menor que el del cuerpo principal del
biorreactor, por otro lado el de circulación interna posee un tubo
concéntrico que separa el cuerpo principal del biorreactor. En los dos
casos, circulación externa e interna se distinguen cuatro zonas que
permiten la recirculación del líquido en el biorreactor. La primera zona,
en la que el gas se suministra, se conoce como la zona de ascenso que
exhibe los coeficientes de retención de la fase gaseosa (εg) más altos en
el biorreactor; en esta zona ocurre la mayor parte de la transferencia de
oxígeno desde la fase gaseosa a la fase líquida. El líquido que circula en
el BAL entra en una zona de liberación de los gases que funciona como
un separador gas-líquido. El líquido libre de gas fluye entonces hacia la
zona de descenso y viaja hacia el fondo de la columna, en donde

79
completa el ciclo y reingresa a la zona de ascenso. Esta circulación se
deriva de un efecto causado por la diferencia entre los εg de la zona de
ascenso y descenso y está determinada, entre otras cosas, por las
relaciones geométricas en el diseño del BAL.

Figura 8. Configuraciones de BAL: circulación interna (A)

y externa (B)

Tradicionalmente los BAL han sido estudiados desde la perspectiva del

modelo bifásico, en donde una fase líquida continua (generalmente
agua) y una fase gaseosa discontinua (generalmente aire) son las únicas
presentes. En el modelo bifásico el único fenómeno de transferencia de
masa que se considera usualmente es el del oxígeno desde la burbuja de
aire hasta el seno de la fase líquida, dado que el oxígeno tiene una
solubilidad en agua (~6.6 mg/L) mucho menor que la de los otros
sustratos hidrosolubles (por ejemplo glucosa, 910 g/L a 25°C). Sin

80
embargo, cuando el bioproceso de interés incluye una fase líquida con
baja solubilidad en agua (~10-7 mg/L) como en el caso de la
biodesulfuración del petróleo (Shariati et al., 2007), en la producción de
consorcios degradadores de petróleo (Medina- Moreno et al., 2005) o
para el tratamiento de aguas con nanocontaminantes (Tang et al., 2004)
el modelo bifásico no es suficiente para considerar la doble
transferencia de masa, de HXD y de oxígeno, para lo cual se recurre al
modelo trifásico.
Si se considera que el consumo de hidrocarburos se lleva a cabo
principalmente por la vía de la emulsificación del hidrocarburo libre se
pueden distinguir entonces tres etapas críticas: (i) el transporte de los
hidrocarburos de la fase orgánica a la fase acuosa, (ii) el transporte de
oxígeno de la fase gaseosa a la fase acuosa y (iii) el consumo de los
hidrocarburos y oxígeno por parte de los microorganismos que, en su
mayoría, residen en la fase acuosa. Por lo tanto, las tasas de
transferencia de masa y de consumo son parámetros fundamentales
que determinan el diseño y la operación exitosa del biorreactor que será
utilizado en procesos aerobios de biodegradación de hidrocarburos
(Quijano, 2009). Si por otra parte, se considera que el consumo de los
hidrocarburos puede llevarse a cabo por contacto directo con las gotas
macroscópicas de hidrocarburo y de la pequeña fracción del
hidrocarburo soluble, la consideración de este fenómeno no implica
una limitación en la transferencia de masa, es decir el contacto directo
no impone otra limitación adicional a la que supone el proceso de
emulsificación (proceso en donde un líquido se dispersa en otro en
forma de pequeñas gotas). Para los dos casos, contacto directo y

81
emulsificación, es siempre el área de las gotas macroscópicas la que se
considera para estimar las tasas de transferencia de hidrocarburo.
Es por las razones anteriores que los biorreactores airlift se perfilan
como una de las mejores alternativas para el cultivo de cepas puras o
consorcios microbianos, ya que reducen el daño celular y poseen
efectivas tasas de transferencia de masa y oxígeno.
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 Capítulo 4
EL PAPEL DE LOS BIOSURFACTANTES EN LA
BIORREMEDIACIÓN DE SITIOS
CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS

Olivia Tzintzun-Camacho*
Planta de Biotecnología, Química Agronómica de México, S. de R.L. de
C.V., Calle 18, No. 20501, Colonia Impulso, C.P. 31183, Chihuahua,
Chihuahua, México.
*Autor para correspondencia, correo electrónico: oliviatc@gmail.com

Palabras clave: biosurfactantes, bioemulsificantes, biodisponibilidad,

hidrocarburos, biorremediación.

INTRODUCCIÓN
El petróleo es una mezcla compleja de hidrocarburos que se libera
continuamente al ambiente debido al mal manejo durante su proceso
de extracción, procesamiento y transporte, ocasionando graves
problemas de contaminación (Manilla-Pérez et al., 2010). Por
consiguiente se han investigado y desarrollado tecnologías que faciliten
la eliminación de los hidrocarburos. Una alternativa amigable con el
medio ambiente es la biorremediación, al emplear biosurfactantes y
microorganismos productores de biosurfactantes para la degradación
de los contaminantes, debido al aumento en la solubilidad de los
hidrocarburos (Pacwa-Płociniczak et al., 2011). Cabe destacar que el
principal factor que limita la degradación de los hidrocarburos es la baja
biodisponibilidad de las fracciones del petróleo (Ron & Rosenberg,
2002). Por lo tanto, los microorganismos degradadores de
hidrocarburos producen biosurfactantes para incrementar el área de
superficie de los compuestos insolubles en agua, aumentar su
87
biodisponibilidad y la tasa de biorremediación (Ron & Rosenberg,
2002; Kuiper et al., 2004).
Los biosurfactantes son compuestos de superficie (tensoactivos)
producidos por una variedad de bacterias, levaduras y hongos
filamentosos (Chen et al., 2007; Cameotra & Makkar, 2010), los cuales
pueden emplear como sustratos carbohidratos, aceites y residuos
agroindustriales. Los biosurfactantes poseen una porción hidrofóbica e
hidrofílica, y tienen la propiedad de disminuir la tensión superficial e
interfacial del medio de cultivo (Al-Araji et al., 2007; Cameotra &
Makkar, 2010). La porción hidrofóbica de los biosurfactantes está
constituida por cadenas largas de ácidos grasos, hidroxiácidos o α-
alquil-β-hidroxiácidos. Mientras que la porción hidrofílica está
compuesta por carbohidratos, aminoácidos, péptidos cíclicos, fosfatos,
ácidos carboxílicos o alcoholes (Mulligan, 2005). La naturaleza anfifílica
de los biosurfactantes favorece la disminución de la tensión superficial
del agua de 72 milinewton por metro (mN/m) hasta 27 mN/m
(Christofi & Ivshina 2002). La tensión superficial es definida como la
entalpía libre en la superficie por unidad de área (OECD 1995), y esta
fuerza actúa sobre la superficie de un líquido para minimizar el área de
la superficie. Debido a las propiedades de superficie de los
biosurfactantes, estos compuestos se acumulan en las interfases y
pueden formar micelas disminuyendo la tensión superficial e
incrementando la solubilidad de compuestos insolubles (Kuiper et al.,
2004). Cabe destacar que los biosurfactantes se caracterizan por ser
excelentes agentes emulsificantes, espumantes y dispersantes (Desai &
Banat, 1997). En comparación con los surfactantes químicos, los

88
biosurfactantes presentan varias ventajas: son biodegradables,
altamente selectivos, activos a condiciones extremas de pH,
temperatura y salinidad. Así mismo, pueden ser producidos a partir de
desperdicios agroindustriales o subproductos, reduciendo los costos de
su producción (Kosaric 1992, 2001; Rahman et al., 2003; Das &
Mukherjee, 2007; Das et al., 2008).
Los biosurfactantes son empleados en diferentes industrias como la
agrícola, alimentaria, química, cosmética y farmacéutica (Pacwa-
Płociniczak et al., 2011). En la última década, el empleo de los
biosurfactantes para la degradación de hidrocarburos, tanto en suelos
como aguas contaminadas, ha cobrado gran interés. Por lo tanto, este
capítulo presenta una revisión de la producción y aplicación de los
biosurfactantes para la remediación de ambientes contaminados con
petróleo.
CLASIFICACIÓN DE LOS BIOSURFACTANTES Y SUS
PROPIEDADES
Los biosurfactantes son clasificados de acuerdo a su estructura química,
peso molecular, propiedades físico-químicas, modo de acción y al
microorganismo que lo produce (Pacwa-Płociniczak et al., 2011).
Considerando el peso molecular, los biosurfactantes se clasifican en dos
grupos: biosurfactantes de bajo y alto peso molecular (Ron &
Rosenberg, 2002). Los biosurfactantes de bajo peso molecular incluyen
a los glicolípidos, fosfolípidos y lipopéptidos. Mientras que los
biosurfactantes de alto peso molecular están constituidos por
polisacáridos, proteínas, lipopolisacáridos, lipoproteínas o mezclas
complejas de estos biopolímeros (Rosenberg & Ron, 1999; Al-Araji et

89
al., 2007; Pacwa-Płociniczak et al., 2011). En la Tabla 1, se presenta la
clasificación de los biosurfactantes y los microorganismos que los
producen.

Tabla 1. Clasificación de los biosurfactantes de acuerdo a su estructura

química y su aplicación en la biorremediación de sitios contaminados
con hidrocarburos.

90
Tabla 1 (continuación). Clasificación de los biosurfactantes de acuerdo
a su estructura química y su aplicación en la biorremediación de sitios
contaminados con hidrocarburos

91
Tabla 1 (continuación). Clasificación de los biosurfactantes de acuerdo
a su estructura química y su aplicación en la biorremediación de sitios
contaminados con hidrocarburos

Cabe destacar, que las propiedades y modo de acción de los

biosurfactantes dependen de su naturaleza química. Por ejemplo, los
biosurfactantes de bajo peso molecular son eficientes en disminuir la
tensión superficial (interfase líquido-gas) e interfacial (interfase líquido-
líquido). Mientras que los biosurfactantes de alto peso molecular son
eficientes principalmente para producir emulsiones aceite-agua, y son
denominados bioemulsificantes (Rosenberg & Ron 1999).
La actividad de los biosurfactantes se determina por la concentración
micelar crítica (CMC), definida como la concentración a la cual se
forma la primera micela. En la Figura 1, se muestra de manera
esquemática las propiedades de los biosurfactantes para modificar la
tensión superficial e interfacial de las fases líquidas, así como el
aumento en la solubilidad de los hidrocarburos en función de la
concentración de los biosurfactantes.

92
 Figura 1. Representación esquemática de las propiedades de los
biosurfactantes para modificar la tensión superficial e interfacial de las
fases líquidas, y aumento en la solubilidad de los hidrocarburos en
función de la concentración de los biosurfactantes

Generalmente a concentraciones arriba de la CMC, los biosurfactantes

tienen la propiedad de solubilizar los compuestos hidrofóbicos
(Cameotra & Makkar, 2010). Es decir, los biosurfactantes se asocian
entre ellos para formar micelas, bicapas o vesículas. La formación de
micelas impide que los biosurfactantes disminuyan la tensión superficial
e interfacial del medio líquido pero aumentan la solubilidad y
biodisponibilidad de los compuestos orgánicos (Whang et al., 2008).
Entre más bajo sea el valor de la CMC un biosurfactante es eficiente, lo
que indica una menor concentración de biosurfactante para disminuir la
tensión superficial (Desai & Banat 1997). Por lo tanto, la efectividad de

93
un biosurfactante está determinada por su capacidad para modificar la
tensión superficial e interfacial, formar emulsiones y por su balance
hidrofílico-lipofílico (HLB). El HLB indica la propiedad de un
biosurfactante para formar emulsiones aceite en agua o emulsiones de
agua en aceite. De esta manera un bioemulsificante es lipofílico con un
HLB bajo, al formar emulsiones agua en aceite. Mientras que los
bioemulsificantes con un HLB alto presentan el efecto opuesto (Desai
& Banat 1997; Christofi & Ivshina 2002).
Otra propiedad de los biosurfactantes es su capacidad para modificar la
hidrofobicidad de la superficie celular de las bacterias (CSH),
favoreciendo el contacto de los hidrocarburos con las células
bacterianas (Al-Tahhan et al., 2000; Pacwa-Płociniczak et al., 2011). Los
biosurfactantes que modifican la CSH, se unen a la parte hidrofóbica
de la capa externa de la superficie celular. En el caso de las bacterias
Gram positivas, los biosurfactantes se unen a la pared celular y en las
bacterias Gram negativas, los biosurfactantes se unen a la membrana
externa (Neu, 1996).
BIOSÍNTESIS, REGULACIÓN Y PRODUCCIÓN DE
BIOSURFACTANTES
Los biosurfactantes son producidos extracelularmente por bacterias,
hongos filamentosos y levaduras, o pueden ser parte de la membrana
celular de estos microorganismos (Mata-Sandoval et al., 1999). La
mayoría de las bacterias productoras de biosurfactantes son aisladas de
sitios contaminados con hidrocarburos o a partir de residuos
industriales (Rahman & Gakpe 2008; Benincasa, 2002). Los
biosurfactantes son sintetizados por dos rutas metabólicas principales,

94
la de los hidrocarburos y la de los carbohidratos (Desai & Banat 1997).
Existen diferentes posibilidades para su biosíntesis: (i) la porción
hidrofílica e hidrofóbica pueden ser sintetizados de novo por dos rutas
independientes, (ii) la porción hidrofílica es sintetizada de novo mientras
que la porción hidrofóbica es inducida por el sustrato, (iii) la porción
hidrofóbica es sintetizada de novo y la hidrofílica es inducida por
sustrato, (iv) ambas porciones son inducidas por el sustrato (Hommel
& Ratledge 1993).
En general, la biosíntesis de los biosurfactantes está regulada por cuatro
mecanismos principales: inducción, represión, la presencia de iones
multivalentes y la fuente de nitrógeno (Desai & Banat, 1997). Por
ejemplo, se ha reportado que la adición de largas cadenas de ácidos
grasos o hidrocarburos inducen la producción de soforolípidos en
Torulopsis magnoliae. Por otra parte, la adición de ácidos orgánicos y
glucosa reprime la producción de biosurfactantes en Acinetobacter
calcoaceticus y Arthrobacter paraffineus cuando emplean hidrocarburos
como sustratos (Desai & Banat, 1997).
Cabe destacar que la producción de los biosurfactantes está relacionada
a las diferentes fases del crecimiento de los microorganismos, de esta
manera se distinguen cuatro mecanismos: (i) la producción asociada al
crecimiento celular, (ii) la producción bajo condiciones limitantes de
crecimiento, (iii) la producción durante la inmovilización de las células,
y (iv) la producción con la adición de algún precursor (Desai & Banat,
1997). Generalmente, los biosurfactantes son producidos durante la
fase exponencial o estacionaria de crecimiento de los microorganismos
(Ron & Rosenberg 2001; 2002). En el caso particular de los

95
bioemulsificadores, estos son producidos durante la fase estacionaria y
la producción es inducida por señales moleculares involucradas en el
quórum sensing. Básicamente la producción de los emulsificadores se
lleva a cabo cuando la densidad celular incrementa (Oschner et al.,
1994; Ron & Rosenberg, 2001). El quórum sensing es definido como el
proceso de comunicación entre las bacterias que involucran la
producción, liberación, detección y respuesta a moléculas denominadas
autoinductores. Mediante este proceso, las bacterias monitorean las
condiciones ambientales y pueden alterar el comportamiento de la
población (Waters & Bassler 2005).
Cabe destacar que tanto los componentes del medio de cultivo como
diversos factores ambientales afectan la producción de los
biosurfactantes. Por ejemplo: la fuente de carbono, la fuente de
nitrógeno, fósforo, magnesio, iones manganeso y fierro. Así como las
condiciones de cultivo: pH, temperatura, agitación y tasas de dilución
en cultivos continuo (Al-Tahhan et al., 2000). La calidad y
concentración de los biosurfactantes depende de la naturaleza del
sustrato. Por ejemplo, se ha reportado que el diesel y petróleo crudos
son excelentes fuentes de carbono para la producción de
biosurfactantes (Ilori et al., 2005). Así mismo, los biosurfactantes
pueden producirse a partir de fuentes de carbono solubles en agua
como la glucosa, sacarosa y glicerol (Desai & Banat, 1997; Rahman et
al., 2002). En el caso de la producción de ramnolípidos, Mata-Sandoval
et al., (2000) obtuvieron rendimientos más altos en la producción de
ramnolípidos por Pseudomonas aeruginosa UG2 empleando sustratos
hidrofóbicos (aceite de maíz y manteca de cerdo), en comparación con

96
sustratos hidrofílicos (glucosa y succinato). Por otra parte, Pagilla et al.,
(2002) reportaron el empleo del acetato y hexadecano para el
crecimiento y producción de biosurfactantes por Gordonia amarae en
reactores en batch durante el tratamiento de aguas residuales. Por otro
lado, la fuente de nitrógeno es un factor clave para la regulación en la
biosíntesis de los biosurfactantes. Ilori et al. (2005) demostraron que la
producción de biosurfactantes por Aeromonas spp. fue mayor al emplear
soya en comparación con el nitrato de sodio, ya que la soya contiene
proteínas y almidón que son fuentes favorables para estimular el
crecimiento y la producción de los biosurfactantes por Aeromonas spp.
MECANISMOS DE LOS BIOSURFACTANTES PARA LA
DEGRADACIÓN DE HIDROCARBUROS
Los microorganismos degradadores de hidrocarburos emplean varias
estrategias para incrementar la biodisponibilidad de los compuestos
hidrofóbicos, como la formación de biopelículas o la producción de
biosurfactantes (Bognolo, 1999). En este sentido, el crecimiento de los
microorganismos a partir de los hidrocarburos se relaciona con su
capacidad para producir polímeros con actividad de superficie. Los
biosurfactantes incrementan la degradación de los hidrocarburos por
dos mecanismos (Figura 2): (i) el aumento en la biodisponibilidad del
sustrato a través de la movilización, solubilización o emulsificación; (ii)
la modificación de la CSH favoreciendo el contacto directo de las
células con los hidrocarburos (Mulligan & Gibbs 2004).
La movilización de los hidrocarburos ocurre debajo de la CMC. En
este mecanismo los biosurfactantes disminuyen la tensión superficial e
interfacial entre las interfases gas/agua y suelo/agua. Debido a la

97
reducción de la fuerza interfacial, el contacto de los biosurfactantes
entre el sistema suelo/hidrocarburos incrementa. Por el contario, arriba
de la CMC la solubilización se lleva a cabo, en este caso los
biosurfactantes se asocian para formar micelas incrementando la
solubilidad del petróleo (Urum & Pekdemir 2004). Finalmente, en la
emulsificación se forman pequeñas gotas de petróleo suspendidas en
una fase líquida, y es un fenómeno desarrollado por biosurfactantes de
alto peso molecular (Pacwa-Płociniczak et al., 2011).

Figura 2. Mecanismos de los biosurfactantes para la remoción de los

hidrocarburos en función de su peso molecular (Rosenberg & Ron
1999; Urum & Pekdemir 2004)

Dentro de los estudios relacionados a la solubilización y emulsificación

de los hidrocarburos, Goswami et al. (1994) reportaron que Pseudomonas
cepacia N1 produjo glicoproteínas específicas relacionadas con la
solubilización del hexadecano; mientras que la emulsificación del
hexadecano estuvo relacionada con la actividad de las lipoproteínas.
Más tarde, Bredholt et al. (2002) demostraron que los bioemulsificantes
98
responsables de las modificaciones en la CSH de Rhodococcus sp. 094,
también estuvieron involucrados en la emulsificación de diferentes
constituyentes del petróleo. Por otra parte, Bouchez-Naïtali &
Vandecasteele (2008) evaluaron las capacidades de solubilización y
emulsificación de los biosurfactantes producidos por Pseudomonas
aeruginosa GL1 y Rhodococcus equi Ou2 al crecer en hexadecano, y
concluyeron que el papel de los biosurfactantes dependió de su CSH.
Los biosurfactantes juegan un papel importante en la modificación de
la CSH durante la degradación de hidrocarburos. Franzetti et al., (2010)
propusieron diferentes mecanismos de interacción de los
microorganismos y los hidrocarburos en función de la modulación de
la CSH. Los microorganismos con una alta CSH interactúan
directamente con las gotas de petróleo y los hidrocarburos sólidos.
Mientras que a valores bajos de CSH, los microorganismos se adhieren
a micelas o gotas de petróleo emulsificado (Figura 3).

Figura 3. Mecanismos de interacción entre los microorganismos y los

hidrocarburos en función de la hidrofobicidad celular
99
Cabe destacar que los microorganismos pueden modificar su CSH al
crecer en sustratos hidrófobicos, y estos cambios pueden observarse a
lo largo de las diferentes fases de crecimiento. Por ejemplo, Bredholt et
al., (2002) observaron cambios en la CSH de Rhodococcus sp. 094 al
crecer en diferentes hidrocarburos incluyendo el hexadecano; y
demostraron que los bioemulsificantes producidos por este cultivo
fueron los responsables de modificar su CSH. En estudios más
recientes, Zhao et al., (2011) evaluaron el efecto de la adición de
ramnolípidos sobre los cambios en la CSH de Bacillus subtilis BUM, P.
aeruginosa P-CG3 y de la combinación de ambos cultivos, encontrando
que los ramnolípidos se adsorbían en las superficies celulares
aumentando la hidrofobicidad en P. aeruginosa CG3 y disminuyéndola
en B. subtilis BUM. Por otra parte, Tzintzun-Camacho et al., (2012)
observaron cambios en la CSH a lo largo del tiempo de cultivo de
Acinetobacter bouvetii y un consorcio bacteriano al crecer en hexadecano,
favoreciéndose la degradación de este sustrato.
Es necesario mencionar que diferentes investigaciones se han enfocado
en explicar el papel de los biosurfactantes en la degradación de los
hidrocarburos. Sin embargo, la mayoría de los procesos que involucran
sustratos hidrofóbicos no son completamente claros.
ESTUDIOS SOBRE EL EMPLEO DE BIOSURFACTANTES
PARA LA DEGRADACIÓN DE HIDROCARBUROS
Los biosurfactantes son empleados en tecnologías emergentes para la
biorremediación de sitios contaminados con petróleo. La eliminación
de los hidrocarburos se lleva a cabo por la capacidad de biodegradación
de los microorganismos nativos, y por la adición de biosurfactantes

100
(Helmy et al., 2010). A continuación se presentan ejemplos de estudios
relacionados a la aplicación de los ramnolípidos, soforolípidos, la
surfactina, el emulsan, el alasan y exopolisacáridos para la remediación
de sitios contaminados con hidrocarburos. Estos biosurfactantes se
caracterizan por ser eficientes en la emulsificación e incremento de la
biodisponibilidad de los hidrocarburos, para facilitar su recuperación de
sedimentos y lodos.
Ramnolípidos: son biosurfactantes del tipo de los glicolípidos que
contienen una ramnosa y cadenas de ácidos grasos. Se pueden
encontrar como mono-ramnolípidos o di-ramnolípidos (Figura 4),
generalmente producidos por cepas del género Pseudomonas.

Figura 4. Estructura química de los ramnolípidos producidos por

Pseudomonas aeruginosa (Mulligan, 2005)
101
Cabe destacar que Yin et al., (2008) evaluaron la actividad de los
biosurfactantes producidos por una cepa de P. aeruginosa (aislada de
aguas contaminadas con petróleo) para remover fenantreno; como
resultado obtuvieron un incremento en la solubilidad del fenantreno de
hasta 23 veces. Por otra parte, Guo & Mulligan (2006) evaluaron la
actividad de los ramnolípidos para remover estireno de un suelo
contaminado; observándose más de un 70 % de remoción del
contaminante. En otro estudio, Obayori et al., (2009) reportaron un
incremento en la degradación del petróleo crudo (92.34 %) y del diesel
(95.29 %), debido a la producción de ramnolípidos por Pseudomonas sp.
LP1.
Soforolípidos: son biosurfactantes que se caracterizan por poseer un
azúcar dimérico (soforosa) y un hidroxiácido unido por un enlace β-
glicosídico (Figura 5). En estudios recientes, Kang et al., (2010)
evaluaron la actividad de los soforolípidos en la biodegradación de las
fracciones alifáticas y aromáticas del petróleo crudo e iraní ligero, en un
suelo contaminado bajo condiciones controladas de laboratorio. Como
resultado obtuvieron tasas de biodegradación de hidrocarburos totales
en un rango del 85 al 97 %.

102
 Figura 5. Estructura química del soforolípido producido por Candida
bombícola (Mulligan, 2005)

Surfactina: es un lipopéptido que contiene siete aminoácidos unidos al

grupo hidroxilo o carboxilo de un ácido graso de catorce átomos de
carbono (Figura 6). La surfactina es un biosurfactante muy efectivo
para la remediación de sitios contaminados. Awashti et al. (1999)
observaron un incremento en la biodegradación del endosulfan debido
a la producción de surfactina por Bacillus subtilis. Por otra parte, Olivera
et al. (2000) evaluaron la producción y actividad de la surfactina
producida por una cepa de Bacillus subtilis aislada de sedimentos

103
contaminados, y observaron una rápida biodegradación en las
fracciones alifáticas y aromáticas del petróleo.

Figura 6. Estructura química de la surfactina producida por Bacillus

subtilis (Mulligan, 2005)

Emulsan: es un excelente bioemulsificador producido por diferentes

especies del género Acinetobacter, y se caracteriza por producir
emulsiones estables de hidrocarburos (Ron & Rosenberg 2001). El
emulsan está constituido por un heteropolisacárido aniónico y una
porción proteica (Figura 7). La estructura puede modificarse y generar
diferentes tipos de emulsan con actividad biológica. Cabe destacar que
el emulsan ha sido empleado en el lavado de suelos contaminados con
hidrocarburos. Franzetti et al., (2008) reportaron que los diferentes
tipos de emulsan producidos por Gordonia sp. BS29 incrementaron la
remoción del petróleo crudo hasta en un 33 %, al ser empleados como
agentes de lavado para la remediación de suelos contaminados con
hidrocarburos.

104
Figura 7. Estructura química del emulsan producido por Acinetobacter
venetianus RAG-1 (Castro et al., 2008)

Alasan: es un emulsificante polimérico constituido por un polisacárido

aniónico complejo y una porción proteica (Ron & Rosenberg, 2002).
Los estudios relacionados a la elucidación y caracterización de su
estructura química son escasos. Barkay et al. (1999) evaluaron la
actividad del alasan producido por Acinetobacter radioresistens KA53 sobre
la solubilización de hidrocarburos aromáticos policíclicos (fenantreno y
fluoranteno). Los resultados obtenidos indicaron un incremento en la
solubilidad del fenantreno y fluoranteno conforme incrementaba la
concentración del alasan, en un rango de 50 a 500 mg/mL.
Exopolisacáridos: son producidos por diferentes géneros bacterianos,
por ejemplo Hua et al., (2010) evaluaron la actividad de un
exopolisacárido producido por Enterobacter cloacae TU. Los resultados
indicaron que el exopolisacárido era un excelente emulsificador y que
podía incrementar la CSH de las bacterias.

105
Emulsificantes: los términos de biosurfactantes y bioemulsificantes
son usados comúnmente como sinónimos. Sin embargo, los
emulsificantes se caracterizan por tener propiedades de superficie y
liberarse al medio para formar emulsiones estables, facilitando la
asimilación de sustratos insolubles (Fiechter, 1992). En estudios
recientes Viramontes-Ramos et al., (2010) aislaron y seleccionaron
diferentes cepas bacterianas productoras de biosurfactantes y
bioemulsificantes pertenecientes a los géneros Pseudomonas, Acinetobacter,
Bacillus y Rhodococcus. Como resultado encontraron que 17 de los
aislados bacterianos formaban emulsiones estables con aceite de motor.
CONCLUSIONES
Los biosurfactantes son compuestos con actividad de superficie que
contribuyen a la remoción y degradación de sustratos hidrofóbicos
como los hidrocarburos. Debido a su baja toxicidad y
biodegradabilidad, el empleo de los biosurfactantes como auxiliares en
tecnologías de remediación es una alternativa viable y eficiente. Por
consiguiente, es necesario encaminar estudios de investigación para la
producción de biosurfactantes a nivel industrial, ya que, su aplicación es
limitada por los elevados costos en su producción. En este contexto, el
empleo de sustratos no convencionales como los residuos
agroindustriales favorecería la reducción en los costos de producción.
Por lo tanto, la combinación de estrategias eficientes de biodegradación
y la aplicación de biosurfactantes, son elementos claves para solucionar
problemas medioambientales derivados del petróleo, en los cuales, los
microorganismos juegan un papel esencial.

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115
 Capítulo 5
DEGRADACIÓN DE HIDROCARBUROS POR
PLANTAS

Areli Cruz-Hernández*
Centro de Investigación y Estudios Avanzados del Instituto Politécnico
Nacional, Unidad Irapuato. Km. 9.6 Libramiento Norte Carretera
Irapuato-León, CP 36821, Irapuato Gto. México Tel.: 462623900, Ext.
9628.
*Autor para correspondencia, correo electrónico:
ing.bio.cruz@gmail.com

Palabras clave: degradación, hidrocarburos, suelo, plantas.

RESUMEN
Las plantas son de gran importancia para el sustento de la vida en la
Tierra. Entre las múltiples funciones que desempeñan se encuentra la
capacidad que tienen de actuar como restauradores de sitios
contaminados, incluyendo agua, aire y suelo. El objetivo de esta
revisión es facilitar información importante sobre el papel que
desempeñan ciertas plantas, desde un enfoque bioquímico, en la
degradación de hidrocarburos derivados del petróleo presentes en los
suelos.
INTRODUCCIÓN
Las plantas se caracterizan por su gran diversidad genética y
bioquímica, son de importancia económica, estética y recreativa,
también se caracterizan por su valor ecológico al proporcionar oxígeno
al ambiente y ser la base de la cadena alimenticia. Desde el punto de
vista bioquímico, las plantas cumplen con ciertas funciones básicas: i)
fotosíntesis, ii) respiración, iii) transporte de nutrientes y iv) respuesta a
los estímulos bióticos y abióticos (Nabors, 2006). El conocimiento de
116
la bioquímica vegetal básica es aprovechado por el hombre para
desarrollar nuevas tecnologías a partir de las plantas para la remediación
de sitios contaminados con compuestos orgánicos.
México se caracteriza por contar con grandes depósitos de petróleo, en
la mayoría de estos lugares se han instalado refinerías para la
explotación y refinación del petróleo. Como consecuencia, la
contaminación de suelos por hidrocarburos derivados del petróleo se
ha incrementado como consecuencia de derrames de contenedores,
ruptura de tuberías y a otros procesos industriales. Un grupo de
hidrocarburos considerados contaminantes persistentes, son los
hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs por sus siglas en inglés).
Los suelos contaminados con PAHs presentan riesgos potenciales para
la salud humana y para los ecosistemas naturales, porque algunos PAHs
se han reportado como carcinogénicos, citotóxicos o ecotóxicos (Srogi,
2007). La restauración de suelos contaminados con este tipo
compuestos comienza con la aplicación de tratamientos físico-químicos
que podían causar problemas secundarios (Lenoir & Tornari, 2004).
Por esta razón, surge el interés por desarrollar tecnologías de limpieza
sustentables y de bajo costo. Por ejemplo, la fitorremediación: una
tecnología emergente que utiliza las plantas y sus procesos naturales
para la restauración de sitios contaminados. Los contaminantes
orgánicos son compuestos que pueden ser transformados o
mineralizados por diferentes plantas. Aunque el conocimiento de la
degradación de PAHs por el sistema metabólico de las plantas es aún
limitado, comparado con el conocimiento del mismo proceso en
bacterias y hongos, varios reportes confirman la importancia de la

117
Fitorremediación como una tecnología emergente (Gerhardt et al.,
2009; Ndimele, 2010).
MECANISMOS DE FITORREMEDIACIÓN DE
COMPUESTOS ORGÁNICOS
La comprensión de la bioquímica básica, implicada en diversos
procesos estimulados por las plantas, es muy importante para mejorar
la aplicabilidad de esta tecnología. En el siguiente apartado se resumen
los mecanismos estimulados por las plantas en la remediación de
compuestos orgánicos.
Fitovolatilización. Es la capacidad natural de una planta para
transferir a la atmósfera un contaminante o un metabolito
(Erakhrumen & Agbontalor, 2007). Inicia con la absorción de los
contaminantes por las raíces, aquellos que son volátiles se difunden a
través de la planta y finalmente son liberados a la atmósfera por los
estomas abiertos en las hojas (transpiración), como se muestra en la
Figura 1 (ITRC, 2009).

118
 Figura 1. Representación esquemática del mecanismo de
fitovolatilización (Modificado de ITRC, 2009)

Fitodegradación. Es la transformación o mineralización del

contaminante a través de diversas reacciones enzimáticas internas y
procesos metabólicos propios de la planta, también es llamado
"fitotransformación" (Figura 2). Este mecanismo involucra el
establecimiento de principios moleculares para la desintoxicación de
compuestos extraños, algunas especies de plantas degradan y/o
transforman los contaminantes después de absorberlos. Esto lo hacen a
través de i) los ciclos de oxidación y reducción presentes durante la
fotosíntesis donde el contaminante orgánico participa como donador
de electrones o ii) el proceso metabólico catalizado por enzimas dentro
119
de las células de la raíz o de la parte aérea. Entre las enzimas más
conocidas en fitorremediación destacan las peroxidasas, las
monoxigenasas, las nitrato reductasas y las fosfatasas (Sinha et al.,
2007). Otra forma de descomposición de los contaminantes puede
darse por la secreción de enzimas y compuestos químicos al suelo. Las
enzimas secretadas son generalmente deshidrogenasas, oxigenasas y
reductasas.

Figura 2. Representación esquemática del mecanismo de

fitodegradación. La transformación o mineralización del contaminante
puede llevarse a cabo por las actividades enzimáticas dentro de las
células de la planta (A) o la oxidación fotosintética (B) (Modificado de
ITRC, 2009)

Fitoestimulación/Rizodegradación. Se refiere a la degradación

microbiana de los contaminantes en la rizosfera (Figura 3). Esto ocurre
120
porque la planta promueve el desarrollo de microorganismos
degradadores de compuestos orgánicos (bacterias y hongos) a través de
la producción de exudados radiculares que contienen azucares, ácidos
orgánicos y aminoácidos (ITRC, 2009).

Figura 3. Representación esquemática del mecanismo de

rizodegradación (Modificado de ITRC, 2009)

EL PAPEL DE LAS PLANTAS EN LA DEGRADACIÓN DE

HIDROCARBUROS
Se ha descubierto que un gran número de plantas incluyendo árboles,
pastos y arbustos, tanto acuáticos como terrestres, cuentan con
propiedades que les permiten llevar a cabo la restauración ambiental
(Sinha et al., 2007). Cuando se pretende aplicar la tecnología de
fitorremediación, es importante identificar si las plantas tienen la
capacidad de biodegradar o biotransformar los contaminantes a formas
inertes en sus tejidos (raíces y parte aérea). Las plantas pueden degradar
121
los hidrocarburos por dos vías: i) degradación directa y ii) degradación
indirecta.
DEGRADACIÓN DIRECTA
La degradación es la transformación de los contaminantes a
compuestos menos tóxicos o menos persistentes en el ambiente que los
componentes originales. La degradación directa implica que los
contaminantes orgánicos son degradados por los procesos naturales de
la planta como absorción y difusión a través de las raíces, tallos y hojas
o la transformación y/o secuestro por las actividades enzimáticas
propias de la planta (fitodegradación). Aunque las plantas tienen la
capacidad inherente para desintoxicar algunos contaminantes
persistentes en el ambiente, por lo general carecen de una ruta
metabólica para la degradación completa (mineralización) de estos
compuestos en comparación con los microorganismos (Eapen et al.,
2007).
DEGRADACIÓN INDIRECTA
En contraste con la degradación directa hay bastante información
disponible con respecto a la degradación indirecta, debido a que el
ambiente alrededor de las raíces de la plantas ha sido estudiado desde
diferentes perspectivas incluyendo el efecto de los metabolitos
secundarios, ya que se ha demostrado que tienen un papel importante
en el desarrollo de la gran cantidad de enzimas extracelulares que
degradan los contaminantes orgánicos persistentes en el suelo (Singer et
al., 2003) y los efectos de los microorganismos asociados a las plantas
(Su et al., 2008; Tarkka et al., 2008; Bin et al., 2010).

122
Esta vía puede ocurrir por la excreción de proteínas y cofactores a
través de las raíces de las plantas resultando en una actividad no
específica, como por ejemplo una mejora en el crecimiento microbiano
en la rizosfera como consecuencia de los azucares y ácidos orgánicos
de los exudados (rizodegradación). Los ácidos orgánicos pueden alterar
el pH del suelo modificándose la solubilidad de los contaminantes
(Weyens et al., 2010). Asimismo, los exudados pueden incrementar la
materia orgánica del suelo y así afectar el transporte de algunos
contaminantes orgánicos. Varios estudios han reportado que las
enzimas, producidas interna o externamente por la planta, pueden
metabolizar una gran variedad de compuestos orgánicos (Gianfreda et
al., 2004; López-Martínez et al., 2008).
METABOLISMO DE HIDROCARBUROS EN LAS PLANTAS
La absorción es el paso crucial para que las plantas puedan metabolizar
los hidrocarburos. Bajo ciertas condiciones climáticas el carácter
lipofílico del hidrocarburo, expresado como el coeficiente de partición
octanol-agua (Kow), ha mostrado ser el parámetro determinante para la
entrada del mismo a la raíz y la sucesiva translocación a la parte aérea.
Los hidrocarburos con un log Kow≤1 se consideran muy solubles en
agua y generalmente, en ambientes lluviosos o sistemas donde la tasa de
evapotranspiración es alta, no son acumulados. Sin embargo, cuando
no se presentan estas condiciones, los contaminantes pueden
acumularse en la planta y generalmente son transportados hacia la parte
aérea de las plantas vía xilema. Los hidrocarburos con un log Kow entre
1 y 4, como el tolueno y naftaleno, son absorbidos por las raíces y
tienen movilidad vía xilema y aquellos como el pireno con un log Kow

123
mayor a 4 son altamente absorbidos por las raíces, con una lenta o nula
translocación a los tallos y hojas (Karthikeyan & Kulakow, 2003). En la
Tabla 1 se muestran los valores log Kow de algunos PAHs
frecuentemente estudiados en suelo y agua (Yang & Zhu, 2007;
Gomez-Eyles et al., 2010). Una vez que el hidrocarburo es absorbido
por las raíces es acumulado en las células de los tejidos de las plantas y
ahí es transformado por una gran variedad de reacciones bioquímicas.

Tabla 1. Coeficiente de partición octanol/agua (log Kow)

para algunos PAHs.

El metabolismo de hidrocarburos en plantas se lleva a cabo durante la

absorción por las raíces y la difusión a través de tallos y hojas de las
plantas y normalmente en las células es llevado a cabo por tres pasos
secuenciales como se muestra en la Figura 4 (Schröder, 2007; James &
Strand, 2009).
1. Fase I. Conversión/activación (oxidación, reducción e
hidrólisis) de los compuestos lipofílicos.

124
2. Fase II. Conjugación de los metabolitos de la Fase I a una
molécula hidrófila endógena, tales como azúcares, aminoácidos y
glutatión.
3. Fase III. Los hidrocarburos modificados pueden ser
almacenados en vacuolas o quedar unidos a componentes de la pared
celular, tales como la lignina o hemicelulosa.

Figura 4. Metabolismo de hidrocarburos en plantas

La Fase I es la etapa de bioactivación del metabolismo de las plantas

que incluye la activación o modificación del compuesto, durante la cual
se crean sitios reactivos mediante la adición o la exposición de los
grupos funcionales (por ejemplo, hidroxilo o carboxilo) que preparan al
contaminante para las reacciones de fase II. Las enzimas implicadas en
la fase I están localizadas en la membrana de las células de las plantas
(monooxigenasa P450) o en el apoplasto y citosol (peroxidasas). Las

125
reacciones de oxidación, reducción e hidrólisis llevadas a cabo durante
esta fase son importantes en la fitorremediación de contaminantes
orgánicos hidrófobos, químicamente estables, tales como
hidrocarburos aromáticos policíclicos y aromáticos policlorados. La
etapa inicial de la degradación oxidativa de hidrocarburos aromáticos
policíclicos implica la hidroxilación o epoxidación de los anillos
fenólicos (López-Martínez et al., 2008). Tales reacciones pueden
llevarse a cabo por el citocromo monooxigenasa P450 (que comprende
la familia más grande de proteínas de plantas). Además, las células
vegetales también contienen formas solubles de la misma enzima, lo
que les permite mejorar significativamente su capacidad de
desintoxicación (Kvesitadze et al., 2001). Posteriormente, la
conjugación de los metabolitos derivados de la Fase I tiene lugar en el
citosol (Fase II) que consiste en la incorporación de grupos funcionales
(generados a partir de las rutas metabólicas de las plantas) en los sitios
reactivos de los hidrocarburos dando como resultado la formación de
compuestos más polares, químicamente activos y más solubles en agua
en comparación con el compuesto original (Komives & Gullner, 2005).
La conjugación es catalizada por las enzimas glutatión y glucosil
tranferasa. Finalmente, la fase III es dividida en dos fases
independientes, i) en ella ocurre el transporte y almacenaje de estos
conjugados en las vacuolas o ii) en este caso se siguen transformando
los conjugados hasta formar metabolitos solubles o conjugados
secundarios, como por ejemplo, residuos que se unen a la pared celular
o simplemente son excretados, esto con la finalidad de que los

126
conjugados no puedan interferir en el metabolismo celular (James &
Strand, 2009).
CONCLUSIONES
Las plantas poseen gran cantidad de enzimas requeridas para el
metabolismo de contaminantes. Las actividades enzimáticas de las
plantas participan catalizando e interconectando reacciones metabólicas
que favorecen la transformación de contaminantes orgánicos presentes
en el suelo. El conocimiento bioquímico acerca de la actividad
específica de una enzima para el metabolismo de distintos
contaminantes brinda información básica necesaria para continuar
investigando el papel que desempeñan las plantas en la restauración de
ecosistemas naturales alterados por la presencia de hidrocarburos.
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130
 Capítulo 6
LA BIOQUÍMICA EN EL DISEÑO DE FÁRMACOS.

José Carlos Espinoza-Hicks*

Departamento de Química Orgánica, Escuela Nacional de Ciencias
Biológicas, Instituto Politécnico Nacional. Prol. Carpio y Plan de Ayala,
11340 México, D.F., México.
*Autor para correspondencia, correo electrónico:
hicks_1107@hotmail.com

Palabras clave: fármacos, metabolismo, estereoquímica.

INTRODUCCION
Hablar de diseño de fármacos implica un panorama amplio, la creación
de estructuras químicas novedosas que cumplan con los requisitos de
seguridad y acción para combatir enfermedades se torna una tarea
difícil. En este capítulo se abordarán algunas de las metodologías que se
encuentran a la vanguardia en el diseño de fármacos, las cuales están
íntimamente relacionadas con el estudio de la bioquímica, hablando
principalmente de las rutas de transformación química de estas
estructuras en el cuerpo humano (metabolismo), y de las tendencias en
modelos teóricos que proporcionan un panorama prometedor al
involucrar bajos costos de inversión.
Una parte importante de los estudios científicos se han enfocado en el
desarrollo de moléculas que puedan interactuar de manera selectiva,
ayudando a controlar de manera total o parcial las enfermedades.
Dichas moléculas conocidas como fármacos, involucran, para su diseño
una gran cantidad de disciplinas englobadas en la actualidad en lo que
se conoce como Química Medicinal, que al ser multidisciplinaria usa

131
herramientas de la Biología, Química, Toxicología, Farmacología,
Bioquímica, entre muchas más. La Química Medicinal nace como
disciplina, a inicios del siglo XX, debido a esa necesidad de desarrollar
moléculas que contengan efectos biológicos selectivos contra las
enfermedades que aquejan a la humanidad.
DESARROLLO DE NUEVOS FÁRMACOS.
El desarrollo de un nuevo fármaco, es un camino largo y complicado,
se estima que el tiempo necesario para la salida al mercado de un
fármaco oscila entre 8 y 17 años (Figura 1), esto considerando que las
pruebas de toxicidad no muestren que el fármaco presenta actividad
tóxica en algún punto y se tenga que regresar a la parte de modificación
estructural para disminuir o eliminar dicha propiedad (Delgado et al.,
2003).
Además de ser un proceso largo, en cuanto a la inversión económica
puede llegar al orden de miles de millones de dólares el gasto necesario
para este tipo de desarrollos (Adams & Brantner 2006).

132
 Figura 1. Proceso de desarrollo de nuevos fármacos y fases
involucradas, al lado de cada fase se indica el número de años
promedio de duración de cada etapa (Modificado de Delgado et al.,
2003)

El desarrollo de un fármaco implica el uso de moléculas desconocidas

para el cuerpo humano, y por ello se han desarrollado organismos
especializados en regular el uso de dichas moléculas: en México el
encargado de la administración y regulación de los fármacos
desarrollados es la COFEPRIS (www.cofepris.gob.mx); en Estados
Unidos es la FDA (Food and Drug Administration) (www.fda.gov). La
FDA se considera un estándar por muchas naciones para regular el uso
de nuevos fármacos. Datos generados por dicho organismo muestran
que las aprobaciones de Nuevas Entidades Moleculares (fármacos en su
mayoría) van de 53 hasta 15 en un periodo de diez años (de 1993 hasta
133
el 2003), con una media general de 25 moléculas por año (Mullard,
2004).
Tomando en cuenta estos datos y comparándolos con la cantidad de
enfermedades conocidas, se concluye que la producción de fármacos
hasta la actualidad sigue siendo deficiente y representa un tema de
importancia ya que, por ejemplo, bastantes enfermedades infecciosas
que en un tiempo pudiesen haber sido controladas, debido al
fenómeno de resistencia, han dejado de ser combatidas de manera
efectiva.
Los fármacos provienen principalmente de 5 fuentes: plantas, bacterias,
hongos, animales y productos de semi-síntesis. De ellas los productos
naturales obtenidos de plantas ocupan aproximadamente el 48 % de las
aprobaciones mientras que en segundo lugar se encuentran los
derivados de semi-síntesis con un 28% (Harvey, 2008).
En los últimos años la síntesis química ha desarrollado metodologías
para incrementar la cantidad de moléculas producidas por esta vía. En
la década de los 90s la industria farmacéutica y la ciencia fueron testigos
del nacimiento de lo que se conoce como síntesis combinatoria que,
como su nombre lo indica, implica la síntesis simultánea de una gran
cantidad de moléculas a partir de materias primas sencillas y permite la
construcción de moléculas de mayor complejidad estructural. Por
ejemplo, en la Figura 2 se puede observar que a partir de una molécula
sencilla y comercial como lo es la 1,2-butanodiona (1), se pueden
obtener moléculas heterocíclicas con potenciales biológicos muy
variados (Kennedy et al., 2008).

134
 Figura 2. Diversidad estructural obtenida a partir de la síntesis
combinatoria, como ejemplo se muestran las quinoxalinas (2),
quinoxalinas sustituidas con diferentes heteroátomos (3), piperazin-2-
onas (4), piridocarbazoles (5), 1,2,4-triazinas (6) o imidazoles (7)

Estas metodologías sintéticas que permiten la rápida producción de

estructuras químicas novedosas, disminuyen la cantidad de tiempo que
se invierte en la síntesis tradicional donde lo importante es conseguir
una molécula objetivo en particular, accediendo a ella a través de una
secuencia ordenada de pasos. En la actualidad el uso conjunto de la
síntesis combinatoria con los estudios biológicos que revelan de
135
manera preliminar actividad biológica de alguna molécula, se conoce
como cribado sistemático de alto rendimiento o HTS (High Throughput
Screening). El HTS se subdivide en tres metodologías principales: 1) el
cribado exhaustivo, donde la molécula proviene de un proceso de
síntesis tradicional y se realizan una amplia variedad de pruebas
biológicas para demostrar en cuál de ellas es más eficaz (entendiendo
por eficaz a la forma en la que el fármaco actúa para ejercer el efecto
terapéutico) o contiene mejor potencia (entendiendo por potencia a la
cantidad de fármaco requerido para el efecto terapéutico); 2) el cribado
aleatorio, en donde por medio de síntesis combinatoria se accede a una
gran cantidad de moléculas del orden de miles y solamente se realiza un
ensayo biológico en particular hasta encontrar la estructura que muestre
mejor actividad; 3) el cribado combinado, el cual usa al mismo tiempo
las técnicas de síntesis combinatoria para obtener una amplia variedad
de estructuras novedosas que sean probadas en una gran cantidad de
ensayos biológicos (Gareth 2007).
La pregunta obligada después del análisis del proceso de desarrollo de
un nuevo fármaco sería ¿cómo participa la bioquímica en dicho
desarrollo?, la respuesta que primero saltaría a la mente es que su
utilidad radica en la comprensión de los mecanismos de transformación
que pudiesen sufrir este tipo de moléculas (fármacos) en el cuerpo
humano. Aunque la respuesta es válida, la bioquímica participa en el
esbozo de las estructuras tridimensionales de las proteínas, que
participan en dicho metabolismo, y ha permitido el desarrollo de
técnicas computacionales que permiten realizar el diseño de fármacos

136
de una manera racional, y además disminuye de manera significativa el
azar en el desarrollo de nuevas moléculas.
LAS TÉCNICAS DE CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X Y
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR EN LA
DETERMINACIÓN DE ESTRUCTURAS QUÍMICAS
TRIDIMENSIONALES
Gracias a la existencia de técnicas espectroscópicas en química, se
puede obtener información que hasta hace algunos años era
desconocida, por ejemplo la estructura y arreglo químico tridimensional
de las proteínas. Una de las técnicas que ha contribuido en gran parte a
este descubrimiento es la Cristalografía de Rayos X, la cual se basa en la
difracción, es decir la observación de la desviación de una onda al
encontrar un obstáculo en su camino. En 1895 Wilhelm Conrad
Röntgen descubrió los rayos X, posteriormente William Henry Bragg y
William Lawrence Bragg introdujeron modelos matemáticos conocidos
como “Ley de Bragg”, trabajo por el cual los tres obtuvieron el premio
Nobel en Química. Gracias a estos estudios fue posible el desarrollo de
un modelo tridimensional descriptivo, que proporciona una medición
inequívoca de la estructura química y el volumen espacial que ocupa.
En los años 50-70 del siglo XX esta técnica se aplicó a sistemas
biológicos para dilucidar estructuras como la hemoglobina, mioglobina
(realizados por Max Perutz y John Kendrew), ADN (realizados por
Francis Crick y James Watson), penicilina y vitamina B12 (realizados
por Dorothy Hodgkin), cada uno de estos descubrimientos fueron
merecedores al Premio Nobel en Química.

137
La cantidad de estructuras proteicas determinadas hasta julio de 2014
fue de 101,397 de acuerdo a la base de datos PDB
(www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Esta gran colección de datos ha
hecho posible el desarrollo de técnicas computacionales para el diseño
racional de nuevos fármacos. La co-cristalización de una proteína con
su ligando natural permite determinar el sitio activo haciendo posible la
visualización de su espacio físico tridimensional (Figura 3). También ha
sido posible hacer interacciones, empleando los modelos teóricos
adecuados, de una molécula nueva con el sitio activo de una enzima
para poder predecir una posible unión y calcular la energía de dichos
enlaces, lo que nos daría una idea de la estabilidad del complejo
proteína-ligando. Esta técnica conocida como Docking Molecular
(Acoplamiento Molecular), ayuda a entender el tipo de aminoácidos y
enlaces formados (puente de hidrógeno, fuerzas de Van Der Waals,
entre otras) que participan en dicha unión, mientras que el cálculo de
las energías de todo el sistema permite analizar cuál de estas uniones es
la más estable llegando al final a una predicción de la actividad
biológica potencial de la molécula.

138
Figura 3. Estructura tridimensional de la enzima transcriptasa reversa
del virus del HIV co-cristalizada con un inhibidor no nucleosídico
(Mislak et al., 2014)

Sin embargo, una de las grandes limitantes de la técnica es que la

estructura química se determina en estado sólido y como es bien
conocido, las proteínas se encuentran en sus formas activas sólo en
disolución. Debido a esto los estudios de acoplamiento molecular no
tienen el éxito deseado en la predicción de actividad biológica, aunque
con el desarrollo de supercomputadoras se podría determinar mejor
dicho acoplamiento. Con este tipo de estudios y dependiendo del
programa utilizado, se llega a obtener un 70% de resultados positivos.
Debido a las limitantes en la cristalografía de rayos X, los estudios de
Resonancia Magnética Nuclear han tomado importancia en la
construcción de los modelos tridimensionales proteicos ya que pueden
realizarse en disolución. La técnica se basa en el análisis de los átomos
de hidrógeno o carbono que contiene una molécula, utilizando átomos
que contienen electrones desapareados en su orbital atómico exterior se
genera un campo magnético que orienta dichos electrones (spin) en

139
dirección a la fuerza de atracción del campo, los cuales al recibir un
impulso de radiofrecuencia cambian de orientación generando la señal
al momento de regresar a su posición inicial en favor del campo
magnético. Debido a que los átomos en las moléculas orgánicas
contienen ambientes químicos electrónicos diferentes dependientes de
los grupos funcionales con los que cuenta la molécula, mediante esta
técnica es posible diferenciar los átomos de hidrógeno o carbono
dependiendo del tipo de grupos funcionales que se encuentran
formando o cercanos a ellos. Con el avance en los campos magnéticos
generados por los equipos modernos (hasta 1000 MHz) y el desarrollo
de técnicas que permiten eliminar el ruido de los disolventes en los
espectros, ha sido posible la construcción de modelos tridimensionales.
Este tipo de estudios no dejará de estar a la vanguardia en la bioquímica
y el desarrollo de nuevos fármacos ya que permiten entender, con
modelos tridimensionales, cómo se llevan a cabo las interacciones
proteína-ligando; al ser estudios que se pueden realizar utilizando
métodos computacionales, se reduce la inversión económica para el
descubrimiento de la molécula inicial que tenga la actividad biológica
deseada.
ESTEREOQUÍMICA Y METABOLISMO DE FÁRMACOS
Antes de abordar las reacciones principales involucradas en el
metabolismo de fármacos es importante analizar el concepto de
estereoquímica y su rol en las reacciones de degradación de dichos
fármacos. La estereoquímica está encargada de estudiar la distribución
espacial de los sustituyentes de una molécula, llamados principalmente
isómeros conformacionales (indica la adopción de diferentes

140
conformaciones por simple giro de enlaces) e isómeros
configuracionales (implican el rompimiento de enlaces para que las dos
moléculas se puedan superponer: enantiómeros, isómeros E y Z, etc).
Desde los años 50s y 60s del siglo XX con la administración de la
talidomida, utilizada como sedante en el tratamiento de las molestias en
los primeros meses de embarazo, se demostró la importancia del
estudio de la topología molecular en el desarrollo de fármacos. Dicho
fármaco, administrado originalmente como una mezcla racémica,
presenta efectos diferenciales en los enantiomeros, mientras que el
enantiómero S presentaba efectos teratógenos (lo que provocó el
nacimiento de bebes con malformaciones genéticas), el enantiómero R
no tenía efectos secundarios. Después de este suceso, los organismos
regulatorios consideraron la estereoquímica como análisis principal y
con el paso del tiempo se han encontrado diferencias en la actividad
biológica de distintos enantiómeros de una molécula (Figura 4).

Figura 4. Fármacos que muestran diferencias en actividad biológica

dependiendo del enantiómero

141
Al enantiómero con la mayor actividad se le denomina eutómero y al que
contiene la menor actividad biológica se le denomina distómero, mientras
que la relación entre ambos enantiómeros se le denomina coeficiente
eudísmico.
Estas diferencias, en la posición de los grupos funcionales o carbono
quiral, generan mecanismos de absorción y distribución selectivos. Tal
es el caso de la molécula de DOPA 1 en donde el enantiómero (S) se
absorbe por medio de transporte activo mientras que el (R) se absorbe
por difusión pasiva. Otro ejemplo, es el caso de la Warfarina 2
(anticoagulante) en donde la unión del enantiómero (S), el eutómero, a
las proteínas plasmáticas es mayor que la del enantiómero (R). En
ensayos in vitro el enantiómero (S) contiene la mayor actividad
biológica, al realizar ensayos in vivo, el enantiómero (R) resultó con la
mayor actividad ya que es más fácil que llegue a su diana biológica (la
diana biológica se puede definir como la molécula, ya sea proteína o
sitio biológico, en donde el fármaco ejercerá el efecto terapéutico)
(Figura 5).

Figura 5. Fármacos con absorción y distribución enantioselectiva

142
 METABOLISMO DE FÁRMACOS
Sin duda el papel principal del metabolismo de fármacos es hacer que
las moléculas que ingresan al cuerpo humano sean solubilizadas en la
sangre para promover su posterior eliminación por los principales
órganos encargados de ello (riñones, pulmones, tracto gastrointestinal,
entre otros). Por lo tanto, las modificaciones estructurales que sufrirá
un fármaco al ingresar al metabolismo endógeno será la introducción
de grupos funcionales polares que incrementen la solubilidad del
compuesto en agua.
El metabolismo de fármacos se puede dividir en dos fases
principalmente: las reacciones de fase I, en donde se llevan a cabo
reacciones de oxidación, reducción e hidrólisis principalmente, y la fase
II en donde se llevan a cabo reacciones de conjugación con moléculas
polares del metabolismo endógeno con la intención de aumentar la
solubilidad en agua. La velocidad del metabolismo de fármacos
controlará el tiempo y la intensidad con la que se obtendrán los efectos
benéficos de dicha molécula, es decir un metabolismo rápido
disminuirá el tiempo de vida medio del fármaco lo que no permitiría
que éste cumpliera con el efecto deseado. Otro punto importante es la
producción de metabolitos derivados del fármaco en donde se pueden
obtener dos tipos de efectos principales, la producción de un
metabolito con mayor actividad que el suministrado o la producción de
un metabolito que contiene efectos tóxicos para algún órgano en
particular.
Por último, se puede presentar el caso en donde la molécula
suministrada (pro-fármaco) no contenga ningún efecto biológico pero

143
al momento de ingresar en el metabolismo podría ser transformada a
una forma activa responsable del efecto biológico benéfico. Un
ejemplo de esto es la molécula de omeprazol la cual, al interactuar con
el medio ácido del estómago, sufre una serie de transformaciones que
promueven la liberación de la forma activa que se une de manera
reversible a la bomba H+, K+ ATP-asa gástrica y la inhibe, de este
modo se evita la liberación de H+ al estómago para la formación de
HCl (Figura 6).

Figura 6. Metabolismo del omeprazol A (liberación de la forma activa C

y D que se une al complejo enzimático ATP-asa H+, K+ gástrica RSH)
(Modificado de Taylor & Triggle 2006 b)

METABOLISMO DE BIOTRANSFORMACIÓN FASE I:

REACCIONES DE OXIDACIÓN, REDUCCIÓN E
HIDRÓLISIS
Reacciones de Oxidación y Reducción
Las reacciones de oxidación del metabolismo de fase I son las de mayor
importancia y prevalencia en los fármacos (Taylor & Triggle, 2006 b).
El proceso de oxidación implica la introducción directa de grupos

144
oxigenados a la molécula lo que promueve el aumento de su polaridad.
En la Tabla 1 se muestran las principales enzimas encargadas de los
procesos de oxidación y reducción en el metabolismo de fármacos,
destacando el tipo de sustratos que tiene cada enzima y el grupo
funcional donde actúan principalmente. Dentro de este grupo de
enzimas destacan las pertenecientes al citocromo P450, localizadas en
el hígado, que son la primera línea de defensa contra xenobióticos.

145
146
La primera línea de ataque que corresponde a los complejos
enzimáticos del citocromo P450, son capaces de realizar oxidaciones en
carbonos tipo sp3, sp2 y sp, así como en heteroátomos. A continuación
se analizarán algunos ejemplos de las reacciones realizadas por estos
complejos enzimáticos.
En el caso de carbonos con hibridación sp2, el citocromo P450 también
es capaz de realizar oxidaciones selectivas. Un ejemplo es el
anticonvulsionante carbamazepina (3) (Figura 7), el metabolito
observado después de la reacción con CYP450 es el epóxido formado
en las posiciones 10 y 11 del anillo de siete miembros, para dar lugar a
la carbamazepina-10,11-epóxido (4) (Figura 7).

Figura 7. Metabolito principal de la carbamazepina (4)

También existen reportes de oxidaciones correspondientes a

heteroátomos como la N-hidroxilación, que sin duda es una de las
reacciones más frecuentes en fármacos alquílicos o arílicos. Como
ejemplo, en la Figura 8, se muestra la N-hidroxilación alquílica de
fentermina (5) que es un supresor del apetito, se observa que el
metabolito principal es 6. La dapsona (7), antibiótico utilizado en el

147
tratamiento de la lepra, contiene un grupo amino aromático el cual es
oxidado a su metabolito principal N-hidroxilado 8.

Figura 8. Principales metabolitos de la fertermina (5) y dapsona (7)

La activación metabólica del pro-fármaco etionamida (9), utilizado

contra el tratamiento de infecciones causadas por Micobacterium
tuberculosis, sucede dentro del mismo microorganismo. La enzima flavin
monooxigenasa activa al pro-fármaco por dos oxidaciones secuenciales:
en la primera produce el metabolito inactivo S-óxido (10), en la
segunda el heteroátomo produce al fármaco activo (11). El único
metabolito aislado de éste fármaco es la amida (12), que no presenta
citotoxicidad para la célula, por lo que se piensa que el intermediario
(11) es la forma activa del pro-fármaco (Figura 9) (Vannelli et al., 2002).

148
 Figura 9. Principales metabolitos de la oxidación etionamida (14)
(Modificado de Vannelli et al., 2002)

La enzima aldehído oxidasa (AOX) metaboliza un amplio rango de

compuestos heterociclos que contienen átomos de nitrógeno (tales
como purinas, pirimidinas, pteridinas, quinolinas y diazanaftalenos). Un
ejemplo es el pro-fármaco famciclovir (13) usado en el tratamiento de la
herpes zoster, el cual primero es hidrolizado a su forma 6-
desoxypanciclovir (14), antes de ser oxidada por la enzima AOX a la
forma activa del agente antiviral panciclovir (15) (Figura 10) (Rashidi et
al., 1997; Panoutsopoulos & Beedham, 2004).

Figura 10. Metabolitos principales del famciclovir (13). (Modificado de

Panoutsopoulos & Beedham, 2004)

149
Otra de las principales enzimas encargadas del metabolismo de
xenobióticos es la xantina oxidorreductasa, la cual se encarga del
metabolismo de purinas (de la serie de oxidaciones de hipoxanitina (16),
xantina (17) y finalmente a ácido úrico (18) mediante la introducción de
dos grupos carbonilo). Como es conocido, el exceso en el catabolismo
de purinas produce un estado de hiperuricemia en sangre para
posteriormente desencadenar las complicaciones de la gota. El
alopurinol (19) se ha descrito como uno de los principales fármacos
contra la esta enfermedad, esta molécula actúa de dos formas
principales: como un inhibidor competitivo y como sustrato de la
enzima, esta segunda da lugar al principal metabolito que es aloxantina
(20), que también causa inhibición competitiva de la enzima (Figura 11)
(van Meerten et al., 1995).

Figura 11. Metabolismo de purinas, principal metabolito del alopurinol

19 (Modificado de van Meerten et al., 1995)

150
Reacciones de Hidrólisis.
Las reacciones de hidrólisis implican el rompimiento de enlaces con la
subsecuente entrada de moléculas de H2O, los grupos funcionales
susceptibles a este tipo de reacciones son dos: los ésteres
(carboxilésteres, lactonas, ésteres inorgánicos, etc.) y las amidas
(carboxiamidas, sulfamatos, fosfoamidas, lactamas, etc.). Existe una
gran cantidad de hidrolasas capaces de realizar este tipo de rupturas.
En la figura 10 se muestra el mecanismo principal por el cual sucede la
hidrólisis de ésteres y amidas. En el sitio catalítico enzimático el grupo
carbonilo encuentra una zona electrófila (Z+) con la que tiene
interacción, posteriormente el heteroátomo localizado en la posición
alfa al grupo carbonilo recibe un protón, lo que carga de manera
positiva a dicho heteroátomo y lo hace mejor grupo saliente.
Finalmente con el ataque de un nucleófilo (Y:) se promoverá la ruptura
del enlace.

Figura 12. Mecanismos principales de hidrólisis de ésteres y amidas

Un claro ejemplo de la acción de las hidrolasas en el metabolismo de

biotransformación de fármacos es en la talidomida (21), la cual al sufrir
apertura en el anillo de piperidin-2,6-diona genera los metabolitos 22 y
23, éstos al contener a un enlace tipo amida pueden ser oxidados
151
nuevamente para obtener el di-ácido carboxílico 24. Por otra parte la
apertura en el anillo de isoindolina generará como principal metabolito
a 25, todos ellos con una solubilidad mayor al compuesto inicial de
talidomida (Figura 13) (Testa & Mayer, 2003).

Figura 13. Metabolitos de biotransformación de la talidomida 21

(Modificado de Testa & Mayer, 2003)

METABOLISMO DE BIOTRANSFORMACIÓN DE FASE II:

REACCIONES DE CONJUGACIÓN
Generalmente este tipo de biotransformaciones suceden después de
una oxidación, reducción o hidrólisis. La ventaja de estas reacciones es
que neutralizan a los intermediarios altamente inestables y reactivos que
suelen producirse en la fase I; sin embargo, en algunas ocasiones las
reacciones de conjugación generan un compuesto tóxico para el ser
humano.
¿Cómo se puede detectar si algún metabolito sufrió alguna reacción de
Fase II? Para responder la pregunta se debe analizar si el metabolito
produce un conjugado acoplándose a una molécula o grupo funcional
152
endógeno (endocon). La molécula endógena o grupo funcional debe
ser altamente polar (hidrofílico) y tener un rango de peso molecular
entre 100-300 Da. Otra forma de responder a la pregunta es analizar si
las reacciones son catalizadas por transferasas. Un tercer criterio es
cuando la reacción de conjugación involucra un cofactor que se une a
la enzima y el sustrato en cercanía, dicho cofactor acarrea a la molécula
ó grupo funcional endógeno (Taylor & Triggle, 2006 a).
Conjugación con grupos metilo
Las metilaciones son catalizadas por metiltransferasas. El cofactor que
contiene el grupo metilo a ser transferido es la molécula de S-adenosil-
L-metionina 26 (SAM) (Figura 14). Cabe destacar que el grupo metilo
en el cofactor SAM se encuentra unido a un centro de sulfonio, lo que
le confiere un marcado carácter electrofílico, y explica la reactividad de
este tipo de moléculas. En la figura 14 se muestran los grupos
funcionales mayormente susceptibles a reacciones de metilación por
este tipo de enzimas (recuadro A), también se observan las reacciones
que involucran N-metilación, donde las principales enzimas encargadas
de ellas son: la nicotinamida-N-metiltransferasa (EC 2.1.1.1), la
histamina N-metiltransferasa (EC 2.1.1.8), la feniletanolamina-N-
metiltransferasa (EC 2.1.1.28), y la enzima no específica arilamina-N-
metiltransferasa. En el recuadro B se muestran las reacciones
principales de O-metilación y S- metilación, siendo las enzimas catecol-
O-metiltransferasa (EC 2.1.1.6), tiolmetiltransferasa (EC 2.1.1.9) y la
tiopurina metiltransferasa (EC 2.1.1.67) las reportadas principalmente
para este tipo de reacciones (Weinshilboum, 2000).

153
 Figura 14. Estructura del cofactor SAM 26, A) reacciones de N-
metilación y B) reacciones de O-metilación y S-metilación (Modificado
de Weinshilboum, 2000)

Conjugaciones con grupos sulfato

Este tipo de reacciones consiste en la transferencia de un grupo sulfato
a la molécula a partir del cofactor 3’-fosfoadenosina-5’-fosfosulfato 27
(3'-Phosphoadenosine-5'-phosphosulfate, “PAPS”). La reacción es
catalizada por sulfotransferasas (Figura 15). En la estructura del
cofactor PAPS, es posible observar que los grupos fosfato y sulfato se
encuentran unidos mediante un enlace anhídrido, la ruptura de dicho
enlace es exotérmica y provee entalpía a la reacción. Los grupos
154
nucleofílicos como hidroxilos (fenoles, alcoholes o hidroxilaminas)
(Figura 15A), aminas primarias o secundarias (Figura 15B) reaccionarán
con el grupo saliente SO3-, para dar lugar a la formación de un
sulfoéster o un sulfamato (Armstrong & Bertozzi, 2000). Las
principales enzimas encargadas de catalizar la transferencia de grupos
sulfato se encuentran solubles en el citosol celular.

Figura 15. Estructura del cofactor PAPS (27), A) reacciones de O-

sulfatación y B) N-sulfatación (Modificado de Runge-Morris &
Kocarek, 2005)

Conjugaciones con ácido glucorónico

La conjugación con ácido glucorónico se considera la principal reacción
del metabolismo de fase II, esto debido a la gran diversidad de grupos
funcionales que sufren este tipo de reacciones, así como a los sustratos
que se pueden acoplar a dichas enzimas. El ácido glucorónico (28)
proviene del cofactor uridina-5’-difosfo-α-D-ácido glucorónico 29,
UDPGA (Figura 14). Este cofactor se produce de manera endógena a
partir de UDP-α-D-glucosa, la cual sufre una oxidación en el C6 para
convertirse a UDPGA. El mecanismo de esta reacción inicia con el
155
ataque nucleofílico hacia la molécula de UDPGA, lo cual promueve la
inversión de la configuración de α a β, por lo tanto todos los
metabolitos generados a partir de este tipo de reacciones son
considerados como β-glucorónicos. Debido a que los nucleofilos
atacan a estas moléculas existe una amplia variedad de grupos
funcionales con esta característica, y se pueden encontrar reacciones de
S-, N-, O- y C-glucorinidación (Figura 16 A y B).

Figura 16. Estructura del UDPGA (33), A) reacciones de O- y C-

glucoronidación, B) Reacciones de N- y S- glucoronidación
(Modificado de Taylor & Triggle, 2006 b)

Reacciones de acetilación
El cofactor principal involucrado en las reacciones de acetilación es la
acetil-CoA 30 (Figura 17). El grupo acetilo en la molécula de acetil-
CoA se encuentra activado por un puente tioéster el cual es más
156
reactivo en comparación con el puente oxoéster. El endocon (grupo
acetilo) es transferido a la molécula que contiene grupos funcionales
nucleofílicos como lo son grupos amino, hidroxilo o tiol (Figura 17).

Figura 17. Estructura del cofactor acetil coenzima A (30), A) reacciones

de N- y O-acetilación (Modificado de Kawamura et al., 2005)

La conjugación de xenobióticos con acetil-CoA se considera una

excepción en el metabolismo de fase II debido a cuatro razones
principales: 1) la reacción inicia con la activación del sustrato a un
estado intermediario entre la unión enzima-sustrato-adenilato, este
intermediario posteriormente reacciona con una molécula de CoA-S
para formar el conjugado acil-CoA (Figura 18); 2) el conjugado
generado R-S-CoA nunca es excretado por el cuerpo y solo ha podido
ser observado de manera in vitro utilizando infrarrojo; 3) los conjugados

157
generados R-CO-S-CoA son ampliamente utilizados en una gran
cantidad de rutas metabólicas ya sean anabólicas o catabólicas; 4) como
consecuencia del punto anterior, el metabolismo endógeno incorpora
este tipo de conjugados a sus rutas para formar distintos tipos de
moléculas, esto se ha observado principalmente en el proceso de β-
oxidación (Knights & Drogemuller, 2000).
En la figura 18 se observan las principales rutas metabólicas que toman
como sustrato la molécula conjugada con una molécula de acetil-CoA.
En la ruta A, se observa la conjugación con el aminoácido glicina, en la
ruta B la conjugación con glutamina y en la C la conjugación con
taurina. Aparte de la conjugación con aminoácidos también se ha
observado la conjugación con moléculas de colesterol (ruta D) y por
último se ha descrito también la participación en el metabolismo de
lípidos de estos conjugados observándose la formación de
triacilglicéridos híbridos (ruta E).

158
 Figura 18. Conjugaciones metabólicas que involucran intermediarios
de Acetil-CoA, como conjugación con glicina (A), glutamina (B),
taurina (C) y colesterol (D), así como la formación de triglicéridos
híbridos (E) (Modificado de Taylor & Triggle, 2006 b)

Conjugación con glutatión

El glutatión 31 es una molécula tripeptídica que contiene un grupo tiol
(Figura 19) y es una de las moléculas más importantes en la
detoxificación de fármacos y xenobióticos, ya que puede reaccionar en
una gran cantidad de formas debido a su capacidad redox. Existe un
equilibrio entre la forma reducida del glutatión GSH y la forma oxidada
de ésta molécula GSSG. La molécula GSH puede reducir peróxidos y
nitratos orgánicos, mientras que GSSG puede oxidar el radical del
anión superóxido (Ketterer, 1982).
Aunque el papel del glutatión en el cuerpo humano es principalmente
para estabilizar radicales libres, también participa en la conjugación con
159
xenobióticos promoviendo su eliminación. Las principales enzimas
encargadas de realizar este tipo de reacciones de conjugación son las
glutatión transferasas (EC 2.5.1.18) y glutatión peroxidasas (EC
1.11.1.9).
La reactividad de la molécula de glutatión se debe a su grupo tiol, que
lo hace un muy buen nucleófilo. Esta característica se puede
incrementar de manera significativa cuando se encuentra en su forma
desprotonada como tiolato, de ésta forma el glutatión se puede unir al
sitio activo de la enzima para llevar a cabo la transferencia de éste
grupo funcional a una gran cantidad de compuestos con grupos
electrofílicos, el mecanismo de reacción puede ser por sustitución o
adición nucleofílica. Se ha descrito que las moléculas siguen sufriendo
biotransformaciones después de la conjugación con glutatión, el
rompimiento de éste conjugado del lado glutamil con la enzima
glutamiltranspeptidasa y del lado glicil por la enzima aminopeptidasa
M, liberan el metabolito conjugado de cisteína 33 que posteriormente
es N-acetilado para producir los derivados de ácidos mercaptúricos 34,
aislados a partir de la orina (Armstrong, 1997) (Figura 19).
La formación de estos ácidos mercaptúricos no indica precisamente el
total de reacciones de biotransformación pues se ha observado que la
acción de una β-liasa libera el tiol correspondiente, el cual puede sufrir
metilación y procesos de β-oxidación (Figura 19).

160
Figura 19. Estructura del glutatión 36, formación del conjugado 37 con
grupos R, metabolitos principales de los conjugados como conjugados
de cisteína 38, formación de ácido mercaptúrico 39 y metabolismo de
los S-conjugados (Modificado de Ketterer, 1982)

El estudio de las reacciones involucradas en la degradación de

compuestos ajenos al cuerpo humano (metabolismo de fármacos) ha
sido siempre un tema de interés. El descubrimiento de las principales
modificaciones estructurales realizadas a un compuesto ha
proporcionado información valiosa utilizada en el desarrollo de
fármacos, sobre todo en la predicción de su vida media, la actividad de
éste mismo en el cuerpo humano (mecanismo de acción) y los efectos
tóxicos que puede presentar. El metabolismo de fármacos será un tema
de interés por muchos años más, debido a que da pauta al desarrollo de
moléculas especializadas que solo contengan efectos benéficos para el
cuerpo humano y ayuden a combatir la enfermedad.
161
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