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06-10-2010
PROCEDIMIENTO ENUMERACION
Revisión: 0
LISTERIA MONOCYTOGENES EN
ALIMENTOS ISO 11290-2. MODIFICADO
Fecha revisión:
06-10-2010
Sección Microbiología PRT-712.02-093 Página 1 de 20
Alimentos
1. OBJETIVO
Determinar el número de unidades formadoras de colonias (UFC) de Listeria monocytogenes
en matrices de alimentos.
3. FUNDAMENTO
Listeriosis es una de las enfermedades más importantes transmitidas por los alimentos.
Conforme a su comportamiento en matrices alimentarias, se definen criterios microbiológicos
diferentes para: alimentos listos para el consumo (LPC), en los que no puede crecer L.
monocytogenes y alimentos LPC, en los que si puede crecer L. monocytogenes.
El crecimiento de L. monocytogenes puede ser controlado, con factores tales como, un pH
menor a 4,4; una actividad de agua (aw) menor a 0,92; o una combinación de ambos factores,
un pH menor de 5.0 con una aw menor de 0,94, a través de la congelación, siempre que esta
condición se mantenga durante todo el período, hasta antes de ser consumido, o por la
refrigeración por un lapso de menos de 5 días.
Los métodos convencionales siguen siendo el patrón de oro con el que se comparan los
restantes métodos.
Este método ISO requiere 6 etapas sucesivas:
- Preparación suspensión inicial
- Resucitación por 1 hora a 20º C
- Siembra en placa en superficie en duplicado en medios de cultivo selectivos.
- Incubación a de las placas a 37º C y examen a las 24 y 48 h.
- Confirmación de las colonias presuntivas de L. monocytogenes
- A partir de las colonias confirmadas, calcular el número de L. monocytogenes por
gramo o por mililitro de muestra.
4. REFERENCIAS
4.1 ISO 11290-2: 01/07/1998 “Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal
method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes - Part 2:
Enumeration method”.
4.2 ISO 6887 “Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Preparation of test
samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination --
Part 4: Specific rules for the preparation of products other than milk and milk products,
meat and meat products, and fish and fishery products”o cualquier norma estándar
apropiada para los productos involucrados).
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4.3 ISO 11290-2: 1998 Enmienda 1: 15/10/2004 “Microbiology of food and animal feeding
stuffs - Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria
monocytogenes- Part 2: Enumeration method”.
4.4 ISO 7218 Microbiology of food and animal feeding stuffs -- General requirements and
guidance for microbiological examinations.
4.5 PRT-712.03-086 “Procedimiento para identificación bioquímica de cepas de Listeria
monocytogenes aisladas en alimentos y ambiente”.
5. TERMINOLOGÍA
No aplica.
7. DESARROLLO
7.1 Muestreo:
7.1.1 No forma parte de este procedimiento. Si no hay una normativa específica sobre el
muestreo de los productos involucrados, es recomendable que las partes
interesadas lleguen a un acuerdo sobre esta materia.
7.3 Procedimiento
7.3.1 Consideraciones: la elección de la temperatura de incubación está dada entre 35
ºC o 37 ºC, esta temperatura deberá ser acordada por las partes y registrada en el
informe de ensayo.
7.3.2 Porción para el ensayo, suspensión inicial y diluciones:
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7.3.4 Enumeración
7.3.4.1 Después de la incubación por 24 horas si el desarrollo de las colonias es leve o no
se observa desarrollo realizar una incubación adicional de 18 h a 24 h ± 3 horas.
7.3.4.2 Observar la presencia de colonias presuntivas de Listeria spp.
7.3.4.3 Las colonias en agar cromogénico (ALOA, Chromagar) para Listeria spp dentro
de las 24 h ± 3 horas son pequeñas y verdes debido a la actividad de β-
glucosidasa que produce cambio de color verde - azulado en las colonias.
7.3.4.4 Otros organismos los cuales también poseen la enzima β-glucosidasa tales como
enterococos, son inhibidos por los agentes selectivos que posee el medio (sulfato
de polimixina B, cicloheximida, ceftazidima, ácido nalidíxico).
7.3.4.5 Las especies patógenas como L. monocytogenes y L ivanovii son diferenciadas por
la actividad de la fosfolipasa C, específica en el fosfatidil-inositol. Esta fosfolipasa
(enzima: lecitinasa) hidroliza la lecitina en el medio produciendo un halo opaco
alrededor de las colonias.
7.3.4.6 Las colonias de L. monocytogenes son azul-verdosa con un halo opaco. Las
colonias de Listeria spp son azul- verdosas sin halo.
7.3.4.7 Algunas cepas de L monocytogenes pueden mostrar un halo muy débil (no halo)
en casos de estrés, en particular de estrés ácido.
7.3.4.8 Algunas cepas de L. monocytogenes son caracterizadas por una lenta o retardada
actividad de la fosfolipasa. Tales bacterias son detectadas cuando la duración total
de incubación es mayor, por ejemplo 4 días.
7.3.4.9 Contar todas las colonias presuntivas o sospechosas de Listeria spp en cada placa
que contiene menos de 150 de colonias características y no características.
α = _b _ x C
A
Donde:
7.4.1.2 Las que contienen menos de 150 colonias de L. monocytogenes, una de las cuales
contiene al menos 15 colonias de L. monocytogenes.
7.4.1.3 Calcular el número N de L. monocytogenes en 1 mL o 1 g de producto, usando la
fórmula siguiente:
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N= ____∑α_______
V (n1 + 0,1 n2) d
Donde:
7.4.1.4 Redondear los resultados obtenidos a dos cifras significativas (Ver ISO 7218
para un ejemplo).
7.4.1.5 Tomar como resultado el número de L. monocytogenes por mililitro (productos
líquidos) o por gramo (otros productos), expresado como un número entre 1,0 y
9,9 multiplicado por la potencia de 10 apropiada.
7.4.2.4 Si dos de las placas del nivel de la suspensión inicial no contienen ninguna
colonia, exprese el resultado como sigue:
dxV
Donde:
7.4.3 Precisión
7.4.3.1 Ver ISO 7218.
7.6 Informe
7.6.1 El informe deberá especificar el método utilizado, la temperatura de incubación y
los resultados obtenidos. Esto también es válido para todos los detalles que no se
especifican en esta parte del ISO 11290 o consideradas como opcional, junto con
los detalles de cualquier incidente que puede haber influenciado el resultado.
7.6.2 El informe deberá contener toda la información necesaria para la completa
identificación de la muestra.
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8. REGISTROS
8.1 Registro Resultados análisis Listeria monocytogenes
9. ANEXOS
Anexo Nº 1: Diagrama del procedimiento (Normativo)
Anexo Nº 2: Composición y preparación de medios de cultivo y reactivos. (Normativo)
Anexo Nº 3: Diagrama iluminación de Henry (Informativo)
Anexo Nº 4: Características bioquímicas Listeria spp
Anexo Nº 5: “Registro Resultados análisis Listeria monocytogenes”, RG-712.00-077
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ANEXO Nº 1
Diluyente para la preparación de la suspensión inicial (agua peptonada tamponada) o medio base para ½ caldo
Fraser (9 partes diluyente x g o 9 partes de diluyente x mL)
ANEXO Nº 2
1.2. Preparación:
- Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario.
- Ajustar a pH (medido con pH- metro), si es necesario de modo que después de la
esterilización éste sea 7,0 ± 0,2 a 25ºC.
- Dispensar el medio en frascos o contenedor de capacidad adecuada para obtener
porciones apropiadas para el ensayo.
- Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ºC.
2. Medio base para caldo ½ Fraser con citrato de amonio hierro (III)
2.1 Medio base para caldo ½ Fraser
2.1.1 Composición
Digerido enzimático de caseína.....……5,0 g
Digerido enzimático de tejido animal....5,0 g
Extracto de malta………………………5,0 g
Extracto de levadura …………………..5,0 g
Na Cl.....................................................20,0 g
Na 2 HPO4 x 2 H2 O..............................12,0 g
KH2 PO4................................................1,35 g
Esculina...................................................1,0 g
Agua.........................................................1 L
2.1.3 Preparación
- Disolver en agua los componentes o la base completa deshidratada por calentamiento si
es necesario.
- Ajustar a pH si es necesario de modo que después de la esterilización éste sea 7,2 ± 0,2 a
25 ºC.
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un respaldo de la ISO de este producto. El uso de otro medio con la misma formulación es
permitido.
3.1.2 Preparación
- Disolver en agua por ebullición los componentes deshidratados o la base deshidratada
completa.
- Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121ºC.
- Ajustar pH, si es necesario, de manera que después de la esterilización se de 7,2 ± 0,2.
3.2.2 Preparación
- Disolver el ácido nalidíxico sal de sodio en 5 mL del hidróxido de sodio y esterilizar
por filtración.
3.3.2 Preparación
- Disolver la ceftazidima en 5 mL de agua y esterilizar por filtro de membrana de 0,45
µm.
3.4.2 Preparación
- Disolver la polimixina B en 5 mL de agua.
- Esterilizar por filtración a través de filtro de membrana de 0,45 µm.
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3.5.1.2 Preparación
- Disolver la cicloheximida en 2,5 mL de etanol y luego añadir 2,5 mL de agua.
- Esterilizar por filtración a través de filtro de membrana de 0,45 µm.
3.6 Suplemento
3.6.1 Preparación
- Disolver 2 g de L- α-fosfatidilinositol (Sigma P 6636 ® 2) en 50 mL de agua fría.
- Revolver por al rededor de 30 minutos hasta obtener una suspensión homogénea.
- Esterilizar en autoclave a 121ºC por 15 minutos y enfriar entre 48ºC a 50ºC.
- Nota: 2 P6636 es el nombre comercial del producto suministrado por Sigma. Esta
información es otorgada para la conveniencia de los usuarios de esta parte de la ISO
11290 y no constituye un respaldo de la ISO de este producto. Productos equivalentes
pueden ser usados si ellos pueden demostrar los mismos resultados.
Suplemento...........................…………………….50 mL
a
925 mL si la solución de Anfotericina es usada
3.7.2 Preparación
- Añadir las soluciones al agar base fundido a 50ºC, mezclando bien entre cada adición.
- El pH del medio completo debe ser de 7,2 ± 0,2 a 25ºC.
- El medio debe ser homogéneamente opaco.
4.2 Preparación:
- Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en el agua por ebullición.
- Ajustar a pH (medido con pH-metro), si es necesario de modo que después de la
esterilización éste sea 7,3 ± 0,2 a 25 ºC.
- Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ºC.
- Dejar solidificar en tendido.
- En la preparación de placas de agar, dispensar el medio en placas estériles y en cantidades
apropiada para el ensayo.
- Nota: Si la iluminación de Henry es realizada, es importante que la capa del agar del
medio sea delgada (aproximadamente 12mL por placa de 90mm de diámetro).
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8. Agar Motilidad
8.1 Composición
Digerido enzimático de caseína..……..20,0 g
Digerido enzimático de tejido animal….6,1 g
Agar .........................................................3,5 g
Agua........................................................... 1 L
8.2 Preparación
- Disolver los componentes en el agua por calentamiento.
- Ajustar a pH, si es necesario de modo que después de la esterilización éste sea 7,3 ± 0,2 a
25 ºC.
- Dispensar el medio en tubos de capacidad adecuada para obtener porciones 5 mL
- Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ºC
9.1 Base
Ver 6.1
ANEXO Nº 3
Prueba de iluminación de Henry (Informativo)
Examine las placas usando una fuente de luz blanca, lo suficientemente potente para
iluminar bien las placas de tal forma que golpee en el fondo de éstas en un ángulo de 45º.
Cuando examine bajo esta luz transmitida oblicuamente (Iluminación Henry) directamente
desde arriba de la placa, las colonias de Listeria spp, presentan un color azulado y una
superficie granular.
ANEXO Nº 4