Método de BCA

El ácido bicinconínico, sal sódica, es un compuesto capaz de formar un complejo

púrpura intenso con inones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base
de un método analítico capaz de monitorizar el ión cuproso producido en una
reacción entre las proteínas con Cu2+ en medio alcalino (reacción de Biuret). La
estabilidad del reactivo y el cromóforo proporciona un método para la
cuantificación de proteínas que es sencillo, rápido, muy sensible, y que muestra
una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros métodos.

Ventaja Es el método mas sensible Es el que muestra menos interferencias

Método de Bradford

Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también Serva Blue)

a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos formas una azul y
otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo
proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre.
Este método es sensible (1-15 µg), simple, rápido, barato y pocas sustancias
interfieren en su determinación. Entre las sustancias que interfieren están los
detergentes y las soluciones básicas.

Ventaja Muy sensible

Desventaja Muestra interferencias con detergentes

Método de Dumas

Fundamento

Se caracteriza por pirólisis completa de la muestra y medición del contenido de

nitrógeno de los gases de combustión.
El nitrógeno puede ser medido con manómetro después de absorber el dióxido de
carbono en una solución alcalina o por conductividad térmica en métodos
automatizados.

Ventaja

Muestra equivalencias satisfactorias al compararlo con el método de Kjeldahl en

análisis de forrajes y alimentos infantiles, aunque con valores levemente mayores.

Desventajas

Incluye nitrógeno inorgánico.

Requiere pequeñas cantidades de muestra 5-50 mg, finamente dividida y

homogénea para minimizar el error de muestreo.

Este método no puede aplicarse a material húmedo por lo que debe efectuarse un
secado previo.

. Métodos radioquímicos

Se han descrito dos métodos:

a) Activación neutrónica

Fundamento

Se irradia una cantidad pesada de muestra con neutrones lo que produce el paso
de l4N a 13N. Este positrón tiene una vida media de 10 minutos y emite radiaciones
gamma las que se registran en un contador de centelleo . Las cuentas se
relacionan con el contenido de nitrógeno de la muestra.

Ventajas

Simple; rápido.
Sin problemas de contaminación.
Los valores encontrados presentan
buena correlación con el método de
Kjeldahl.

Desventaja

El costo de infraestructura es muy elevado.

b) Activación protónica
Fundamento

Similar al anterior con la variante de que la muestra se irradia con protones y se

efectúa la conversión de 14N a 14O, un isótopo que decae con la emisión de un
protón y de radiaciones gamma las que son registradas y relacionadas con el
contenido de nitrógeno de la muestra.

Métodos químicos

Fundamento

Las proteínas presentan un amplio rango de comportamiento químico debido a la

propiedad de los aminoácidos de tener diferentes tipos de grupos funcionales, a
las reacciones químicas de estos grupos y a los enlaces peptídicos.

Consideraciones en la aplicación de los métodos químicos:

- Los alimentos son una matriz compleja por lo que se sugiere que estos
métodos empíricos e indirectos sean calibrados con el método de Kjeldahl;
- se espera una buena correlación entre estos dos tipos de determinación de
proteína cuando la relación N no proteico/N proteico es baja y constante; y
- son satisfactorios para leche y cereales e insatisfactorios para la mayoría de
los vegetales y mezclas de alimento

b) Método "dye-binding"

Principio químico

Se caracteriza por la formación de un coágulo de proteína, coloreado e

insoluble producto de la reacción de la proteína con una solución coloreada
de ácido sulfónico a pH 2. El anión coloreado se une por asociaciones
electrostáticas a los sitios básicos de la proteína, por ejemplo a los grupos M-
amino de lisina, guanidina de arginina, imidazol de histidina y aminos
terminales. Además se producen atracciones intermoleculares por
interacciones hidrofóbicas entre la proteína y la mitad no iónica del anión y
entre el anión unido a proteína y la mitad no iónica del anión en solución.

El coágulo se separa por filtración y se mide colorimétricamente el exceso de

tintura en el sobrenadante. Esta medida se relaciona con el contenido de
proteína.

Lectura

A595nm
Consideraciones

El método es empírico por lo que se debe buscar la concentración de tintura

ideal que sature la proteína y forme el coágulo pero que no pierda
sensibilidad.

Ventajas

Util en análisis de rutina de muestras similares.

Económico y rápido.
Preciso como el método de Kjeldhal.
Usado como método de referencia.

Desventajas

Dificultad en encontrar tinturas puras.

Desuniformidad en la calidad de las tinturas de un lote de fabricación a otro,

por lo que se require la calibración del método con cada lote.

No es aplicable a alimentos que varíen su contenido en grupos aminos

(proteólisis, pardeamiento).

c) Método de destilación alcalina

Fundamento

La hidrólisis de las amidas en medio alcalino fuerte da origen a amoníaco el

cual es destilado y su valor es relacionado con el contenido de proteína.

Se ha encontrado que el rendimiento de amonio es altamente reproducible

para una proteína dada.

e) Método de titulación con formol

Fundamento

A la muestra neutralizada con álcali se le agrega formaldehido en exceso el

cual reacciona con cada grupo básico de lisina y arginina. El exceso de
formaldehido se neutraliza con un exceso de álcali estándar el cual se titula, y
se relaciona con el contenido de proteína.

Desventaja

Su reproducibilidad es menor a la de otros métodos alternativos.

. Métodos físicos

Consideraciones

Son más simples, rápidos y el costo por análisis es menor aunque el costo de
los equipos es elevado. La exactitud de estos métodos se relaciona con las
características del material a analizar. La concordancia con nitrógeno total
depende de que el material no varíe de muestra en muestra.

a) Espectroscopía infrarroja

Fundamento

Se aprovecha la absorción del grupo amida del enlace peptídico a 6,46 Tm.

Ventajas

Rápido, análisis de multicomponentes No destructivo.

Desventajas

Interferido por agua.

Proceso de calibración complejo.

b) Espectroscopía infrarroja reflectante

Fundamento

La muestra se ilumina con seis longitudes de onda cercanas a la radiación

infrarroja (0,75-2,5 Tm) y se detecta la luz reflejada.

Consideración

Es necesaria la calibración contra un conjunto de muestras estadísticamente

significativas, analizadas por métodos de referencia tradicionales.

Ventajas

Rápido, análisis de multicomponentes. Aplicable a materiales sólidos.

Cuantifica proteína en presencia de agua.

Desventajas

Interfieren almidones y lípidos.

Desplazamiento de espectro de reflectancia por humedad contenida en
las partículas.
Proceso de calibración complejo.

c) Espectrofotometría ultravioleta

Fundamento

Mide proteínas en solución con absorción máxima a 280 nm atribuible a los

anillos aromáticos de tirosina y triptófano y entre 180-220nm.

Ventajas

Rápido, no destructivo.

Util para monitorear eluentes en columnas cromatográficas.

Desventaja

Interferencia de otros compuestos (ácidos nucleicos, nucleótidos).

d) Métodos refractométricos

Fundamento

Mide la refracción directa de la proteína en solución o el cambio de índice de

rafracción causado por la remoción de la proteína de la solución.

f) Espectroscopía electrónica

Fundamento

Irradiación del material con rayos X y cuantificación de los fotoelectrones

liberados característicos al átomo de N del grupo amida de la proteína.

Ventaja

Buena correlación con contenido de N total.

Pueden determinarse simultáneamente otros grupos de interés (grupos
sulfuras de aminoácidos).

ELECTROFORESIS

Una de las técnicas más sencillas para la separación (y posterior

cuantificación) de proteínas es la electroforesis (técnica en la cual una
partícula cargada se hace desplazar a través de un medio aplicando un
campo eléctrico). Cuando se aplica un campo eléctrico a un medio que
contiene partículas cargadas, las partículas cargadas negativamente migran
 hacia el ánodo o polo positivo mientras que, las cargadas positivamente
migran hacia el electrodo negativo (cátodo). Este principio se puede aplicar
para separar las fracciones de proteínas puesto que los aminoácidos (aa)
constituyentes de la proteínas, y por tanto las proteínas, son compuestos
anfóteros que se comportan como ácidos (ceden protones y quedan con
carga negativa) o bases (captan protones y quedan con carga positiva)
dependiendo del medio en el que estén.

INMUNOELECTROFORESIS

La inmunoelectroforesis es una inmunodifusión en la que se aplica una corriente

eléctrica para separar las proteínas de la muestra. Esta técnica se realiza en dos
fases: · Electroforesis para separar las proteínas de la muestra en función de su
carga. · Aplicación de un antisuero, mono o poliespecífico, en un surco paralelo a
la dirección del campo eléctrico. El o los anticuerpos difunden durante 18-24h. Si
se produce el reconocimiento Ag-Ac se forman bandas de precipitación. Se utiliza
fundamentalmente para analizar, cualitativamente, alteraciones de distintas
proteínas, especialmente inmunoglobulinas en suero, orina o líquido
cefalorraquídeo