Desarrollo embrionario de ​Danio rerio ​"pez cebra"

Hamilton-Buchanan, 1822 (Cypriniformes-Cyprinidae) en

presencia de ciclofosfamida

Embryonic development of the ​Danio rerio ​¨zebrafish¨

Hamilton-Buchanan, 1822 (Cypriniformes-Cyprinidae) in
presence of cyclophosphamide
Arce, Medalith, Uribe, Carmen, Príncipe, Diana & Valdiviezo, Adrian
* Laboratorio de Biotecnología Animal LA-78, Facultad de Ciencias Biológicas Universidad Ricardo Palma (URP),
Santiago de Surco, Lima-Perú

Citación sugerida:​ ​Arce, M ​et al​., 2018. Perú.​ ​Desarrollo embrionario de ​Danio rerio​ "pez cebra" en presencia de
ciclofosfamida. Universidad Ricardo Palma, Facultad de Ciencias Biológicas
 INTRODUCCIÓN
El ¨pez cebra¨ Danio rerio,​ es una especie pequeña de agua dulce que se utiliza como
un modelo biológico para realizar bioensayos. La facilidad de su manejo, su gran
desove y el tamaño de sus huevos fecundados, hacen de esta especie un modelo
excelente para estudiar teratogénesis inducida por sustancias tóxicas. El desarrollo
embrionario es rápido (72h desde la fecundación hasta la eclosión a 28 ◦ C), sus huevos
son fácilmente visibles debido a la transparencia de su corion y embrión. Además el
proceso de su embriogénesis (Álvarez, 2011). Se encuentra ampliamente descrito por
cuatro etapas:

-Segmentación: Primera etapa que se caracteriza por múltiples procesos de mitosis hasta
la formación del blastocele, que es la primera cavidad general de los vertebrados y que
genera al blastocisto.
-Gastrulación: Se genera una invaginación en el blastocele que dará lugar más tarde a la
médula espinal. En esta etapa, el embrión se diferencia en 3 capas germinales:
ectodermo (capa externa, de él se desarrolla el sistema nervioso), mesodermo y
endodermo. Las capas mencionadas anteriormente contienen las instrucciones que
llevarán el desarrollo del embrión. En esta etapa están presentes las vías de señalización
WNT (Wingless Integration Genes) y hedgehog.
-Neurulación: Las crestas neurales se unen para formar el tubo neural esbozo de la
médula espinal y el encéfalo.
-Organogénesis: Es el proceso por el cual el ectodermo, mesodermo y endodermo se
desarrollan en los diferentes órganos y estructuras del organismo. (Téllez et al., 2015).

La ciclofosfamida (CFM) es un medicamento inmunosupresor y antineoplásico

ampliamente utilizado. Es prodroga inactiva que después de la bioactivación enzimática
actúa como un agente alquilante bifuncional. Su acción farmacológica inhibe la
replicación del ADN y causa muerte celular por apoptosis. Es un agente citotóxico no
específico de fase, pero tiene mayor acción sobre células rápidamente proliferantes. La
CFM se utiliza para el tratamiento de varios tipos de neoplasias, así como en una gran
variedad de enfermedades reumatológicas, entre ellas lupus, vasculitis y artritis
reumatoide. Debido a que la mayoría de las enfermedades autoinmunes son comunes en
mujeres en edad fértil, es muy frecuente que sea necesario utilizar este fármaco para
tratar en ellas manifestaciones sistémicas graves. En las mujeres existe el riesgo de
infertilidad y amenorrea asociadas con el uso de CFM; dicho riesgo aumenta a mayor
edad y a mayor dosis acumulada.
La toxicidad aguda por CFM está relacionada con su citotoxicidad. Al igual que otros
agentes alquilantes, la CFM es más tóxica en tejidos con rápida proliferación celular
tales como el sistema hematopoyético, las células epiteliales del tracto gastrointestinal,
los folículos pilosos y las gónadas. También tiene potencial carcinogénico y
teratogénico. Este fármaco ha sido asignado a la categoría D durante el embarazo por la
Administración de Alimentos y Drogas de los Estados Unidos (FDA, por la sigla en
inglés de Food and Drug Administration). Aunque ha habido neonatos sanos de mujeres
expuestas a CFM durante la gestación, la información disponible en humanos demuestra
que son posibles la embriotoxicidad y la fetotoxicidad. A las mujeres en edad
reproductiva se les debe advertir sobre los riesgos de embarazarse mientras reciben la
terapia con CFM.
La administración de CFM a animales gestantes durante el primer trimestre puede
causar anomalías congénitas tales como exoftalmos, paladar hendido, alteraciones
esqueléticas y retardo en el crecimiento. (Restrepo, 2011)
No se ha realizado trabajos previos sobre el desarrollo embrionario de ​D. rerio en
presencia de ciclofosfamida. En el presente trabajo se estudia el desarrollo embrionario
en presencia de ciclofosfamida.
HIPÓTESIS
Si la Ciclofosfamida es un teratógeno entonces los embriones de ​Danio rerio expuestos
a concentraciones de 2 ug, 0.002 ug y 0.00002 ug mostrarán deformidades y anomalías
durante su desarrollo.

MATERIALES Y MÉTODOS
Acondicionar los especímenes de Danio rerio en el laboratorio
Se utilizó a ​D. rerio como modelo para el proyecto de investigación. Se utilizaron 4
peceras con dimensiones 50cm x 22cm para la pecera de machos debido a su rápido
desplazamiento y para las peceras post-reproducción, la pecera de hembras de 40 cm x
30.5 cm, 30 cm x 10 cm la pecera de crìa de pulgas de agua y 44.5 cm x 29 cm la
pecera de reproducción , en total 7 peceras acondicionadas con tres filtros SOBO dos
de 40 L en las peceras de machos y post-reproducción 1, y uno de 30 L en la pecera de
hembras, las peceras restantes contarán con oxigenadores de la marca SOBO;
utilizaremos cuatro termostatos de 50W y termómetros para certificar la temperatura del
agua.. La botella para reproducción de artemia encapsulada contará con un oxigenador
de la marca SOBO.

Prueba de calidad de agua para estimar la supervivencia de D. rerio

Colocamos 20L de agua de la grifería en las peceras de machos, hembras y

post-reproducciòn. La pecera de reproducción estuvo con 10 litros de agua de grifería
reposando por un mes. Se agregó 5ml de declorador Nutrafin dejándose reposar durante
siete días con el funcionamiento de los equipos (filtros, termostatos y termómetros). Al
término del tercer día se colocaron 2 a 3 individuos de ​D. rerio y se estimaron los s
indicadores de color, mortalidad y aleteo.

Se almacenará agua con declorador Nutrafin en botellas de 7 litros para el cambio de

agua cada semana. Por semana se extraerá 1 de 3 partes de agua de cada pecera y se
reemplazará por el agua almacenada.
 Apareamiento de los especímenes
Los especímenes se pusieron en la pecera de reproducción acondicionada con las
siguientes características:
- Superficies de la pecera pintadas de color negro dejando un pequeño espacio para
observación simulando sus condiciones naturales, siempre un número mayor de machos
que hembras (en este caso 5:4).
- Llenado de la pecera con 5 litros de agua o 1/3 de la pecera con agua reposada con
anticloro en condiciones controladas de temperatura a 28.5°C y una lámpara que
regulará la estimulación.
- Se colocó una malla cúbica de nylon de nxnx en la pecera de reproducción para
recolectar los huevecillos y para facilitar este proceso se colocaron placas petri
previamente autoclavadas para recolección.
- Los peces fueron alimentados con una dieta rica en proteínas con alimento vivo 7 días
antes de la puesta (dafnias, yema de huevo).
Obtención de huevos
Los huevos fecundados son visibles 24 horas después de la fecundación, siendo
recolectados con ayuda de una pipeta pasteur de plástico de nn de diámetro y colectados
en placas de plástico estériles de tres divisiones (20 huevos por división) para facilitar
su cuantificación en cada etapa del DE y hacer de este un proceso más asequible.

Desinfección de huevos

El primer día de recolección de huevos se procede a separar a los huevos hongueados

para su eliminación y no contaminación del resto de muestras.

Monitoreo de progresión de DE

La progresión del desarrollo embrionario de ​D. rerio será guiada respecto a los
intervalos utilizados en la bibliografía citada.

Tabla 1.​ Períodos y etapas del desarrollo embrionario de ​Danio rerio

Estadio hpf Descripción

Cigote 0 1 célula, huevo recién fecundado

Segmentación ¾-2 2,4,8,16,32,64 células

Blástula 2-5 128,256,512 células

30% de la epibolia

Gástrula 5-10 50% de la epibolia, anillo germinal, shield, 75-90% epibolia, brote de yema (bud).
Movimientos morfogenéticos de involución , convergencia y extensión del
 epiblasto, hipoblasto y eje embrionario, final de epibolia. Formación de cerebro
rudimentario y notocorda.

Segmentación 10-22 1-3-6-10-14-18-20-26. Somites, primordios de arco faríngeo, desarrollo de

de somites neurómeros, organogénesis primaria, primeros movimientos, aparición de la cola.

Pharyngula 24-48 1-3-6-10-14-18-20-26. Somites, primordios de arco faríngeo, desarrollo de

neurómeros, organogénesis primaria, primeros movimientos, aparición de la cola.

Eclosión 48 Morfogénesis completa de sistemas de órganos primarios, desarrollo del cartílago

en cabeza y estaño pectoral, inflación de vejiga natatoria, búsqueda de alimento.

*Tomado y adaptado de Kimmel et al. 1995.

Obtención de dosis de ciclofosfamida

La ciclofosfamida en su presentación de Neophos intravenosa será preparada colocando

10 ml de agua destilada. Después se sustraerá 1 ml y se agregará a un tubo con 9 ml de
agua de pecera, homogeneiza y proseguirá su dilución seriada hasta obtener 10
diluciones.

Número de Nº 1 Nº 2 Nº 3 Nº 4 Nº 5 Nº 6 Nº 7 Nº 8 Nº 9 Nº 10
tubo

Concentración 20000 2000 200 20 2 0.2 0.02 0.002 0.0002 0.00002

(​µg/10 ml)

Exposición de embriones al medicamento

Se separaron 36 huevos 6hpf y se dispusieron de la siguiente manera.

Grupo Experimental Réplica 1 Réplica 2

Grupo 1 (2 ug/10ml) 4 4 4

Grupo 2 (0.002 ug/10ml) 4 4 4

Grupo 3 (0.00002 ug/10ml) 4 4 4

RESULTADOS
Prueba de calidad de agua para estimar la supervivencia de D. rerio

- Color: cambio a color “blanco amarillento”; debido a que los peces introducidos
presentaban un color amarillo brillante y al ser agregados a las peceras iban perdiendo
el color.
- Mortalidad: porcentaje de supervivencia; existía una mortalidad de 100% en la
primera y segunda prueba; para la tercera prueba se obtuvo una mortalidad de 67% de la
pecera de machos y post-reproducción; los peces sobrevivientes (2) fueron pasados por
cada pecera cada 5 días obteniendo un resultado exitoso en la calidad del agua lo cual
muestra que las peceras están listas para traer a nuestros peces reproductores.
- Aleteo: tiempo de desplazamiento. El tiempo de desplazamiento normal de ​D.rerio en
hembras es de 5 cm/s y de machos es de 8.2 cm/s, los peces utilizados en la primera,
segunda y tercera prueba con mortalidad presentaban un tiempo de nado de 2 cm/s en
hembras y 3 cm/s en machos; así mismo, se ubicaban en la parte baja de la pecera y
algunos no lograban aletear.

Monitoreo de progresión del DE de Danio rerio en condiciones de laboratorio

 Tabla N°4.​ Primera reproducción- prueba control

Primera puesta

Día Hora Observaciones

1 14:37 214 huevos fecundados y 50 no

viables

3 10:40 122 huevos y 3 eclosionados

5 9:50 88 eclosionados

Tabla N°5. ​Segunda reproducción – prueba experimental

Segunda puesta

Día Hora Observaciones

1 10:30 yo 191 huevos fecundados y 40 no

viables

2 14:20 150 huevos fecundados y 41 no viables

5 9:50 0 eclosionados

Tasa de mortalidad

Tabla N°6. ​Presencia de curvatura en el desarrollo de la cola

Tratamiento Concentración Curvatura

Control ------- 0

1 2 ​(​µg/10 ml) 50º

2 0.002 ​(​µg/10 ml) 0

3 0.00002​(​µg/10 ml) 0

Tabla N°7. ​Retraso del desarrollo embrionario​ ​(No eclosión 72 hpf)

 Huevos no
Tratamiento Concentración
eclosionados

Control ------- No presenta

1 2 (µg/10 ml) 4

2 0.002 (µg/10 ml) 3

0.00002(µg/10
3 0
ml)

Tabla N°8.​ Presencia de corion en región cefálica 72 hpf

Presencia de
Tratamiento Concentración
corion

Control ------- No presenta

1 2 (µg/10 ml) 0

2 0.002 (µg/10 ml) 4

3 0.00002(µg/10 ml) 0

Tabla N°9. ​Tasa de Mortalidad en 72 hpf y 120 hpf.

CONCENTRACIÓN HUEVOS NO HUEVOS %MORTALIDAD ECLOSIONADOS %MORTALIDAD

VIABLES VIABLES (72 horas) (120 horas)

Grupo 1 2 10 0% 10 100%
(2ug/10ml)

Grupo 2 (0.002 2 10 40% 6 100%

ug/10ml)

Grupo 3 (0.00002 2 10 40% 6 100%

ug/10ml)

Se separaron 36 huevos 6hpf y se dispusieron de la siguiente manera:

 DISCUSIÓN

El primer estudio del desarrollo embrionario de ​Danio rerio fue realizado por Kimmel
et al. en 1995 , este artículo fue fundamental para la evaluación de cada etapa del
desarrollo embrionario del pez cebra en la etapa control y expuestos a ciclofosfamida.
Nuestros resultados indican la etapa de cigote a las 0 hpf al fecundarse el huevo,
posteriormente, la etapa de segmentación de ¾ a 2 hpf aproximadamente, la etapa de
blástula de 2-5 hpf, la gástrula de 5-10 hpf, la segmentación de somites de 10-22hpf,
pharyngula de 24-48 hpf y por último la eclosión a las 72 hpf muy similar a los valores
encontrados por Kimmel et al.

La ciclofosfamida se introdujo en la práctica clínica en 1958 y sigue siendo hoy en día

una de los agentes anticancerígenos e inmunosupresores más útiles, su dosis varía entre
1,5 y 60 mg / kg / día. Bernadette et al. 2016 menciona acerca de los antineoplásicos
más frecuentemente usados en oncología están los agentes alquilantes como la
ciclofosfamida, este forma enlaces covalentes entre sus grupos alquilo y las moléculas
nucleofílicas del ADN, pudiendo reaccionar con grupos fosfato y alquilar bases del
RNA. La ciclofosmida se encuentra clasificado como un teratógeno de clase x , en esta
clase se han encontrado en estudios tanto en animales como en mujeres embarazadas
una evidencia clara que los medicamentos causan anormalidades u riego para el feto,
son medicamentos donde el riesgo de la utilización en la mujer embarazada sobrepasa
claramente cualquier posible beneficio. Greenberg et al. 1984 presenta anomalías en las
extremidades del bebé en un paciente tratado con el medicamento,
nnoencuentrotrabajosqpueda descargarnnnnnnnnnn. ​No obstante, se encontró un reporte
de caso por Restrepo, N (2011) de una gestación exitosa después de exposición
inadvertida a ciclofosfamida durante el primer trimestre en una paciente con lupus
activo.

En el presente trabajo se ha pertubado el desarrollo embrionario del pez cebra utilizando

dosis de 2 (µg/10 ml), 0.002 (µg/10 ml) y 0.00002(µg/10 ml) de ciclofosfamida
encontrándose que se evidencia el efecto teratógenico en las etapas
de………………………………causando tal tal tal………………Estudios en etapas
similares…………
párrafo de melanocitos comprando con trabajos co efectos en creta neural:

Los melanocitos en pez cebra se originan de la cresta neural (Yang ​et al. 2004) de
donde también se derivan otra serie de células. Estos son formados a partir de SOX-10;
los cuales se desarrollan directamente vía un melanoblasto MITF (Mort ​et al. 2015) La
aparición de los melanocitos pigmentados comienza a las 24 hpf post fertilización.
(Yang ​et al. 2004) En contraste, con los embriones experimentales que comenzaron a
pigmentarse a las 32 hpf.

Los resultados obtenidos muestran que la exposición a Ciclofosfamida origina un

retraso en la aparición de melanocitos. Esto se debe al efecto de la ciclofosfamida que
es un citogénico. La CFM forma un compuesto llamado nitrógeno de mostaza que evita
la replicación del ADN (Povirk & Shuker, 1994). Sin embargo, presenta pigmentación
una vez removido el medicamento. Esta habilidad de reiniciar el proceso pigmentación
sugiere que posee melanocitos precursores o células madre del estadio larval que son
capaces de sentir los déficits de melanocitos y pueden ser reclutados para generar
nuevas células, aunque ​hemos sido incapaces de excluir formalmente la posibilidad que
otra cresta neural derivase células pigmentarias​, como xantóforos o iridóforos. O podría
actuar la transdiferenciación para reconstituir el patrón melanocítico larval (Yang ​et al.
2004)

Párrafo de corion:

Párrafo de cola:

Hubo anomalías a nivel de la cola. Se presentó curvatura de la médula espinal

presentando un ángulo de 50º +/- respecto al eje anteroposterior en las concentraciones
10-5. Estas fueron también reportadas por García et al (2018) en “efecto del
neonicotinoide - tiametoxam en el desarrollo embrionario del pez cebra “(​Danio rerio)​

Por otro lado se encontraron huevos no eclosionados en los tratamientos de mayor

concentración y se han encontrado en mayor número que otro tipo de alteraciones.

AGRADECIMIENTOS
Magister Carlos Jesus Scotto Espinoza por habernos brindado la capacitación para el
manejo del espécimen.
LUGAR DE EJECUCIÓN
Laboratorio de biotecnología animal LA-78. Facultad de Ciencias Biológicas, URP.
Surco-Lima. Perú.

REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA
García,K., Salazar,M. & García, J. (2018) efecto del neonicotinoide -
tiametoxam en el desarrollo embrionario del pez cebra (Danio rerio).
Revista toxicológica, 35, 22-27

Greenberg LH, Tanaka KR. 1964. Congenital anomalies probably induced by

cyclophosphamide. JAMA.188:423-6.

Kimmel, C; Ballard,W; Kimmel,S; Ullman,B; Schilling, T.(1995). Stages of

Embryonic Development of Zebrafish.DEVELOPMENTAL
DYNAMICS.

Mort, R. Jackson, I. & Patto, E. (2015) The melanocyte lineage in development

and disease Development, 142, 620-632 doi: 10.1242/dev.106567

Povirk, L. F., & Shuker, D. E. (1994). DNA damage and mutagenesis induced
by nitrogen mustards. Mutation Research/Reviews in Genetic
Toxicology, 318(3), 205–226. doi:10.1016/0165-1110(94)90015-9

Rocha, A; Ruíz, S; Coll, J. (2002). Método sencillo para producir huevos

embrionados de pez cebra.Dpto. Biotecnología, SGIT-INIA, Madrid,
España

Yang,C., Sengelmann, R. & Johnson, S.. (2004). Larval melanocyte

regeneration following laser ablation in zebrafish. ELSEVIER, 123,
924-929.
 ANEXOS
Control de D. rerio en condiciones de laboratorio

Cigoto, clivaje y blástula

Blástula
Gástrula

Gástrula y segmentación
Segmentación y Pharyngula