INSTITUTO TECNOLÓGICO DE

ACAPULCO
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA
ASIGNATURA:
MICROBIOLOGÍA GENERAL
GRUPO:
B
ALUMNA:
CONTRERAS SALAS PAOLA
N° EQUIPO:
2
NO. CONTROL
15320048
PROFESOR:
M.C. MIGUEL ANGEL DIAZ ALDAY
DISEÑO EXPERIMENTAL
MEDIOS DE CULTIVO
Fecha de entrega: 17 de febrero del 2019

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ÍNDICE

INTRODUCCIÓN .......................................................................................................................... 3
OBJETIVO GENERAL ................................................................................................................. 4
OBJETIVOS ESPECIFICOS ...................................................................................................... 4
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ....................................................................................... 4
JUSTIFICACION........................................................................................................................... 4
HIPOTESIS ................................................................................................................................... 4
MARCO TEORICO....................................................................................................................... 5
MATERIALES, EQUIPO Y SUSTANCIA ................................................................................ 11
PLAN DE INVESTIGACION. .................................................................................................... 12
PROCEDIMIENTO ..................................................................................................................... 12
CONCLUSIÓN ............................................................................................................................ 12
BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................... 13

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INTRODUCCIÓN

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es

observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el medio
de cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el cultivo.

Los microorganismos patógenos son organismos que no pueden ser observados si

no es con la ayuda de un microscopio, y que causan enfermedades en los seres
humanos. En el agua tienen unas características que los diferencian de los
contaminantes químicos, por ejemplo, son organismos vivos que no se disuelven en
el agua sino que coagulan o se anexan a substancias coloidales o sólidos en
suspensión que están presentes en el agua. Los microorganismos patógenos en el
agua se pueden dividir en tres categorías:

 Bacterias
 Virus
 Protozoos parásitos

Las bacterias y virus se pueden encontrar tanto en las aguas subterráneas como
las aguas superficiales, mientras que los protozoos son comunes de las aguas
superficiales.

Para poder estudiar a un microorganismo es necesario cultivarlo. Cultivar a un

microorganismo es proporcionarle las condiciones adecuadas para su crecimiento
y multiplicación.

Los nutrientes que requieren los microorganismos son: agua, carbohidratos,

nitrógeno, fosforo, azufre, calcio, cobre, etc. También es necesario brindarles las
condiciones ambientales adecuadas de luz, temperatura, oxigenación, humedad,
etc. Las bacterias crecen a 37C y un pH de 6.5- 7.5 y los hongos a 27C y un pH
de 4.5-6. Para poder cultivar a los microorganismos es necesario el uso de medios
de cultivo.

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OBJETIVO GENERAL
 Aprender técnicas y métodos de preparación y uso de medio de cultivo para
el desarrollo de microorganismos presentes en el ambiente, suelo, aire y
agua, para poderlos estudiar, diferenciar y clasificar.

OBJETIVOS ESPECIFICOS
 Obtener un cultivo axenico; es decir un cultivo puro que se forma a partir de
una sola célula.
 Aprender las técnicas de dispensación de medios de cultivo en cajas Petri
 Elaborar medios de cultivo para microorganismos.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Conocer los medios de cultivo y sus técnicas de sembrado es necesario para
saber la estructura de las bacterias, lo que corresponde a estudiar es para saber,
¿Cuál es su reacción ante un ambiente adecuado para su reproducción?

JUSTIFICACION
Los medios de cultivos son sustancias nutritivas utilizadas en los laboratorios para
hacer crecer sobre ellas diferentes tipos de microorganismos, estos pueden ser
solidos o líquidos según su requerimiento. Usualmente los medios solidos se
preparan a partir de sustancias liquidas las cuales se les agrega un un agente
para solidificar el medio, estas pueden ser agar, gelatinas entre otros. En esta
practica se mostrara las técnicas adecuadas para tener un medio de cultivo en
agar sangre, chocolate, sal y manitol y filo cocos 110.

HIPOTESIS
El crecimiento de microorganismos en medios de cultivo es requerido para la
identificación y caracterización definitiva de los mismos. Se pretender corroborar el
procedimiento para verificar que el medio de cultivo que será analizado sirva para
la reproducción de microorganismos. Siguiendo el procedimiento que se
desarrollara en la práctica confirmaremos si el uso adecuado de los materiales, se
confirmara que las bacterias se van a reproducir de manera controlada.

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MARCO TEORICO
Un medio de cultivo es una técnica de laboratorio que consta de un gel o una
solución que contiene los nutrientes necesarios para permitir, en condiciones
favorables de pH y temperatura, el crecimiento de virus, microorganismos, células,
tejidos vegetales o incluso pequeñas
plantas. Según lo que se quiera hacer
crecer, el medio requerirá unas u otras
condiciones. Generalmente se presentan
desecados en forma de polvo fino o
granular antes de ser preparados; ya
preparados pueden encontrarse en estado
sólido, semisólido o líquido. El objetivo
último del cultivo es variado: antibiograma,
identificación, multiplicación.

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es

observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio
de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado
más de 10.000 medios de cultivo diferentes.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe
reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y
presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad.
Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento
necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

Los virus, por ejemplo, son obligados parásitos intracelulares, por lo que necesitan
un medio que contenga células vivas.

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en

composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de
muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que
se añadirán otros ingredientes.

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Microorganismos: Son los seres más abundantes de la tierra, pueden vivir en
condiciones extremas de pH, temperatura y tensión de oxígeno, colonizando una
amplia diversidad de nichos ecológicos. Entre los requerimientos más importantes
para su desarrollo están el carbono, el
oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono e
hidrogeno. Muchas bacterias sin embargo
necesitan del aporte extra de factores de
crecimiento específicos en forma de suero,
sangre y extracto de levadura entre otros.

Cultivo:

Es el producto del crecimiento de organismos

o grupos de organismos, establecidos con fines experimentales o industriales.

Cultivo puro:

Es la presencia de una sola especie de microorganismos libres de todo

contaminante, a esto que también se le denomina AXENICO.

AGENTES SOLIDIFICANTES

AGAR - AGAR: Se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de
cultivo. En el agar bacteriológico el componente dominante es un polisacárido que
se obtiene de ciertas algas marinas y que presenta la indudable ventaja de que a
excepción de algunos microorganismos marinos, no es utilizado como nutriente. Un
gel de agar al 1-2% se licua alrededor de los 100ºC y se gelifica alrededor de los
40ºC, dependiendo de su grado de pureza.

EXTRACTOS: Su preparación consiste en que ciertos órganos o tejidos animales o

vegetales (p.e. carne, hígado, cerebro, semillas, etc.) son extraídos con agua y calor
y posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Estos
preparados deshidratados son a menudo empleados en la elaboración de los
medios de cultivo. Los más utilizados son el extracto de carne, de levadura y el de
malta.

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PEPTONAS: Son mezclas complejas de compuestos orgánicos, nitrogenados y
sales minerales, que se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas
animales o vegetales (soja caseína carne, etc.). Las peptonas son muy ricas en

pépticos y aminoácidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y

sales minerales.

FLUIDOS CORPORALES: Con frecuencia es necesario añadir a los medios de

cultivo de algunos patógenos sustancias como sangre completa, sangre
desfibrinada, plasma o suero sanguíneo, sobre todo para conseguir el primer
aislamiento a partir del hospedador. La sangre no puede ser esterilizada, y por tanto
debe de ser obtenida en condiciones asépticas directamente de un animal sano, y
adicionada al medio de cultivo después de que este haya sido auto clavado. Los
fluidos corporales no solo aportan factores de crecimiento sino que también aportan
sustancias que neutralizan a inhibidores del crecimiento de algunas bacterias. Un
ejemplo podría ser la catalasa presente en las células sanguíneas destruye el
peróxido de hidrógeno que algunas bacterias que no poseen este enzima acumulan
como producto del metabolismo del oxígeno.

SISTEMAS AMORTIGUADORES: Para mantener el pH dentro del rango óptimo del

crecimiento bacteriano a veces, es necesario añadir algunos componentes al medio
de cultivo. Debido a que la mayoría de las bacterias son neutrófilas, se suelen
emplear sales del tipo de los fosfatos bisodicos ò bipotásicos u otras sustancias
como las peptonas para prevenir la desviación del pH.

INDICADORES DE PH: Con el objeto de poder detectar variaciones en el pH debido

a fermentaciones u otros procesos, se hace necesario a veces añadir indicadores
acido-base que nos lo indiquen.

AGENTES REDUCTORES: Con el objetivo de crear en los medios de cultivo

condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerofilos ò anaerobios
se añaden estos agentes reductores siendo, los más empleados la cisteina y el
tioglicolato entre otros.

AGENTES SELECTIVOS: La adición de determinadas sustancias a un medio de

cultivo puede convertirlo en selectivo. Así, por ejemplo, la adición de cristal violeta,
sales biliares, azida sodica, telurito potasico, antibióticos, etc., a la concentración
adecuada hará que actúen como agentes selectivos frene a determinados
microorganismos.

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TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

MEDIOS GENERALES: Son aquellos que permiten el crecimiento de una gran

variedad de microorganismos.

MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO: Son aquellos que favorecen el crecimiento de u

determinado tipo de microorganismo sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento de
los demás.

MEDIOS SELECTIVOS: Son aquellos que permiten el crecimiento de un tipo de

microorganismos determinado, inhibiendo el desarrollo de los demás.

MEDIOS DIFERENCIALES: Son aquellos en los que se pone de manifiesto

propiedades que un determinado tipo de microorganismos posee.

ESTERILIZACIÓN

Otra de las técnicas empleadas en microbiología es la esterilización. Esterilizar es

eliminar todos los microorganismos presentes en nuestro material. Todos los
aparatos, superficies y materiales utilizados para cultivar deben ser esterilizados.

Para la esterilización se pueden emplear los siguientes métodos y/o agentes:

1. Métodos físicos

 Calor húmedo; autoclave

 b. Calor seco: Estufa y flameado a la llama
 c. Rayos ultravioleta
 d. Filtración

2. Métodos químicos

 Hipoclorito de sodio, cloro comercial al 100%

 Alcohol etílico al 70%
 Cloruro de benzalconio

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MEDIOS DE CULTIVOS (AGARES)
AGAR SANGRE

El agar sangre es una combinación de un agar base (agar nutritivo) con el agregado
de 5 % de sangre ovina, 1también puede usarse
sangre humana, para cultivos en una placa de Agar.
El agar sangre aporta muchos factores de
enriquecimiento. Se usa también para ver la
capacidad hemolítica de los microorganismos
patógenos (que es un factor de Virulencia).
Observando los halos hemolíticos alrededor de las
colonias se determina el tipo de hemólisis que posee:

alfa: halos verdosos (oxidación de la hemoglobina de los glóbulos rojos a

metahemoglobina en el medio)
beta: halos incoloros (hemolisis total)
gamma: inexistencia de halos (sin hemolisis)

FUNDAMENTO:

Dada la excelente base nutritiva, permite el crecimiento de prácticamente todos los

microorganismos que pudieran estar presentes. Si se añade sangre se pueden
determinar las distintas formas de hemólisis que pudieran tener lugar. Si se calienta
se obtiene el Agar Chocolate, también muy empleado. Por la adición de distintos
antibióticos se obtienen medios con caracteres selectivos.

Fórmula (por litro):

Infusión de Corazón (a partir de 375 g) ........................... 10,0 g

Peptona de Carne ........................................................... 10,0 g

Sodio Cloruro .................................................................. 5,0 g

Agar Agar........................................................................ 15,0 g

pH final: 7,3 ±0,2

AGAR CHOCOLATE

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Agar Chocolate (CHOC) es un medio de cultivo enriquecido y no selectivo. Es una
variante del agar sangre. Contiene glóbulos rojos,
que han sido lisados por el suave calentamiento a 56
°C. Este agar se usa para el delicado y exigente
crecimiento de bacterias respiratorias, como por
ejemplo Haemophilus influenzae.

Estas bacterias necesitan factores de crecimiento,

como el NAD y hemina, componentes que podemos
encontrar dentro de los glóbulos rojos; por lo tanto,
un prerrequisito lógico para el crecimiento es la lisis
de los glóbulos rojos. El agar se llama así debido a su parecido con el chocolate,
pero no contiene nada de este.
Debido a que este medio soporta muchos tipos de bacterias, no es muy útil para
coprocultivos.

AGAR SAL Y MANITOL.

Agar Manitol salado o siglas en inglés MSA (Mannitol salt agar) es un medio de
cultivo que se utiliza normalmente en microbiología.
Permite el crecimiento de bacterias Gram-positivas
mientras inhibe el crecimiento de Gram-negativas.
Este medio es importante en el laboratorio clínico
debido a que es capaz de distinguir los
microorganismos patogénicos en un corto periodo
de tiempo. Contiene una alta concentración (~7.5%-
10%) de sal (NaCl), haciéndolo selectivo para
Staphylococcus (y 'Micrococcaceae) debido su alta
concentración de NaCl es inhibitorio para la mayoría
de las bacterias Gram negativas. Además contiene
manitol otro inhibidor de bacterias Gram negativas y un indicador de pH indicador
de fermentación ; rojo de fenol.

Coagulasa-positivo Staphylococcus producen colonias amarillas con zonas

amarillas, mientras que coagulasa-negativo Staphylococcus producen colonias
rojas o ligeramente rosadas sin cambio alguno al medio. Si un organismo es capaz
de fermentar el manitol, un subproducto ácido es creado que hace que el rojo de
fenol cambie a amarillo. Se usa para el aislamiento selectivo de colonias de
Staphylococcus sospechosas de ser patógenas.

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AGAR ESTAFILOCOCOS 110

Es un medio selectivo para el aislamiento y diferenciación presuntiva de

estafilococos, en base a la producción
de pigmentos, la fermentación de manitol y la hidrólisis
de gelatina, a partir de alimentos y otras muestras.
FUNDAMENTO

Staphylococcus aureus es un microorganismo que

puede causar intoxicación alimentaria, y para su
aislamiento, pueden usarse distintos medios sólidos
selectivos: Baird Parker Medio (B02-141-05/06),
Manitol Salado Agar (B02-118-05/06), o Estafilococo Medio 110 (B02-105-05/06).
En el medio de cultivo, el extracto de levadura y la tripteína aportan los nutrientes
para el desarrollo de microorganismos. La gelatina es el sustrato de la enzima
gelatinasa. La lactosa y el manitol son los hidratos de carbono fermentables. El
cloruro de sodio, se encuentra en alta concentración, para inhibir el desarrollo de la
flora acompañante excepto Staphylococcus spp., lográndose así un medio selectivo
para el desarrollo de estos microorganismos. Las ventajas de este medio por sobre
los otros mencionados anteriormente, es que permite, en la misma placa, obtener
pruebas de identificación presuntiva de especie como ser: desarrollo de pigmentos,
fermentación de manitol e hidrólisis de la gelatina.

MATERIALES, EQUIPO Y SUSTANCIA

Probeta
Vasos de precipitado 250ml
Vaso de precipitado 400ml
Matraz Erlenmeyer 250ml
Cajas Petri
Papel aluminio
Tubos de ensaye 13x100
Tubos de ensaye 15x100
Pinzas
mechero
Agitador
Agar base sangre
Agar sal y manitol
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 Agar 110.

PLAN DE INVESTIGACION.

PROCEDIMIENTO
1. Leer cuidadosamente las instrucciones de preparación del medio de cultivo
asignado.

2. Pesar la cantidad exacta del medio deshidratado o las porciones correctas de

cada uno de los ingredientes.

3. Disolver la porción pesada de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Si es

necesario calentar se debe tener cuidado de no sobrecalentar.

4. Ajustar el pH final de cada lote de medio preparado, preferiblemente a

temperatura ambiente (25°C). Para ello se debe tomar una alícuota de 50 mL,
medir el pH y de ser necesario ajustar al pH indicado utilizando HCl 0,1N o NaOH
0,1N. Luego hacer el ajuste de pH al resto del medio de cultivo utilizando la
solución correspondiente pero 1 N.

5. Distribuir el medio de cultivo de acuerdo a las indicaciones señaladas por el

profesor.

6. Identificar el lote de medio de cultivo preparado indicando su nombre,

distribución y fecha de preparación.

7. Esterilizar de inmediato el medio de cultivo siguiendo las instrucciones

señaladas. Si se presenta algún inconveniente que impida su inmediata
esterilización, el medio de cultivo se puede almacenar por un periodo máximo de
12 horas bajo refrigeración.

CONCLUSIÓN
Mediante el desarrollo que se llevara en la práctica se definirá, estudiara y se
aplicara los procedimientos que se deben realizar para la elaboración de un medio

12
de cultivo, para poder cultivar y saber si puede a ver o no un crecimiento en la
muestra utilizada y con ellos saber si nuestra hipótesis se tome como adecuada.

BIBLIOGRAFÍA
“Biología de los microorganismos”
T. Madigan Michael, M. Martinko John, Jack Parker: Pearson Prentice Hall:
2004
“Diagnostico microbiológico”
Forbes Betty A., Sahm Daniel F., Weissfeld S.: Ed. Panamericana: 2004
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm
https://es.wikipedia.org/wiki/Medio_de_cultivo
https://es.wikibooks.org/wiki/Microbiolog%C3%ADa/Medios_de_cultivo
http://microbiologia3bequipo5.blogspot.mx/2014/09/tipos-y-funciones-de-
los-medios-de.html

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