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Université de Versailles - Saint-

Quentin-en-Yvelines
UFR des Sciences
Département de Biologie
Master 1 Biologie et Santé

Analyse de facteurs
physiologiques
et immuns chez
Leuciscus cephalus,
associations
potentielles et
parasitisme
Stage effectué du 25 mars au 11 mai 2007
Soutenu le 20 juin 2007 à l’UVSQ

Rédigé et soutenu par


Timothée Poisot
Travaux encadrés par
Andrea Simkova
Serge Morand

Masaryk University of Brno


Faculty of Natural Sciences
Institute of Botany and Zoology
Department of Parasitology
REMERCIEMENTS

Avant de commencer ce travail, il me faut remercier l’ensemble des personnes qui l’ont rendu
possible.

Andrea Simkova, pour son encadrement et ses conseils à chaque étape de mon travail.

Serge Morand, pour son implication dans la rédaction et le perfectionnement de ce mémoire.

Pavel Hyrsl, pour l’aide et le travail fournis pendant les mesures de l’immunocompétence.

Milan Gelnar, pour avoir autorisé mon séjour dans les murs de son laboratoire.

L’ensemble du Monogenean Research Group, pour leur accueil, et leur aide pendant les
dissections.

Fabienne Misguich, pour son enseignement.

Céline Arnal, pour m’avoir « transmis le virus ».

Mariella Duarte.

L’ensemble de tous ceux qui ont relu ce mémoire, par partie ou dans son intégralité, et qui ont
aidé à son amélioration.

Les éventuelles erreurs qui resteraient ne sauraient, bien évidemment, être attribuées qu’à
l’auteur.

Lieu de stage :

Monogenean Research Group

Department of Parasitology

Institute of Botanic and Zoology

Masaryk University, Faculty of Natural Sciences

Kotlá!ská 2, 611 37 Brno, République Tchèque

Physiologie, immunocompétence, et parasitisme chez Leuciscus cephalus Page 1 de 45


SOMMAIRE

Introduction............................................................................................................................... 4
Introduction générale............................................................................................................... 4
Le problème de l’allocation d’énergie ................................................................................. 4
Variations de la physiologie ................................................................................................ 4
Relations entre l’immunocompétence et la physiologie ........................................................ 5
Immunité innée anti-parasitaire chez les poissons ............................................................... 6
Présentation du travail ............................................................................................................. 8
Matériels et méthodes ............................................................................................................. 10
Manipulation des poissons..................................................................................................... 10
Capture des poissons......................................................................................................... 10
Prise de sang et de mucus.................................................................................................. 10
Paramètres physiologiques................................................................................................ 10
Dissection.......................................................................................................................... 11
Conservation des parasites ................................................................................................ 11
Identification des parasites................................................................................................ 12
Hématologie.......................................................................................................................... 12
Réalisation des blood smears............................................................................................. 12
Comptage des leucocytes sur lame..................................................................................... 12
Comptage des érythrocytes et des leucocytes sur hémocytomètre....................................... 12
Hématocrite et leucocrite .................................................................................................. 13
Immunocompétence .............................................................................................................. 13
Lysozyme........................................................................................................................... 13
Oxydative burst ................................................................................................................. 13
Résultats .................................................................................................................................. 15
Parasitisme............................................................................................................................ 15
Paramètres épidémiologiques............................................................................................ 15
Distribution des parasites les plus abondants .................................................................... 15
Influence du sexe sur les variables étudiées ........................................................................... 15
Corrélations entre les variables.............................................................................................. 17
Variables retenues............................................................................................................. 17
Physiologie........................................................................................................................ 17
Immunocompétence ........................................................................................................... 17
Physiologie et immunocompétence .................................................................................... 18
Physiologie et parasitisme ................................................................................................. 18

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Immunocompétence et parasitisme .................................................................................... 18
Discussion ................................................................................................................................ 19
Figures ..................................................................................................................................... 25
Tables et équations.................................................................................................................. 34
Références................................................................................................................................ 40

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INTRODUCTION

INTRODUCTION GENERALE
LE PROBLEME DE L’ALLOCATION D’ENERGIE
Tout organisme dispose, à un instant donné, d’une quantité finie d’énergie qu’il doit allouer entre
différents impératifs: survie, reproduction, maintenance. Par définition, les parasites réduisent la
valeur adaptative (« fitness ») de leur hôte, en exploitant des ressources énergétiques qui auraient
pu être attribuées à ces fonctions dans d’autres circonstances (Moller et Erritzoe 2002). Le coût
énergétique important de la réponse immunitaire induite par la présence de parasites (Sheldon et
Verhulst 1996; Moeller et al. 2003) est lui aussi susceptible de modifier la physiologie de l’hôte,
notamment en modifiant l’allocation à la reproduction (Folstad et Karter 1992).

La compréhension des relations entre l’immunocompétence et la reproduction, prenant en compte


la présence de parasites, apparaît aujourd’hui comme l’un des enjeux majeurs de l’immunologie
écologique. Intuitivement, il est intéressant de caractériser les différences qui existent entre les
mâles et les femelles, dans la mesure où la quantité d’énergie allouée à l’effort reproductif est
susceptible de varier selon le sexe.

VARIATIONS DE LA PHYSIOLOGIE
L’allocation d’énergie à l’une des grandes fonctions aux dépens des autres peut être approchée
par l’étude de la variation de certains indicateurs. De nombreux travaux se sont concentrés sur les
variations de la physiologie des poissons selon la saison et la maturité sexuelle.

Pour évaluer l’état physiologique général des poissons, 4 indicateurs sont fréquemment utilisés.
K (condition factor) permet de mesurer l’état de santé général du poisson, en supposant qu’à
taille égale, un individu de masse supérieure est en meilleure santé (Bolger et Connolly 1989).
GS, rapport entre le poids des gonades et le poids du corps, permet d’évaluer l’investissement
dans la reproduction (Durif et al. 2000; Lamkova et al. 2007). SS, rapport entre le poids de la rate
et le poids du corps, est un indicateur de l’investissement dans l’immunocompétence (Fox et al.
1997; Faller et al. 2003; Jenkins et al. 2004). HS, rapport entre le poids du foie et le poids du
corps, donne une indication de la quantité d’énergie disponible à l’individu (Chellappa et al.
1995; Lefebvre et al. 2004).

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La présence de parasites entraîne un coût pour l’individu infecté. De fait, une diminution de K a
été observée chez des saumons (Salmo salar) infectés par le copépode Lepeophtheirus salmonis
(Grimnes et Jakobsen 1996).

L’importance de l’état de maturité sexuelle dans la variation des mesures hématologiques est
grande. Pickering (1986) a ainsi mis en évidence une augmentation du nombre d’érythrocytes
circulants, pendant l’hiver, chez les mâles Salmo trutta sexuellement matures. Par la suite, des
résultats identiques ont été obtenus chez Salmo salar.

Chez Salmon salar toujours, une diminution de l’hématocrite suite à une infection par
Lepeophtheirus salmonis a été observée (Grimnes et Jakobsen 1996). Un résultat identique a été
obtenu chez Onchorynchus mykiss (Fast et al. 2002).

Certains modèles ont permis de mettre en évidence des variations des paramètres hématologiques
en réponse à une infection par un parasite : Salmo trutta répond à l’infection par Lepeophtheirus
salmonis par une augmentation de la proportion d’érythrocytes, et une diminution de la
proportion de lymphocytes (Ruane et al. 2000). Au cours de ces mêmes travaux, une activation
du lysozyme et de la voie alterne du complément a pu être observée.

RELATIONS ENTRE L’IMMUNOCOMPETENCE ET LA PHYSIOLOGIE


L’immunocompétence, définie comme la capacité d’un organisme à déclencher puis réguler une
réponse immune (Kuby 1999), est dépendante de la physiologie de l’individu. Les relations
existantes entre les systèmes neuroendocrinien et immunitaire chez les poissons sont globalement
bien documentées (Harris et Bird 2000; Watts et al. 2001).

Chez Salmo trutta, l’infection par le monogène Gyrodactylus derjavini provoque la synthèse de
cortisol (Stoltze et Buchmann 2001), connu pour être un médiateur de l’immunosuppression
entraînée par un stress (Roth 1985; Kaattari et Tripp 1987; Pickering et Pottinger 1989;
Houghton et Matthews 1990). Des résultats identiques ont été obtenus chez la truite arc-en-ciel
Onchorynchus mykiss suite à l’infection par Lepeophtheirus salmonis (Fast et al. 2002).

Différentes études portant sur les effets de la température de l’eau sur l’immunocompétence des
poissons ont permis de mettre en évidence que les basses températures, et plus généralement les
variations brutales de température, étaient associées, chez les téléostéens, à une
immunosuppression (Bly et Clem 1991).

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Le maintien des caractéristiques sexuelles secondaires, notamment les ornements chez les mâles,
demande un investissement énergétique important, souvent associé à une diminution de
l’immunocompétence (Hamilton et Zuk 1982; Folstad et Karter 1992). De fait, on peut supposer
que des mâles sexuellement matures soient plus fortement parasités que le reste de la population
(Ottova et al. 2005; Vainikka et al. 2005).

D’autre part, les androgènes sont connus pour avoir un effet immunosuppresseur (Grossman
1985; Slater et al. 1995a). Des récepteurs à la testostérone ont été découverts sur les lymphocytes
de la truite (Slater et al. 1995b), pouvant expliquer au moins en partie ce phénomène chez les
poissons. D’autre part, la testostérone est capable de tuer les leucocytes de saumon (Slater et
Schreck 1997). Cette mort cellulaire est très probablement de type apoptotique (Raberg et al.
1998).

IMMUNITE INNEE ANTI-PARASITAIRE CHEZ LES POISSONS


Le parasitisme est un mode de vie extrêmement répandu, puisqu’il pourrait concerner la majorité
des espèces existantes (Windsor 1998; Combes 2002). Les parasites, en tant qu’éléments du non-
soi, sont susceptibles de déclencher une réponse immunitaire, et leur capacité à infecter l’hôte est
intuitivement dépendante de son immunocompétence. A titre d’exemple, de précédents travaux
ont montré que la susceptibilité à l’infection par l’ectoparasite Gyrodactylus derjavini était
modifiée chez des truites arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) ayant subi une immunosuppression
par traitement au dexamethasone (Lindenstrøm et Buchmann 1998). Pour comprendre les
relations entre physiologie et immunité, il apparaît nécessaire de tenir compte de la présence de
parasites.

Les poissons sont des organismes hétérothermes poïkilothermes, c’est-à-dire dont la température
corporelle est régulée par des facteurs abiotiques (dans le cas des poissons, la température de
l’eau). Chez les poïkilothermes, la réponse immunitaire adaptative est plus longue à déclencher,
et extrêmement coûteuse en énergie. De fait, la réponse innée est souvent privilégiée.

On peut hypothétiquement considérer que l’activation de l’immunité innée pour lutter contre des
parasites, c’est-à-dire l’utilisation de l’alternative la plus favorable énergétiquement, est
l’aboutissement d’un mécanisme de coévolution, et révèle une histoire évolutive commune entre
l’espèce hôte et les différentes espèces de sa parasitofaune (Jones 2001).

Sur des échelles de temps plus longues que celle de ce travail, il est intéressant d’observer les
influences de la saison sur l’immunocompétence et l’effort reproductif ; ceci dans la mesure ou la

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quantité d’énergie disponible dépend, du fait de la poïkilothermie, de la température de l’eau. Ce
travail a déjà été réalisé au laboratoire (Lamkova et al. 2007), mais n’inclut pas de données
collectées à la période de l’année à laquelle s’est déroulée la présente étude.

De précédents travaux ont montré que les trois mécanismes de défense contre les parasites (et,
chez les poissons, plus particulièrement les ectoparasites) étaient l’activation de la voie alterne du
complément, l’activation du lysozyme, et l’oxydative burst, c’est-à-dire la libération de
métabolites réactifs de l’oxygène par les phagocytes (Buchmann 1999; Jones 2001; Watts et al.
2001; Buchmann et Lindenstrøm 2002).

Comme le faisait remarquer Jones (2001), « à l’exception de quelques modèles bien décrits (…),
les programmes de recherche se concentrant sur l’immunité innée anti-parasitaire chez les
poissons manquent ». De fait, la majorité des informations disponibles aujourd’hui proviennent
d’études réalisées sur un nombre réduit de modèles, souvent ceux qui présentent un intérêt
économique (comme c’est le cas pour un grand nombre de salmonidés).

D’autre part, il existe très peu de travaux menés dans le milieu naturel des poissons, ou ils sont
exposés à un spectre très large de parasites.

Le complément semble être un mécanisme de défense particulièrement actif contre les


ectoparasites (Buchmann 1998; Harris et al. 1998; Buchmann 1999; Jones 2001; Buchmann et
Lindenstrøm 2002), notamment via l’activation de la voie alterne. Bien qu’ayant été décrit pour
la première fois pour le système Salmo salar/Gyrodactylus salaris, ce modèle a été par la suite
vérifié chez la truite (Rubio-Godoy et al. 2004). Des expériences d’inactivation du complément,
au cours desquelles la mortalité des parasites à significativement diminué, ont permis de
confirmer ce rôle (Buchmann 1998).

Le lysozyme semble être activé par la présence d’ectoparasites, bien que n’ayant pas montré
d’effet anti-parasitaire (c’est-à-dire n’entraînant pas de mortalité des parasites) au cours des
précédents travaux sur ce sujet (Buchmann et Uldal 1997). Cependant, ces résultats ont été
obtenus pour le parasite Gyrodactylus derjavini, et les études sur d’autres espèces de monogènes
manquent toujours (Buchmann 1999).

L’activité des macrophages semble être diminuée chez les individus lourdement infectés par des
ectoparasites (Mustafa et al. 2000; Fast et al. 2002; Kortet et al. 2003).

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PRESENTATION DU TRAVAIL
Sur la base de ces considérations, l’objectif de ce travail est d’étudier comment différents facteurs
physiologiques et immuns interagissent, et quelle est l’influence de la présence de parasites sur
ces interactions, en milieu naturel. Notre modèle pour cette étude est le poisson Leucisus
cephalus (Linnaeus 1756), de la famille des cyprinidae. Cette espèce parmi les plus parasitées de
la famille des Cyprinidae en Europe Centrale (Moravec 1994, 2001). Les dernières analyses
(2004-2005) ont notamment permis d’observer 28 espèces de parasites métazoaires chez
Leuciscus cephalus (Lamkova 2005; Lamkova et al. sous presse).

Leuciscus cephalus est un poisson largement distribué en Europe, en Asie, dans l’Atlantique et la
Méditerranée. Il présente l’avantage de vivre en forte densité de populations, et d’avoir une
bonne tolérance écologique (Froese et Pauly 2001), ce qui permet de minimiser l’impact des
prélèvements nécessaires pour ce travail sur les populations naturelles.

Les parasites auxquels nous nous sommes intéressés sont, à l’exception du genre Myxobolus, des
parasites métazoaires. Les ectoparasites observés appartiennent à la sous-classe Monogenea, au
sous-phylum Crustacea, au phylum Mollusca (stades larval « glochidium » des genres Anodonta
et Unio). Les endoparasites observés appartiennent à la classe Trematoda (Digenea), à la classe
Cestoda, au phylum Acanthocephala, au phylum Nematoda.

Pour les analyses de corrélation, afin de compenser le faible effectif de notre échantillon, nous
avons retenu le nombre total d’endoparasites et d’ectoparasites, le nombre de Myxobolus, ainsi
que la richesse (nombre d’espèces parasites) et la diversité (calculée à partir de l’index de
Brillouin (Pielou 1969, 1975)). Cet échantillonnage permet de compenser le fait que certaines
espèces étaient très peu représentées dans la population totale d’hôtes.

Les indicateurs de la physiologie que nous avons retenu sont K, GS, HS, et SS. Le fait de travailler
avec les rapports du poids des organes sur le poids du corps permet de normaliser ces indicateurs
par rapport à l’état de condition du poisson. Concernant la rate, l’utilisation du poids ou du
volume non corrigé comme indicateur de l’immunocompétence à fait l’objet de critiques (Smith
et Hunt 2004). Des remarques supplémentaires sur l’utilisation de SS comme indicateur de
l’immunocompétence sont fournies dans la discussion.

L’analyse des relations entre ces indicateurs nous permet d’évaluer dans quelle mesure les
individus étudiés allouent l’énergie entre les différentes fonctions (ie reproduction, condition

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somatique, et immunocompétence), c’est-à-dire de déterminer s’il existe ou non un compromis
(trade-off) entre ces fonctions.

Les mesures hématologiques n’ont pas été utilisées per se dans les analyses de corrélations, mais
ont permis de normaliser l’activité des macrophages. Les données obtenues sur la composition du
sang ont été conservées, dans la mesure où elles sont les premières pour cette période de l’année
chez Leuciscus cephalus. D’autre part, le leucocyte differential count peut être utilisé comme un
indicateur de l’immunocompétence.

Les indicateurs de l’immunocompétence des individus que nous avons retenu sont la
concentration en lysozyme du mucus, et l’intensité maximale de l’oxydative burst, mécanisme de
réponse cellulaire particulièrement impliqué dans l’immunité innée antiparasitaire chez les
poissons (Cassier et al. 1998).

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M ATERIELS ET METHODES

MANIPULATION DES POISSONS


CAPTURE DES POISSONS
18 individus de l’espèce Leuciscus cephalus (Cyprinidae) ont été capturés par pêche électrique
(electrofishing) dans leur milieu naturel (rivière Oslava, sud de la Moravie, affluent de la rivière
Morava) le 3 avril 2007 (température de l’eau : 6,1°C) ; 21 nouveaux individus de la même
espèce ont été capturés au même endroit le 14 avril 2007 (température de l’eau : 10,1°C).
Immédiatement après sa capture, chaque poisson a été marqué de manière caractéristique
(entaille à la nageoire caudale) pour identification, puis une prise de sang a été effectuée comme
décrit dans la section suivante. Les poissons ont ensuite été placés par groupe de trois dans des
sacs oxygénés, contenant de l’eau de la rivière, pour leur transport au laboratoire. Ils ont été
stockés dans des bassins oxygénés en attendant la dissection.

PRISE DE SANG ET DE MUCUS


Une prise de sang est effectuée immédiatement après la capture, dans la vena caudalis, selon les
indications de Stolen et al (1993), avec une seringue héparinisée. Un volume d’environ 0,5ml est
prélevé à chaque prise, mélangé avec 50U d’héparine par ml de sang, et conservé dans un tube
eppendorf placé dans la glace. Deux capillaires à hématocrite sont remplis aux " puis une des
extrémités est scellée par chauffage. Le poisson est ensuite désinfecté à l’alcool et placé dans un
réservoir de transport. Les poissons sont ramenés au laboratoire, puis sacrifiés et disséqués dans
les 48 heures, comme décrit ci-après. Au moment de la dissection, les écailles du poisson sont
grattées à l’aide d’un scalpel, pour prélever le mucus (#20µl). Le mucus ainsi prélevé est placé
dans un tube eppendorf au réfrigérateur. Les poissons morts au laboratoire (3 avril : 5 individus)
n’ont pas été retenus pour les expérimentations.

PARAMETRES PHYSIOLOGIQUES
Le poisson est pesé (g), mesuré de la pointe de la nageoire caudale à la bouche (longueur totale,
cm). La longueur standard est mesurée (cm), de la base de la nageoire caudale à la bouche. Les
organes internes sont retirés comme mentionné dans la section suivante, puis le poids sans ces
organes est relevé (g). Suite à la dissection, les indices splénosomatiques (masse de la rate ÷
masse du corps, multiplié par 100), hépatosomatiques (masse du foie ÷ masse du corps, multiplié
par 100), gonadosomatiques (masse des gonades ÷ masse du corps, multiplié par 100), ainsi que

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le facteur de condition (condition factor) (masse totale ÷ (longueur totale)3) ont été calculés
(Bolger et Connolly 1989).

DISSECTION
Le poisson est sacrifié par une incision au niveau de l’aorte dorsale, puis ouvert le long du ventre
pour rendre accessibles les organes internes. Les chairs d’un des côtés sont écartées, et les
organes internes sont retirés, en prenant soin de les conserver intacts. Le sexe est déterminé par
examen des gonades. La rate, le foie, et les gonades sont pesés (balance de précision, 10-4 g). La
rate est placée dans 500µl de solution RNAlater (pour des analyses ultérieures du CMH –
fabricant : Sigma), puis conservée quelques jours au réfrigérateur avant congélation (-80°C). Les
autres organes sont placés séparément dans des coupelles contenant de l’eau de capture (L’eau
distillée est hypotonique pour les parasites et entraîne leur lyse. Les types de parasites
susceptibles d’être retrouvés sont portés en italique à la suite du nom des organes). Les arcs des
branchies sont séparés (Monogenea : Gyrodactylus, Dactylogyrus, Paradiplozoon ; Crustacea :
Ergasilus sieboldi ; Hirudinea ; Protozoa : Myxobolus), de même que les nageoires (Monogenea :
Gyrodactylus ; Crustacea : Argulus foliaceus), et les yeux. Après ouverture du tube digestif, les
organes internes sont écrasés entre deux plaques de verre (Trématoda : métacercaires dans
l’ensemble des organes internes, les yeux, les muscles, formes adultes dans l’intestin ; Cestoda :
stades larvaires et adultes ; Nématoda : principalement dans l’intestin, la vessie natatoire et
l’hépatopancréas, stades larvaires et adultes ; Acanthocéphala : dans l’intestin).

CONSERVATION DES PARASITES


Les monogènes observés sont séparés de leur milieu, puis placés entre lame et lamelle, puis
écrasés par aspiration de l’eau ayant servi au montage. Une solution de GAP (Malmberg 1957)
est ajoutée sous la lamelle par capillarité. Les lamelles sont maintenues en place par quatre points
de résine fondue. Une partie des endoparasites (Cestoda, Nématoda, Acanthocephala, Trématoda)
sont conservés dans une solution de formaldéhyde 4%, puis colorés une heure dans une solution
d’IAC (Georgiev et al. 1986) avant d’être lavés selon la séquence suivante : rinçage dans une
solution d’alcool acide, lavage à l’eau, 5 minutes dans l’alcool 70%, 10 minutes dans l’alcool
96%, 5 minutes dans du carboxylol, 5 minutes dans du xylène, puis conservation entre lame et
lamelle dans du canadian balsam (Georgiev et al. 1986). La préparation a été solidifiée à l’étuve
(37°C). Les endoparasites non fixés de cette manière sont conservés dans une solution GAP
comme décrit précédemment pour les monogènes. Les parasites du genre Myxobolus n’ont pas
été collectés.

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IDENTIFICATION DES PARASITES
Les parasites collectés lors de la dissection sont examinés au microscope optique. Les parasites
du genre Dactylogyrus sont identifiés selon la forme des crochets centraux, des crochets
marginaux, de la barre connective ventrale et dorsale, de l’hapteur (organe d’attachement), et des
organes sexuels (Figure 2). Les parasites du genre Gyrodactylus sont identifiés selon la
morphologie des crochets centraux, des crochets marginaux et des barres connectives (Figure 3),
mesurés en microscopie optique (grossissement 100x à 200x, huile à immersion, microscope
Olympus BX51, caméra DP70, logiciel Micro Image Analysis). Les parasites dont l’espèce n’a
pas été identifiée (organes manquants, parasite lysé, ou tout autre facteur entraînant un doute sur
l’espèce exacte) sont comptabilisés dans le total du genre auquel ils appartiennent. La
détermination a été effectuée à partir des clefs connues (Ergens et Lom 1970; Gusev 1985;
Scholz 1989; Moravec 1994).

HEMATOLOGIE
REALISATION DES BLOOD SMEARS
Une goutte de sang issue de chaque prélèvement est déposée sur une lame, puis étalée pour
former une traînée (Stolen et al. 1993). La lame est laissée à sécher 10 minutes à l’air libre, puis
colorée par différentes solutions selon la séquence suivante (Svobodová et al. 1991) : May-
Grünwald (10 gouttes par lame, 3 minutes), eau distillée et PBS (ratio 1 pour 1, pH = 7,1, 10
gouttes par lame, 1 minute), Giemsa-Romanovsky et eau distillée (ratio 2 pour 40, 10 gouttes par
lame, 25 à 30 minutes). Les lames sont déposées pour sécher en position inclinée (à l’air libre),
puis le dessous est rincé à l’alcool pur. Deux lames sont préparées pour chaque poisson étudié.

COMPTAGE DES LEUCOCYTES SUR LAME


Chaque lame est observée au microscope optique, grossissement 100x avec huile à immersion,
sans lamelle. Un total de 100 leucocytes est compté sur chaque lame. Les lames sont ensuite
conservées à l’air libre. La différenciation des cellules est effectuée d’après les critères
morphologiques connus pour chaque type de cellule (lymphocytes, monocytes, blastocystes,
différents stages de développement des neutrophiles, ie myélocytes, métamyélocytes, bands, et
segments) (Lehmann et al. 1994).

COMPTAGE DES ERYTHROCYTES ET DES LEUCOCYTES SUR HEMOCYTOMETRE


Pour chaque poisson, 25µl de sang et 4975µl de solution de Natt-Herik (Svobodová et al. 1986;
Lusková 1997) sont mélangés puis homogénéisés dans une flasque. Le mélange est stocké dix

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minutes au réfrigérateur (4°C), puis soumis à une légère agitation manuelle. Un volume de 20µl
de solution est déposé sur un hémocytomètre (Bürker), puis compté au microscope selon la
méthode recommandée par Stolen et al. (1993). Le comptage des érythrocytes est réalisé sur 20
cellules rectangulaires, celui des leucocytes sur 50 cellules carrées de l’hémocytomètre. Le
comptage a été réalisé dès le retour au laboratoire (environ 4 heures après la capture).

HEMATOCRITE ET LEUCOCRITE
Comme décrit dans la partie « prise de sang et de mucus », deux capillaires à hématocrite sont
remplis pour chaque poisson capturé. Les capillaires sont ensuite centrifugés 3 minutes à 12000g
(Svobodová et al. 1986). L’hématocrite est relevé avec un lecteur circulaire immédiatement après
centrifugation. Le leucocrite a été déterminé en calculant le rapport entre la taille du culot formé
par les leucocytes (microscope optique grossissement 4x, logiciel AnalySIS) et la taille totale du
culot (mesurée au pied à coulisse, précision ±0,1mm).

IMMUNOCOMPETENCE
Les analyses d’immunocompétence ont été réalisées dans le laboratoire du Dr. Pavel Hyr$l, au
Department of Animal Physiology and Immunology.

LYSOZYME
Un gel contenant de l’agarose (diluée dans du tampon à pH = 7) et des bactéries Micrococcus
luteus est coulé sur une plaque de verre. Des trous d’environ 5 µl de contenance sont percés après
polymérisation, à intervalles réguliers. 5µl de chaque échantillon sont déposés dans les puits. Le
gel est calibré avec une série de quatre échantillons de lysozyme issu de blanc d’œuf de poulet
(commercialisé par Sigma). L’ensemble est incubé 24 heures, en étuve humide, à température
ambiante. La quantité de lysozyme (mg/ml) est calculée par rapport au diamètre des plages de
lyse (moins le diamètre des puits) formées pendant l’incubation (détermination par rapport aux
valeurs obtenues pour les 4 échantillons de calibrage).

OXYDATIVE BURST
Comme décrit par Nikoskelainen et al (2004), un volume de 250µl de solution composée de 25µl
de luminol (Molecular Probes, Eugene, Oregon USA, Leiden, The Netherlands), 25µl de
zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) opsonisé ou non (par incubation avec du sérum de
plusieurs individus de l’espèce étudiée), 200µl de sang (vortexé quelques instants), et de HBSS
qsp est déposé sur un puits. La plaque est analysée par un luminomètre (MLX Microtiter Plate

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Luminometer, Dynex Technologies,USA, 40 mesures, temps total % 1 heure). Les valeurs retenues
pour chaque échantillon sont la valeur maximale atteinte par le pic de fluorescence, et l’aire sous
la courbe enregistrée. La préparation ainsi que les mesures sont réalisées à une température
proche de la température corporelle des poissons, tout en permettant des conditions favorables
pour les mesures (circa 20-25°C).

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RESULTATS

PARASITISME
PARAMETRES EPIDEMIOLOGIQUES
Afin de quantifier l’infection par les différentes espèces de parasites dans notre population de 34
individus, 3 paramètres épidémiologiques courants en parasitologie ont été utilisés (Margolis et
al. 1982; Bush et al. 1997) : la prévalence (Équation 1), l’abondance (Équation 2), et l’intensité
de l’infection (Équation 3). Ces valeurs ont été calculées pour les mâles, les femelles, et pour
l’ensemble de la population.

Les valeurs des paramètres épidémiologiques pour les parasites les plus fréquemment identifiés
sont portées Table 1. Le nombre de parasites, dans le paragraphe suivant est donné de la manière
suivante : minimum ; moyenne ± écart-type ; maximum. Le choix de cette présentation est
motivé par le fait que la distribution des parasites est fortement agrégée.

DISTRIBUTION DES PARASITES LES PLUS ABONDANTS


Les 34 individus de la population étudiée sont infectés par des parasites du genre Dactylogyrus
(6 ; 41,7 ± 29,52 ; 163). Les espèces les plus abondantes sont D. folkmanovae (1 ; 16,4 ± 12,25 ;
62), D. vistulae (5 ; 16,4 ± 12,22 ; 58). Les autres espèces sont nettement moins représentées.

L’ensemble des femelles et 93% des mâles (soit 14 individus) sont infectés par des parasites du
genre Gyrodactylus (0 ; 11,32 ± 12,22 ; 65). Les espèces les plus abondantes sont G. gasterostei
(0 ; 1,88 ± 2,61 ; 14), G. gracilihamatus (0 ; 2,20 ± 3,10 ; 17), G. prostae (0 ; 2,44 ± 3,50 ; 17), et
G. leucisci (0 ; 1,58 ± 2,28 ; 11).

INFLUENCE DU SEXE SUR LES VARIABLES ETUDIEES


Les différences de répartition des variables selon le sexe des individus (19 femelles, 15 mâles)
sont déterminées grâce au test U de Mann-Whitney (Mann et Whitney 1947), et estimées
significatives pour p<0,05.

Concernant la physiologie des poissons (Table 2), les mâles et femelles étudiés diffèrent par leur
longueur totale (p=0,027) et leur longueur standard (p=0,019), les femelles étant plus grandes
(longueur totale : 25,34 cm en moyenne) que les mâles (longueur totale : 22,60 cm en moyenne).
Le facteur de condition, K, ne varie pas en fonction du sexe.

Physiologie, immunocompétence, et parasitisme chez Leuciscus cephalus Page 15 de 45


Le poids sans organes internes des poissons varie selon le sexe (p=0,046), de même que le poids
du foie (p=0,046). Les femelles sont plus lourdes que les mâles (139,32 g en moyenne, contre
97,81 g). Le poids total ne varie pas de manière statistiquement significative selon le sexe.

Les index GS et SS varient avec le sexe (resp. p=0,003 et p=0,004). Les mâles ont des valeurs
supérieures aux femelles pour ces deux facteurs (9,33 contre 6,50 pour GS, 1,05.10-1 contre
7,33.10-2 pour SS).

La composition du sang, en termes de proportion des différents types cellulaires, ne dépend pas
du sexe de l’individu, à l’exception du pourcentage de blastocystes, plus élevé chez les mâles
(p=0,035, 1,07% pour les mâles contre 0,21% pour les femelles, données pour 19 femelles et 13
mâles). Les valeurs des différents paramètres hématologiques mesurés sont données Table 3. Une
représentation de la proportion des différents types cellulaires est donnée Figure 4.

Aucune différence significative n’a été mise en évidence entre les indicateurs de
l’immunocompétence (concentration en lysozyme du mucus, intégrale et pic de l’oxydative burst)
selon le sexe des individus (données pour 18 femelles, 14 mâles). Les données sont fournies à la
table Table 4.

Concernant l’infection par les différentes espèces de parasites étudiés, le test de Mann-Whitney a
mis en évidence une différence significative (p=0,048) dans le nombre d’individus de l’espèce
Gyrodactylus vimbi selon le sexe des hôtes. Cependant, le nombre de G vimbi relevé est faible
(12 hôtes infectés, 21 parasites au total), et il n’est pas impossible que la manipulation des
poissons ait entraîné la perte de parasites. D’autre part, la méthode de transport qui consistait à
grouper par 3 les poissons a pu entraîner le transfert horizontal de certains parasites. Nous avons
choisi de considérer qu’il n’existe pas de différence significative dans l’infection de nos poissons
par G vimbi, dans la mesure où celle obtenue ici peut être un effet du hasard.

Aucune différence significative concernant l’infection des hôtes n’a été mise en évidence pour
l’ensemble des espèces de parasites étudiées. La richesse et la diversité en parasites (Table 5) ne
varient pas selon le sexe de l’hôte (p>0,05).

Physiologie, immunocompétence, et parasitisme chez Leuciscus cephalus Page 16 de 45


CORRELATIONS ENTRE LES VARIABLES
VARIABLES RETENUES
La corrélation entre les différentes variables retenues pour l’analyse est mesurée par le test de
Spearman (Spearman 1987). Les corrélations observées sont acceptées comme significatives pour
une p-value inférieure à 0,05. Le coefficient de corrélation r est indiqué après chaque association.

Pour pallier le faible effectif de notre population, nous avons isolé certaines variables pour
l’analyse. Les indicateurs de la physiologie retenus sont K, GS, HS, SS. Les mesures de
l’immunocompétence sont la concentration (mg/ml) en lysozyme du mucus, et le pic (RLU/min)
de l’oxydative burst (le pic de la courbe et l’aire sous la courbe sont fortement corrélés, données
non fournies).

La richesse et la diversité en parasites sont analysées, de même que le nombre total


d’ectoparasites métazoaires, le nombre total d’endoparasites métazoaires, et le nombre de
Myxobolus (protozoaires).

PHYSIOLOGIE
Sur l’ensemble de la population (mâles et femelles), une corrélation positive a été mise en
évidence entre le facteur de condition et les index GS et HS (resp. r=0,50 et r=0,37). Cette
corrélation a été retrouvée pour le groupe des femelles (resp. r=0,72 et r=0,49), mais pas pour le
groupe des mâles.

Chez les femelles, une corrélation positive existe entre les index GS et HS (r=0,66, Figure 5). Une
corrélation négative a été mise en évidence entre les index GS et SS (r=-0,52, Figure 6).

Nous n’avons pas mis en évidence d’association entre les différents indicateurs de l’état
physiologique chez les mâles.

IMMUNOCOMPETENCE
Nos analyses n’ont pas montré de corrélation entre les deux indicateurs de l’immunocompétence
étudiés, la concentration en lysozyme du mucus et le pic de l’oxydative burst, que ce soit pour les
mâles (r=0,02), les femelles (r=0,16), ou l’ensemble de la population (r=0,09).

Physiologie, immunocompétence, et parasitisme chez Leuciscus cephalus Page 17 de 45


PHYSIOLOGIE ET IMMUNOCOMPETENCE
Pour l’ensemble de la population, une corrélation négative significative a été mise en évidence
entre K et la concentration en lysozyme du mucus (r=-0,43). De même, une corrélation négative
existe entre K et le pic de l’oxydative burst (r=-0,38).

Une corrélation négative a été retrouvée entre l’index GS et la concentration en lysozyme du


mucus, sur l’ensemble de la population (r=-0,38), et sur l’ensemble des mâles (r=-0,59, Figure 7).
Une telle corrélation n’a pas été mise en évidence chez les femelles de notre échantillon.

PHYSIOLOGIE ET PARASITISME
Chez les mâles, une corrélation positive existe entre le facteur de condition K et le nombre total
de parasites protozoaires Myxobolus (r=0,51, Figure 8). Aucune autre corrélation significative
entre les indicateurs de la physiologie et le nombre de parasites n’a pu être mise en évidence dans
notre échantillon.

IMMUNOCOMPETENCE ET PARASITISME
Chez les mâles, une corrélation positive a été mise en évidence entre le nombre total
d’endoparasites et l’intensité de l’oxydative burst (r=0,58, Figure 9). Aucune autre corrélation
significative entre les indicateurs de l’immunocompétence et le nombre de parasites n’a pu être
mise en évidence dans notre échantillon.

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DISCUSSION

En accord avec nos hypothèses émises en introduction de ce travail, des différences sont
observées entre la physiologie des mâles et des femelles, traduisant une répartition différente de
l’énergie entre les principales fonctions qu’un organisme doit assurer.

Notre première observation est que les index GS et SS des mâles sont plus importants que ceux
des femelles. Proportionnellement à sa taille, un individu Leuciscus cephalus mâle investit plus
d’énergie dans la reproduction et l’immunocompétence qu’une femelle. Ce résultat est explicable
par le fait que les mâles doivent, en plus de la production de gamètes, investir leur énergie dans la
présentation des caractères sexuels secondaires. On considère que les femelles, si leur
investissement total dans la reproduction est moins important que celui des mâles, investissent
plus dans la production de gamètes (Schoen et Stewart 1986; Folstad et Karter 1992; Skarstein et
al. 2001).

D’autre part, il faut considérer que l’investissement dans la reproduction, et l’immunosupression


qui lui est liée, dépend de la saison. L’expression des caractères sexuels secondaires chez les
mâles est placée sous le contrôle d’hormones stéroïdes possédant un effet immunosuppresseur.
En hiver, l’activité des hormones stéroïdes est minime, et ne peut donc pas expliquer une
immunosuppression. Des travaux précédents ont montré que du printemps à l’automne, il
n’existe pas de différence entre les index GS et SS chez les mâles et les femelles (Lamkova et al.
sous presse).

Chez les mâles, la présence des caractères sexuels secondaires, notamment les ornements, est
régulée par le système neuroendocrinien, et est un facteur important dans le choix du partenaire
par la femelle (Balthazart 1983; Wingfield et Moore 1987; Omland 1996; Hillgarth et Wingfield
1997). Augmenter sa valeur reproductive requiert donc, pour un mâle, un effort massif dans la
compétition sexuelle.

Effort reproductif et parasitisme sont liés. Il a été remarqué que les parasites rendent les mâles
plus ternes, en leur imposant d’allouer l’énergie vers la réponse immune (Clayton 1991). Chez
les guppies (Poecilia reticulata), il a été observé que l’augmentation de la charge parasitaire
(après infection par des Gyrodactylus) conduisait à une diminution du nombre de parades
effectuées par les mâles en 24 heures (Kennedy et al. 1987). De même, les femelles sont
réceptives à la modification de la présentation des caractères sexuels secondaires, et évitent ainsi

Physiologie, immunocompétence, et parasitisme chez Leuciscus cephalus Page 19 de 45


la reproduction avec des mâles parasités (Milinski et Bakker 1990). Une corrélation positive
entre la charge parasitaire et le développement d’ornements chez les mâles a été mise en évidence
chez les oiseaux (Read 1988; Zuk 1991).

Si l’on considère que la quantité d’énergie disponible à chaque instant donné est limitée,
l’investissement dans l’effort reproductif devrait être corrélé à une diminution de l’investissement
dans l’immunocompétence (Sheldon et Verhulst 1996).

Cette relation n’a pas été trouvée entre l’index GS (indicateur de l’effort reproductif) et l’index SS
(indicateur de l’immunocompétence), ni dans l’ensemble de notre population, ni dans le groupe
des mâles. Cependant, nous avons pu mettre en évidence une relation négative entre l’index GS et
la concentration en lysozyme du mucus chez les mâles, cohérente par rapport aux relations
prévisibles entre immunocompétence et effort reproductif.

Chez les femelles, en revanche, une corrélation négative existe entre GS et SS. Cette corrélation
indique que plus une femelle investit son énergie dans la reproduction, plus elle diminue la part
d’énergie allouée à l’immunocompétence. Si les relations entre immunocompétence et
investissement dans la reproduction sont largement documentées chez les mâles, les travaux
réalisés sur des femelles manquent encore.

Chez les femelles, les index HS et GS sont corrélés de manière positive. Ce résultat est en accord
avec l’idée selon laquelle disposer de réserves énergétiques plus importantes (ici évaluées par le
rapport de la masse du foie sur la masse du corps, le foie étant choisi comme indicateur en raison
de son rôle fondamental dans le métabolisme énergétique) permet un investissement plus
conséquent dans la reproduction.

Chez les mâles, bien qu’elle ne soit pas significative (à p=0,05), il existe une corrélation négative
entre HS et GS, qui pourrait indiquer que l’investissement énergétique dans la reproduction est
différent selon le sexe. Cependant, l’analyse statistique ne permet pas de confirmer cette
hypothèse.

Sur l’ensemble de la population, il existe une corrélation négative entre K et la concentration en


lysozyme du mucus. Le lysozyme est une des défenses les plus utilisées par les poissons contre
les parasites (Ingram 1980). Nous observons que plus la condition d’un poisson est bonne, moins
ses défenses biochimiques sont actives. À notre connaissance, les explications de ce phénomène
restent à apporter.

Physiologie, immunocompétence, et parasitisme chez Leuciscus cephalus Page 20 de 45


Une corrélation positive a été mise en évidence entre K et le nombre de Myxobolus. Cette
corrélation peut être en partie expliqué par le fait que le lysozyme et K soient corrélés
négativement, ce qui rend les hôtes avec une meilleure condition plus faciles à infecter pour les
parasites. On peut voir aussi dans ces relations le fait qu’un individu en meilleure condition peut
supporter plus de parasites, et investit moins dans ses défenses immunitaires.

L’un des résultats les plus significatifs de ce travail est l’absence de corrélation entre les
indicateurs de la réponse immunitaire et l’infection par des ectoparasites. Alors que les défenses
de la peau et du mucus, donc le lysozyme, que nous avons étudié, sont les premières rencontrées
par les ectoparasites, cette absence de corrélation peut sembler étonnante.

Différentes études ont montré, pour des modèles différents du nôtre, une augmentation de la
concentration en lysozyme du mucus suite à l’infection par des ectoparasites monogènes,
principalement du genre Gyrodactylus (Buchmann et Uldal 1997; Buchmann 1999). La survie
des parasites n’avait pas été affectée par l’activation du lysozyme pendant ces études. Il faut
noter que l’intensité de l’infection par Gyrodactylus dans ces études était faible, en tout cas
difficilement comparable aux intensités d’infection mesurées dans notre travail.

Au regard de ces observations, il semble légitime de supposer que si le lysozyme participe à la


réponse immunitaire innée chez Leuciscus cephalus, et notamment contre les bactéries, il n’est
pas spécifiquement impliqué dans la réponse anti-parasitaire.

La reproduction des monogènes, et particulièrement celle du genre Gyrodactylus, est dépendante


de la température de l’eau (Gelnar 1987; Jansen et Bakke 1991; Andersen et Buchmann 1998). À
partir du moment où la température leur est favorable, leur population connaît un accroissement
très rapide. Il est envisageable qu’un délai soit nécessaire, pouvant aller jusqu’à quelques
semaines, entre l’apparition des parasites et le déclenchement de la réponse immune. D’autre
part, les Gyrodactylus se reproduisent par polyembryonie, mécanisme dans lequel les individus
adultes portent des embryons incomplets, et les relâchent pour compléter leur cycle. Ces
embryons sont eux-mêmes porteurs d’autres ébauches d’embryons, ce qui entraîne une
augmentation rapide de la population.

Il existe cependant une autre hypothèse pouvant expliquer cette absence de corrélation. Si l’on
considère que l’hôte et les espèces de sa parasitofaune ont un passé évolutif commun, il peut être
envisageable que le système hôte-parasites soit arrivé à un équilibre, qui serait caractérisé par une
faible intensité de la réponse immunitaire contre les ectoparasites.

Physiologie, immunocompétence, et parasitisme chez Leuciscus cephalus Page 21 de 45


On peut diviser les parasites en spécialistes et généralistes, selon qu’ils infectent une ou plusieurs
espèces d’hôtes (Combes 2002). Les spécialistes étant dépendants de l’hôte pour leur survie, on
s’attend à ce que la réponse immunitaire dirigée contre eux soit de faible ampleur. Sur l’ensemble
des monogènes que nous avons observés, pour le genre Dactylogyrus, 5 espèces sont des
spécialistes, et 5 autres des généralistes. Pour le genre Gyrodactylus, 7 espèces sont des
spécialistes, 5 espèces sont des généralistes. Les études se concentrant sur les facteurs
immunologiques impliqués dans la spécialisation manquent encore.

Un moyen de rendre compte des observations précédentes, au cours desquelles le lysozyme a été
activé suite à l’infection par des ectoparasites, sans toutefois augmenter leur mortalité, est qu’une
sélection des ectoparasites de Leuciscus cephalus résistants au lysozyme a pu être mise en place.
Le fait que le lysozyme soit un enzyme hydrolytique de type PRR, c’est-à-dire une protéine de
reconnaissance de certains motifs associés à des pathogènes (concept défini par Janeway 1989),
rend possible une résistance, si le parasite ne présente pas les motifs cibles. Si une résistance de
ce type est déjà largement, et depuis plusieurs années, documentée chez des bactéries (Brumfitt et
al. 1958; Hayashi et al. 1973; par exemple Bera et al. 2005), nous n’avons pas trouvé de travaux
de cette nature réalisés pour des parasites.

D’autre part, en raison du faible effectif de notre population, nous avons regroupé l’ensemble des
ectoparasites. Sur un échantillon de taille plus importante, il aurait été possible de chercher des
corrélations entre l’activité du lysozyme et le nombre de parasites d’un genre, voire d’une espèce
donnée. De même, il serait nécessaire de reproduire ces expériences à différents moments de
l’année.

Si on émet l’hypothèse qu’un passé évolutif commun a permis la sélection des ectoparasites
résistants au lysozyme, des informations supplémentaires sur le rôle du lysozyme dans la défense
anti-parasitaire pourraient être apportées par l’étude de son activation suite à l’infection, en
conditions expérimentales, de Leuciscus cephalus par un parasite auquel il n’est pas,
habituellement, exposé.

Nous avons observé, chez les mâles, une corrélation positive entre le nombre total
d’endoparasites et l’intensité maximale de l’oxydative burst. Ce résultat indique que l’activité des
phagocytes est proportionnelle à l’intensité de l’infection, ce qui suggère un rôle important de
l’oxydative burst dans la réponse dirigée contre les endoparasites. Un résultat similaire avait été
obtenu suite à l’infection par des monogènes (Blazer 1991; Mustafa et al. 2000).

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Les indicateurs utilisés pour mesurer l’immunocompétence des individus (concentration en
lysozyme du mucus et intensité de l’oxydative burst) n’ont pas montré, entre eux, de corrélation.
Ce résultat peut s’expliquer par le fait que ces deux défenses ne s’appliquent pas aux mêmes
parties du corps l’hôte, et conséquemment ne sont pas activées en réponse aux mêmes agressions.

Le lysozyme est contenu principalement dans le mucus et sur la peau du poisson (Leppi 1968;
Ingram 1980; Austin et Mc Intosh 1988; Buchmann et Bresciani 1998; Buchmann 1999; Ebran et
al. 1999; Buchmann et Lindenstrøm 2002; Fagan et al. 2003), ce qui fait de lui la première
défense rencontrée par un parasite. Il serait donc majoritairement activé par la présence
d’ectoparasites (ce que, comme il est discuté précédemment, nos observations ne confirment
pas).

L’oxydative burst est provoqué par les phagocytes, donc plus vraisemblablement dans les organes
internes. La voie de l’oxydative burst consiste en une intensification du métabolisme de
l’oxygène et des mécanismes oxydatifs, dans le but de produire des radicaux instables et réactifs,
qui déstabilisent les structures des membranes cytoplasmiques, mitochondriales, dégradent les
protéines et les acides nucléiques. Le déclenchement de ce mécanisme demande une activation
préalable des phagocytes.

Cette voie représenterait le mécanisme de défense cellulaire le plus impliqué dans la lutte contre
les parasites (Cassier et al. 1998). La corrélation obtenue, pour les mâles, entre son intensité et le
nombre d’endoparasites est cohérente avec cette donnée. L’oxydative burst ne représente qu’une
des trois voies de destruction par les macrophages, avec la voie du monoxyde d’azote et la voie
du tryptophane. Cependant, elle est la plus abondamment utilisée.

Plus généralement, bien que la mesure de l’index SS nous renseigne sur un investissement dans
l’immunocompétence, il faut prendre en compte que l’immunocompétence, parce que c’est un
concept global (la capacité de déclencher une réponse immunitaire (Kuby 1999)), s’appuie sur
des mécanismes très variés, qui ne bénéficient pas tous de cet investissement de manière
identique. À partir de ces informations, il apparaît pertinent de se poser la question des limites de
l’utilisation de SS en tant qu’indicateur de l’immunocompétence selon le type de parasites
étudiés, et des indicateurs à lui substituer le cas échéant.

Une autre question soulevée par ces observations est celle de la relation entre pathogénicité et
intensité de la réponse immunitaire. Si effectivement ces deux facteurs sont liés, comme on peut
le supposer, les preuves pour l’établir manquent toujours. Une fois encore, le fait que le parasite

Physiologie, immunocompétence, et parasitisme chez Leuciscus cephalus Page 23 de 45


soit spécialiste ou généraliste est un facteur important. Intuitivement, il est plus avantageux pour
un spécialiste de voir sa pathogénicité diminuer, pour ne pas compromettre son substrat. Si les
causes écologiques conduisant à la spécialisation d’une espèce sur un hôte sont documentées,
notamment pour les monogènes de poissons (Sasal et al. 1999; Simková et al. 2001; Simková et
al. 2004; Simková et al. 2006), les études sur les facteurs immunologiques impliqués restent
encore à mener.

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FIGURES

Figure 1 : Leuciscus cephalus (Cyprinidae). La taille totale (cm) est mesurée de la pointe de la
nageoire caudale à la bouche, la taille standard (cm) est mesurée de la base de la nageoire caudale
à la bouche. Crédit photographie : Andrea Hause, reproduit avec autorisation.

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Figure 2 : Morphologie générale du genre Dactylogyrus. Les caractères utilisés pour la
détermination de l’espèce sont la forme de l’hapteur, des organes d’attachement, et des organes
reproductifs.

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Figure 3 : Morphologie des crochets des parasites du genre Gyrodactylus et caractéristiques
mesurées. 1, longueur totale du crochet marginal. 2, longueur de la faucille du crochet marginal.
3, longueur totale de l’ancre. 4, longueur de la racine de l’ancre. 5, longueur de la pointe de
l’ancre. 6, largeur de la barre ventrale. 7, longueur de la barre ventrale. 8, longueur des
membrane processes.

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Figure 4 : Composition du sang (proportion des différents types cellulaires) pour les mâles et les
femelles. Les différents types de neutrophiles sont portés dans l’histogramme latéral. La
proportion de basophiles varie selon le sexe de manière statistiquement significative (test de
Mann-Whitney, p<0,05).

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3,2

3,0

2,8

2,6

2,4

2,2
Hs

2,0

1,8

1,6

1,4

1,2

1,0
0 2 4 6 8 10 12

Gs

Figure 5 : Corrélation entre les index GS et HS chez les femelles Leuciscus cephalus.
L’investissement dans la reproduction est plus conséquent quand la réserve d’énergie est plus
importante.

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0,13

0,12

0,11

0,10

0,09
Ss

0,08

0,07

0,06

0,05

0,04
0 2 4 6 8 10 12

Gs

Figure 6 : Corrélation entre les index GS et SS chez les femelles Leuciscus cephalus. La relation
négative peut indiquer l’existence d’une diminution de l’investissement énergétique dans
l’immunocompétence, au profit de la reproduction.

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28

26

24

22

20

18

16

14
Lysozyme

12

10

4
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Gs

Figure 7 : Corrélation entre la concentration en lysozyme du mucus et l’index GS chez les mâles.
La relation négative entre les deux facteurs pourrait indiquer l’existence d’un trade-off entre les
fonctions immunes et reproductives.

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180

160

140

120

100

80
Myxobolus

60

40

20

-20
0,80 0,85 0,90 0,95 1,00 1,05 1,10 1,15 1,20 1,25

Figure 8 : Corrélation entre le nombre de Myxobolus et le condition factor chez les mâles
Leuciscus cephalus. L’augmentation de la taille tend à augmenter la surface potentiellement
accessible aux parasites.

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30

25

20

15

10
Endoparasites

-5
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Oxydative burst

Figure 9 : Corrélation entre l’intensité maximale (RLU/minute) de l’oxydative burst, corrigée en


fonction du nombre de leucocytes, et le nombre total d’endoparasites, chez les mâles Leuciscus
cephalus. La relation positive est relevante d’une activation de la réponse immunitaire innée
induite par les endoparasites.

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TABLES ET EQUATIONS

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Prévalence Abondance moyenne Intensité d’infection moyenne
Espèce
M F T M F T M F T

D. folkmanovae 1 1 1 13,93 18,37 16,41 13,93 18,37 16,41

D. vistulae 1 1 1 14,93 17,58 16,41 14,93 17,58 16,41

Dactylogyrus sp. 1 1 1 37,60 44,89 41,68 37,60 44,89 41,68

Myxobolus 0,93 0,84 0,88 42,27 37,53 39,62 45,29 44,56 44,90

G. leucisci 0,60 0,68 0,65 0,80 2,21 1,59 1,33 3,23 2,45

G. prostae 0,60 0,68 0,65 2,67 2,26 2,44 4,44 3,31 3,77

G. gracilihamatus 0,60 0,95 0,79 1,73 2,58 2,21 2,89 2,72 2,78

G. gasterostei 0,73 0,58 0,65 1,67 2,05 1,88 2,27 3,55 2,91

Gyrodactylus sp. 0,93 1 0,97 8,60 13,47 11,32 9,21 13,47 11,67

Anodonta sp. 0,87 0,68 0,76 2,53 2,00 2,24 2,92 2,92 2,92

P. torulosus 0,60 0,47 0,53 3,93 2,95 3,38 6,56 6,22 6,39

Nematode 0,60 0,47 0,53 2,27 1,68 1,94 3,78 3,56 3,67

Acanthocephala 0,20 0,42 0,32 0,67 1,42 1,09 3,33 3,38 3,36

Ergasilus sieboldi 0,13 0,21 0,18 0,13 0,21 0,18 1 1 1

Table 1: Valeurs épidémiologiques pour les parasites les plus fréquemment rencontrés, pour les
mâles (M), femelles (F), et l’ensemble de la population (T).

Physiologie, immunocompétence, et parasitisme chez Leuciscus cephalus Page 35 de 45


Longueur (cm) Poids (g) Poids des organes (g) Facteurs

Totale* Standard* Total Sans Gonades Foie* Rate K GS* HS SS*


organes*

Moyenne mâles 22,60 18,75 125,07 97,81 12,33 2,00 0,12 2,85E-05 9,33 1,52 1,05E-01

Ecart type mâles 3,09 2,59 59,76 45,49 8,05 1,33 0,05 3,75E-05 2,35 0,51 4,07E-02

Moyenne 25,34 21,82 175,38 139,32 12,55 3,24 0,13 1,28E-05 6,50 1,76 7,33E-02
femelles

Ecart type 3,67 3,74 87,00 67,95 9,02 2,26 0,06 1,48E-05 2,52 0,49 2,72E-02
femelles

Table 2 : Moyenne et écart type des critères morphologiques et physiologiques chez les 34
individus de l’espèce Leuciscus cephalus étudiés. Le symbole * indique une différence (p<0,05)
entre les sexes, selon le test U de Mann-Whitney (n mâles = 15, n femelles = 19, ! = 5%).

Physiologie, immunocompétence, et parasitisme chez Leuciscus cephalus Page 36 de 45


Neutrophiles Titres Hématocrite (%)
Blastocystes* Lymphocytes Monocytes
Myélocytes Métamyélocytes Bands Segments Erythrocytes Leucocytes Erythrocytes Leucocytes

Moyenne 1,07 77,13 1,33 3,20 1,53 0,53 1,73 104,20 51,00 27,87 2,83
mâles

Ecart 1,58 32,00 1,29 3,21 1,55 0,83 1,67 43,80 19,96 14,43 1,52
type
mâles

Moyenne 0,21 91,47 1,53 2,21 2,16 0,79 1,63 96,37 50,68 26,74 3,26
femelles

Ecart 0,54 7,71 1,95 2,10 2,27 1,40 2,06 44,65 20,88 6,96 1,06
type
femelles

Table 3 : Données concernant l’hématologie des individus étudiés. Les données de la colonne
« titres » ont été recueillies par comptage sur un hémocytomètre. Le symbole * indique une
différence (p < 0,05) entre les sexes, selon le test U de Mann-Whitney (n mâles = 15, n femelles =
19, ! = 5%).

Physiologie, immunocompétence, et parasitisme chez Leuciscus cephalus Page 37 de 45


Lysozyme (mg/ml) Oxydative burst (RLU/min) par leucocyte

Pic Aire sous la courbe

Moyenne 14,95 24,34 771,78


mâles

Ecart type 7,32 23,48 761,72


mâles

Moyenne 15,04 28,00 923,77


femelles

Ecart type 8,80 24,35 805,63


femelles

Table 4 : Données concernant l’immunocompétence des 34 individus étudiés.

Richesse Diversité

Moyenne mâles 11,27 1,65

Ecart type mâles 2,66 0,36

Moyenne femelles 12,32 1,68

Ecart type femelles 2,54 0,38

Table 5 : Richesse et diversité en parasites des individus étudiés. La richesse est le nombre
d’espèces observées par individu, la diversité est estimée par l’index de Brillouin (Équation 4).

Physiologie, immunocompétence, et parasitisme chez Leuciscus cephalus Page 38 de 45


N inf
prévalence = "100
N

Équation 1: Prévalence (exprimée en pourcentage). Ninf représente le nombre d’hôtes


! espèce de parasites donnée, N est le nombre total d’individus
(individus infectés) d’une
examinés.

nombre de parasites
abondance =
nombre d' hôtes potentiels

Équation 2: Abondance, définie comme le nombre de parasites d’un espèce sur le nombre
!
total des hôtes potentiels.

nombre de parasites
intensité =
nombre d' hôtes

Équation 3: Intensité de l’infection, définie comme le nombre de parasites d’une espèce


! d’hôtes effectivement infectés par cette espèce.
donnée sur le nombre

ln N!"# ln n i!
HB =
N

Équation 4: Index de diversité de Brillouin (Pielou 1969, 1975). N représente le nombre total
!
d’individus parasites, ni représente le nombre d’individus parasites de chaque espèce.

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