Espectrofotometria infrarroja.

3.5 FUNDAMENTO DE ESPECTROFOTOMETRIA INFRAROJA.

La espectrofotometría infrarroja es un método de medida de la absorción de la radiación en un rango de

longitudes de onda, cuando ésta pasa a través de una capa delgada de sustancia,es un ensayo de
identificación por excelencia siendo capaz de distinguir sustancias con diferencias estructurales.

Se basa en la medición de la absorción de la radiación infrarroja debida a la interacción con los enlaces
que forman los grupos funcionales presentes en las moléculas orgánicas. El espectro se presenta en
unidades de número de onda (cm-1)o longitud de onda (µm) en la abscisa y unidades de absorbancia
(análisis cuantitativo) en la ordenada.

De las tres regiones de infrarrojo (cercano, medio y lejano), la región comprendida entre 4000 a 400 cm-
1es la más empleada para fines de identificación. Sin embargo, en algunos casos es utilizado con fines
cuantitativos. El espectro de infrarrojo (IR) es único para cualquier compuesto químico con excepción de
los isómeros ópticos que tienen espectros idénticos.

Cuando los ensayos por absorción infrarroja se aplican sobre una muestra resultante de la extracción a
partir de una formulación, puede que no sea siempre posible una estricta concordancia con el espectro
de referencia. Sin embargo, el espectro del material extraído y el espectro de referencia deberían
alcanzar una similitud cercana. El índice de concordancia deberá ser establecido en cada caso particular,
con su correspondiente verificación.

La radiación electromagnética es una forma de energía que se propaga como ondas y puede ser
subdividida en regiones de longitudes de onda características. también es considerada como un flujo de
partículas denominadas fotones (quanto). Cada fotón contiene determinada energía cuya magnitud es
proporcional a la frecuencia e inversamente proporcional a la longitud de onda. La longitud de onda (λ)
es generalmente especificada en nanómetros, nm (10-9 metros) y en algunos casos en micrómetros, µm
(10-6 metros). En caso del infrarrojo la radiación electromagnética puede ser también descrita en
términos de número de onda y expresada en cm-1. Los rangos de longitud de onda de energía
electromagnética de interés para el infrarrojo se describen en Tabla 1.

3.6 DESCRIPCION DEL EQUIPO : ESPECTROFOTOMETRO IR

El espectrofotómetro para registrar espectros en la región infrarroja están constituidos por un sistema
óptico capaz de proveer luz monocromática en la región de 4.000 a 600 cm-1 (2,5 a 15 µm), o en algunos
casos por debajo de 200 cm-1 (50 µm), y por elementos que permiten medir el cociente entre las
intensidades de luz transmitida e incidente.

Calibración del aparato - Los aparatos empleados para registrar los espectros infrarrojos deben cumplir
con los siguientes ensayos de calibración:

Resolución - Registrar el espectro de una película de poliestireno de 0,05 mm de espesor. La distancia

entre el máximo de absorción a 2.851 cm-1 (3,51 µm) y el mínimo a 2.870 cm-1 (3,48 µm) debe ser
equivalente a no menos de 18 % de transmitancia y la distancia entre el máximo a 1.583 cm-1 (6,32 µm)
y el mínimo a 1.589 cm-1 (6,29 µm) debe ser equivalente a no menos de 12% de transmitancia.

Verificación de la escala de longitud de onda - La escala de longitud de onda puede verificarse

empleando una película de poliestireno que presente máximos de absorción a los siguientes números de
onda (en cm-1):

3.027,1 (±0,3) 1.583,1 (±0,3)

2.924,0 (±2,0) 1.181,4 (±0,3)

2.850,7 (±0,3) 1.154,3 (±0,3)

1.9 44,0 (±1,0) 1.069, 1 (±0,3)

1.871,0 (±0,3) 1.028,0 (±0,3)

1.801,6 (±0,3) 906,7 (±0,3)

1.601,4 (±0,3) 698,9 (±0,5)

los valores entre paréntesis indican las tolerancias permitidas.

Preparación de la muestra - Las muestras se preparan de acuerdo con su naturaleza, de la siguiente

manera:

En película fina - Colocar 1 ó 2 gotas entre dos placas de cloruro de sodio u otro material transparente a
la radiación Infrarroja y presionar suavemente las placas para formar una fina película. También puede
emplearse una celda del mismo material y de paso óptico apropiado.

En solución - Preparar una solución en el solvente y a la concentración especificadas en la monografía

correspondiente y transferir a una celda de material transparente a la radiación infrarroja. La absorción
debido al solvente puede compensarse colocando el solvente puro en la celda de referencia; sin
embargo, aquellas regiones del espectro en las que el solvente presenta una fuerte absorción no deben
tenerse en cuenta. La concentración apropiada del soluto varía según la sustancia, pero en general se
emplean concentraciones entre 1 y 10% para un paso óptico de 0,5 a 0,1 mm.
En fase sólida - Amenos que se especifique de otro modo en la monografía correspondiente, triturar en
un mortero aproximadamente 1 a 2 mg de la sustancia a analizar con 200 a 300 mg de bromuro de
potasio o cloruro de potasio seco y finamente pulverizado. Estas cantidades son en general apropiadas
para un disco de 13 mm de diámetro y un espectro de intensidad apropiada. Moler la mezcla con
cuidado, esparcir uniformemente en un molde apropiado y comprimir a una presión de
aproximadamente 10.000 kg/cm2, aplicando vacío. El disco obtenido se coloca en el espectrofotómetro
con un soporte apropiado. Varios factores, tales como una molienda inadecuada, humedad e impurezas
en el haluro pueden dar origen a discos no aptos para el análisis. El disco debe desecharse si no es
uniforme cuando se lo examina visualmente o si la transmitancia a 2.000 cm-1 en ausencia de una banda
de absorción específica, es menor de 75% sin emplear compensación en el haz de referencia.

En suspensión - Triturar 5 a 10 mg de la sustancia a analizar con 2 gotas de vaselina líquida apropiada

hasta obtener una mezcla cremosa homogénea. Colocar una porción de la mezcla así obtenida entre dos
placas de cloruro de sodio u otro material transparente a la radiación infrarroja y presionar suavemente
las placas para formar una película fina.

Gases - Emplear una celda para gases con un paso óptico de aproximadamente 100 mm. Evacuarla y
llenarla a la presión deseada mediante un robinete o válvula de aguja empleando una línea de
transferencia apropiada para gases entre la celda y el recipiente de la sustancia a analizar. Si fuera
necesario, ajustar la presión con un gas transparente a la radiación infrarroja, como por ej. nitrógeno o
argón. Para evitar interferencias de absorción debido al vapor de agua, dióxido de carbono u otros gases
atomosféricos, colocar en el haz de referencia una celda idéntica evacuada o llenada con un gas
transparente a la radiación infrarroja.

Reflectancia múltiple - Cuando se especifica este método en una monografía, preparar la muestra por
uno de los siguientes métodos:

Soluciones - Disolver la muestra en el solvente apropiado bajo las condiciones especificadas en la

monografía correspondiente. Evaporar la solución sobre una placa de bromuro de tallo-ioduro de talio o
sobre otra placa apropiada.

Sólidos - Colocar la muestra sobre una placa de bromuro de talio-ioduro de talio o sobre otra placa
apropiada, de manera de lograr un contacto uniforme.

Identificación por medio de espectros de referencia - Preparar la muestra en condiciones similares a las
indicadas para la obtención del espectro de referencia y registrar el espectro de

la sustancia a analizar. Sobre éste, registrar las bandas de poliestireno a 2.851 cm-1 (3,51 µm), 1.601 cm-
1 (6,25 µm) y 1.028 cm-1 (9,73 µm). Comparar los espectros y los máximos del poliestireno indicados en
Verificación de la escala de longitud de onda. Las zonas correspondientes a la impresión digital (entre
1.400 a 600 cm-1) de ambas sustancias deben ser en un todo concordantes.
Identificación por medio de sustancias de referencia - Preparar la muestra según se especifica en la
monografía correspondiente teniendo en cuenta la metodología indicada en Preparación de la muestra.
Tratar la Sustancia de referencia de la misma manera. Registrar los espectros entre 4.000 y 600 cm-1
(2,5 a 15 µm) bajo las mismas condiciones. Los máximos de absorción, correspondientes a la zona de
impresión digital (entre 1.400 a 600 cm-1), en el espectro obtenido con la muestra deben corresponder
en posición e intensidad relativa a los del obtenido con la Sustancia de referencia.

3.7 IDENTIFICACIÓN DE PRINCIPIOS ACTIVOS POR ESPECTROFOTOMETRIA IR

Como se ha comentado en el capítulo anterior, la utilización de la espectroscopia NIR en la industria

farmacéutica ha ido en aumento en los últimos tiempos debido, básicamente, al número de ventajas
que ésta presenta frente a las metodologías convencionales.

Cabe distinguir dos grandes tipos de aplicación: análisis cualitativo (identificación de un compuesto o de
un preparado) y análisis cuantitativo (normalmente determinación del principio activo, aunque se ha
aplicado a la cuantificación de muy distintos parámetros). Desde un punto de vista normativo su
aplicación al análisis cualitativo está perfectamente consolidada, habiendo sido recogido en distintas
farmacopeas, entre ellas la European Pharmacopoeia. Por el contrario, el desarrollo normativo de los
métodos cuantitativos está menos avanzado, a pesar del gran número de ejemplos descritos en la
bibliografía.La identificación de una sustancia por observación visual de su espectro NIR es,
generalmente, difícil, ya que éste está constituido por bandas muy anchas que normalmente están
superpuestas, por lo que es necesario utilizar los denominados métodos quimiométricos de
reconocimiento de pautas, cuyo objetivo es caracterizar la muestra a partir de un adecuado tratamiento
matemático-estadístico del espectro. En esencia, el procedimiento a seguir para realizar la identificación
con estos métodos es, en primer lugar, obtener un conjunto de señales analíticas de un producto y crear
lo que se denomina una biblioteca y, en segundo lugar, registrar la señal de la muestra problema y
compararla con las de la biblioteca, usando criterios matemáticos que permitan expresar de una forma
paramétrica la similitud entre los espectros comparados. Si el nivel de similitud supera un cierto límite,
se considera que los espectros son idénticos y, por tanto, se identifica la muestra como el producto
incluido en la biblioteca. Una forma matemática muy utilizada en espectroscopia NIR para expresar el
concepto de similitud es el coeficiente de correlación4,5, que presenta como ventajas el ser
independiente del tamaño de la biblioteca y no ser sensible a las variaciones en la concentración.La
industria farmacéutica debe garantizar la correcta dosificación, manufactura y estabilidad del producto,
debiendo, para ello, controlar exhaustivamente las materias primas y cada una de las etapas que
componen la fabricación del producto, determinando la humedad, densidad, viscosidad, tamaño de
partícula, etc. con el objetivo de detectar y poder corregir desviaciones en el proceso de fabricación.
Este control puede realizarse determinando el valor numérico de todos los parámetros mediante
métodos cuantitativos de análisis o comparando el espectro NIR de la muestra con un conjunto de
espectros de muestras que cumplan las especificaciones establecidas y que representen todas las
fuentes de variabilidad natural de la fabricación. Esta opción constituye lo que se conoce como
cualificación y permite comprobar si la muestra está dentro de la variabilidad normal o hay desviaciones
en la fabricación que obligan a realizar un análisis completo de la muestra. Los métodos más utilizados
son distancia máxima en el espacio de las longitudes de onda6, distancia de Mahalanobis7,8 y varianza
residual en el espacio de los componentes principalesDentro del control de calidad en la industria
farmacéutica, uno de los aspectos más importantes es el control del enantiomerismo que, desde el
desastre de la talidomina en la década de los sesenta, está totalmente legislado10-12. Los
estereoisómeros son compuestos de igual fórmula molecular (isómeros) que difieren entre sí sólo en la
forma en que los átomos están orientados en el espacio. Los enantiómeros son los estereoisómeros de
un compuesto quiral (que no puede superponerse a su imagen especular). La mezcla de enantiomeros a
la misma concentración se conoce con el nombre de racémico. Los enantiómeros de un compuesto
presentan las mismas propiedades físico-químicas en un entorno aquiral, pero sin embargo se
comportan de forma distinta en un entorno quiral. Los organismos vivos son inherentemente quirales.
Las enzimas, receptores celulares y todas las especies bioquímicas que intervienen en el metabolismo
presentan una estereoquímica definida y, por tanto, los enantiómeros de una sustancia presentarán un
comportamiento distinto en el organismo humano. Así pues, el enantiómero con la actividad biológica
buscada se denomina eutómero, mientras que el otro enantiómero, que en principio no la posee, se
denomina distómero. Sin embargo, se pueden distinguir varias situaciones:-El distómero es tóxico.-Es
distómero es inactivo o menos activo.

-Los dos enantiómeros poseen una actividad biológica distinta.-La combinación de ambos enantiómeros
es beneficiosa, ya sea porque poseen efectos terapéuticos complementarios o bien porque el distómero
reduce los efectos secundarios del eutómero.Por tanto, cuando uno de los componentes de un
preparado farmacéutico pueda presentar diferentes formas enantioméricas, es muy importante realizar
un estudio que permita detectar la presencia de la forma enantiomérica no deseada. En este contexto la
espectroscopia NIR se puede presentar como una buena opción,En este capítulo se desarrolla un
método cualitativo capaz de identificar un preparado farmacéutico y cada uno de sus componentes
puros. Además se estudia la selectividad de dicho método frente a pequeñas desviaciones en el nivel de
concentración de alguno de los componentes del fármaco y frente a la presencia de la forma racémica
del principio activo.

3.8 INTERPRETACION DE RESULTADOS

Espectrofotometría de infrarrojo de los reactivos

1: peroximonosulfato de potasio

Picos esperados
S=0 de 1200 a 1400
SO4 1100
OH 3500-3200
2: ACETATO DE COBALTO

Picos esperados
CH3 1450 Y 1375
C=O 1750-1730
CO 1300-1000
CH3 3000-2850
3: ACETILACETONATO DE COBALTO II

C=O 1740-1720
CH3 3000-2850

4:BENZOILACETONATO DE COBALTO

1740-1720
CH3 3000-2850
Cetona aromática 1725-1650
5: ACIDO OXALICO

Acido carboxílico 1750-1705

ESPECTOFOTOMETRIA DE IR. DE LAS SALES DE COBALTO Y PMS

Los tiempos van de arriba hacia abajo con una diferencia de 5 minutos entre cada muestra

1: ACETATO DE COBALTO Y PMS

se hicieron las mezclas de las sales de cobalto con PMS para ver que con el tiempo se veía alguna
reacción o algún cambio en el pico pero en todos los casos se siguió viendo lo mismo por lo tanto la
reacción no está degradando la materia orgánica del contra-ion , dando evidencia de que ambas
especies permanecen sin cambios en la naturaleza de sus estructuras al coordinarse

3.9 DOCUMENTACIÓN Y EMISION DE DICTAMEN EN BASE A LOS RESULTADOS OBTENIDOS.

La interpretación de los espectros de infrarrojo requiere de un sofisticado análisis de datos

el cual sigue evolucionando gracias al desarrollo de métodos de análisis multivariables. Uno
de los métodos más utilizados para el análisis de datos es conocido como análisis de
componentes principales (PCA); este análisis requiere de un proceso matemático que
transforma a un número de variables correlacionadas en un grupo más pequeño de
variables no-correlacionadas llamadas componentes principales. Cada uno de estos
componentes principales corresponde a la mayor variabilidad posible registrada en el grupo
de datos analizados, siendo la primera componente la que contiene la mayor variabilidad y
va disminuyendo en los subsecuentes. Otro método común de análisis de datos es conocido
como análisis de agrupamientos, el objetivo de este tipo de análisis es encontrar la mejor
forma de agrupar datos multivariables, lo suficiente como para encontrar agrupamientos
significativamente distintos, pero que los datos al interior de cada agrupamiento sean
similares. Para llevar a cabo este tipo de análisis se han desarrollado diferentes tipos de
algoritmos los cuales se dividen en tres tipos:

Los aglomerativos, en donde en cada paso del análisis se generan agrupamientos de datos.

Los divisorios, los cuales agrupan todos los datos obtenidos en un solo grupo inicial, el cual
se va dividiendo en dos mas con cada paso del análisis

Los particionales, los cuales asignan los datos a distintos agrupamientos sin utilizar una
jerarquización para la división

La varianza observada en los datos obtenidos por estos análisis es resultado de las
diferencias bioquímicas entre las muestras.

Existen ocasiones en las que algunas de estas variaciones también pueden ser resultado de
efectos físicos, especialmente cuando el tamaño de las células es similar al número de onda
utilizado, a este efecto se le conoce como fenómeno de dispersión de tipo Mie, el cual puede
provocar distorsiones en la posición e intensidad de las bandas de absorción observadas

La dispersión Mie: puede resultar en una amplia oscilación sinusoidal en la línea base del
espectro lo que puede llevar a distorsiones tanto en la posición como en la intensidad de la
banda de absorción. Además la eficiencia de este análisis de dispersión es dependiente del
índice de refracción de la muestras y cambia en el pase a través de una resonancia de
absorción, en un efecto llamado "resonancia de dispersión Mie". Por ejemplo un incremento
en la dispersión Mie es observado comúnmente en células que se vuelven más redondeadas,
debido a la acción de agentes citotóxicos.

BIBLIOGRAFIAS

-Infrared and Raman spectra of inorganic and coordination compounds, K. Nakamoto, Wiley (2004)
Peluso, A. Tesis Doctoral, Universidad Nacional de La Plata, Argentina, (2006).
-FARMACOPEA MERCOSUR: ESPECTROFOTOMETRÍA INFRARROJO MERCOSUR/GMC/RES. Nº 11/15

-Espectrofotometría Infrarrojo - SICE.OAS.orgPDFwww.sice.oas.org › RES_011_2015_s

-European Pharmacopoeia, Council of Europe, Strasbourg, 3ª edición, 43-44, 1997.

-M. Blanco, J. Coello, H. Iturriaga, S. Maspoch, C de la Pezuela, Analyst, 123, 135R, 1998.