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ipen tmOtuto d*
Enargéth— •
PnquI—m
Nuol—n»
Orientador:
Profa. Dra. Bárbara Maria Rzyskí
São Paulo
1994
ir^STITUTO DE PESQUISAS Ef^ERGÉTICAS E NUCLEARES
Autarquia associada à Universidade de São Paulo
SÀO PAULO
1994
4
4
Agradecimentos
Este trabalho contou com a colaboração de várias instituições e profissionais de áreas diferentes da
ciência. A parte experimental foi realizada em três laboratórios:
Agradeço ao CNPq pela bolsa concedida e ao IPEN pela possibilidade de realizar este trabalho.
Várias pessoas contribuiram de forma significativa para a realização deste trabalho, a todas elas o
meu sincero agradecimento;
A Dra. Bárbara Maria Rzyski (IPEN) pela orientação e oportunidade de realizar um trabalho desta
natureza.
A Dra. Maria .Alba Cincotto (PO LI/U SP) pelo apoio científico e moral nos momentos dificeis, pelo
incentivo e constante colaboração.
A Maria Inês Z.Saío (CETESB) pela disponibilidade nas discussões sobre algumas questões
microbiológicas.
A Dra. Petra Sanchez Sanchez (CETESB) por ter possibilitado a realização de boa parte do trabalho
experimental no laboratótio de microbiologia.
Ao Eng^. Vandertey M. John (IPT) pela paciência, em diversas situações, com a qual me ensinou a
usar o programa Windows
Ao Dr. Osvaldo Garcia Jr. (UNESP/ARARAQUARA) pelos primeiros passos para a familiarização
I com Thiobacillus.
Ao Dr. George Lucki (IPEN) pela tradução de artigo em língua russa, sem a qual haveria uma
lacuna no levantamento bibliográfico.
Ao Dr. Daniel Atendo (I. G./USP) pela Difração de raios-X e primeiros passos em geologia.
Às bibliotecárias Elaine C. Pereira, Ney Marly Moura e Maria Teresa Zanútowski (JPEN) pelo apoio
bibliográfico.
A Luiziana F. Silva (Agrup.de Biotecnologia-ÍPT) por algumas observações criticas na etapa final.
Aos Eng^^ Vera Lúcia A. Sardinha e Estevam Morinigo Jr. (SABESP) que colaboram na viabilização
de algumas amostragens.
Isiki.
Aos colegas do Lab. de Química dos Materiais do Agrup. de Materiais de Construção civil do IPT,
especialmente à Maria Cecília Florindo e Valdecir A. Quarcioni
Aos meus amigos Celina, Eni, Márcia, Irai, Neide, Marcos, Ananda, Tufik, Misefa, Gi, Eder, Bete,
Sían e Chico pelo apoio sempre que foi necessário.
A Dra Heloísa Barbosa (ICB/USP), que por sua sensibilidade e didática no curso de Microbiología
básica para a graduação, despertou-me uma verdadeira paixão pelo universo dos microrganismos
Ao Acauã por ser um grande companheiro de estrada
Resumo
Abstract
The construction of final shallow ground repositories for l o w and intermediate level
radioactrs'e w a s t e s is an increasing need in Brazil. Ehie to the requeriment of a ser\ice life of
the concrete of about 500 years, it is important t o evaluate any possible deterioration
mechanism This w o r k intended t o mvestigate the effect of concrete biodeterioration by
microorganisms.
After the isolation of five neutrophilic strains and five acidophilic strains, preliminar>'
identification test for Thiobacillus w a s performed. Through this w o r k it w a s identified t w o
strains of Thiobacillus thiooxidatis, one strain oi Thiobacillus ferrooxidans and one strain of
Thiobacillus thioparus.
u
GLOSSÁRIO:
ni
Biofilme: crescimento microbiano que forma uma película sobre materiais inorgânicos.
Este filme é formado pela excreção de produtos extracelulares como
heteropolissacarideos ou proteínas.
IV
col. = colônia
mm. = minuto
N M P = n ú m e r o mais provável
VI
SUMÁRIO
Pag.
Resumo i
Abstrat ii
Glossário üi
Abreviações vi
l.INTRODUÇÃO 1
1.1 A questão da deposição dos rejeitos radioativos 1
1.2 Objetivos 7
2. LEVANTAMENTO BroLIOGRÁFICO 8
2.1. Biodeterioração 8
2.1.1. Uma questão semântica 8
2.1.2. A biodeterioração de minerais 9'
2.1.2.1. Biodeterioração p o r formação de biofilme e
acúmulo de água 9
2.1.2.2. Biodeterioração p o r tensão de sais 10
2.1.2.3. Biodeterioração p o r complexação 10
2.1.2.4. Biodeterioração p o r ataque ácido 10
2.1.3. O ciclo do enxofre associado ao processo de corrosão
microbiológica e biodeterioração 11
2.1.3.1. Bactérias r e d u t o r a s de sulfato 11
2.1.3.2. Bactérias sulfoxidantes 12
2.1.4. Corrosão microbiológica de metais 16
2.1.4.1. Processo aerobio de corrosão microbiológica 17
2.1.4.2. Processo anaeróbio de corrosão microbiológica 18
3. M A T E R I A I S E M É T O D O S 34
3.1. Materiais 34
3.1.1. Equipamentos 34
3.1.2. Materiais 34
3.1.3. Reagentes 35
3.1.4. Soluções 36
3.1.5. M e i o s de cuhura 36
3.2. Metodologia 38
3.2.1. Descrição geral dos experimentos efetuados 38
3.2.2. A m o s t r a s estudadas 38
3.2.2.1. Concreto deteriorado : estudo-de-caso 40
3.2.2.2. Amostras coletadas do ambiente construído 45
3.2.2.3. Amostras de areias para construção civil 46
3.3.1.4. C o n t a g e m de fimgos 55
3.3.1.5. T e s t e quahtativos para bactérias redutoras de
sulfato 56
3.3.2. Composição química da matriz (concreto/esmdo-de-caso) 56
3.3.2.1. Reconstituição de traço 56
3.3.2.2. Difi-ação de raios X 57
3.3.3. Testes presuntivos quahtativos para Thiobacillus 57
3.3.4. Obtenção de cultura pura e identificação de Thiobacillus 57
3.3.4.1. Seleção p o r passagens sucessKas em meio m i n e r a l . . 58
3.3.4.2. Isolamento das colônias em meio sóhdo seletivo 59
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 69
4.1. Resuhados obtidos em estudo-de-caso 69
4.1.1. Resultados das análises microbiológicas quantitativas 69
4.1.2. Resultados da análise microbiológica em períodos de
coleta diferentes 70
4.1.3. Resultados da análise quimica da matriz do concreto 70
4.1.4. Discussão d o s r e s u l t a d o s 71
4.2. Testes presuntivos qualitativos p a r a r . / / j / c p a r u s 73
8. A N E X O S 113
ANEXO I (Soluções) 113
A N E X O n ( M e i o s de cultura) 115
l.INTRODUÇÃO
U m levantamento feito por S U A R E Z ^ ^ ' ) previu que até o ano 2010 o volume
total de rejeitos acondicionados no Brasil chegaria a 8.000 m^, além dos 3.500 m^
resultantes da área contaminada após a violação de uma fonte de ^^'^Cs, em setembro de
1987 na cidade de Goiânia ( G 0 ) ( ^ ' ) . O s rejeitos resultantes deste acidente deverão ser
depositados separadamente dos demais.
e r e a ç õ e s álcali-agregados;
» tensões térmicas resultantes d o calor de hidratação do cimento; e
t e n s ã o interna por uma sobrecarga externa.
2.1. Biodeterioração
Este trabalho possui uma interface entre a microbiologia e a engenharia civil, por
essa razão, elaborou-se m n glossário , no qual são definidos alguns t e r m o s técnicos
utiüzados nesta dissertação (PP «
• complexação; e
• ataque ácido.
10
2.1.3. O ciclo do enxofre associado ao processo de corrosão
microbiológica e biodeterioração
Bactérias Bactérias
ondantes oxidantes
Composto
orgânico de enxofre
11
Carbono organico^gj„^,¿o
Oxidado fr^^,^ > ^ 2-
Carregadores \f
do transporte •
I «( eletrônico /V
Reduzido soj
Carbono '''9^^*'^°^^^^^^^
* CO,
12
'reduzido
Oxidado
Carregador
2e- de
Elétrons
Reduzido AEROBIOSE
^oxidado
'reduzido
Oxidado •>N02 (NO+N2O+N2)
Carregador
2e- de
Elétrons
Reduzido ANAEROBIOSE
^oxjdado
13
APS= A d e n o s i n a 5 f o s f o s s u l f a t o
14
Tabela 2 . Características dos membros de cada g r u p o de Thiobacillus
15
o Grupo l a
HETEROTRÓFICOS
pH>5,0
|pH<S,0
Grupo?
AUTOTRÓFICOS
pH>2,8 ', pH<2,8
16
A denominação corrosão microbiológica, empregada para expressar a participação
dos microrganismos nos fenômenos de corrosão, p o d e induzir a pensar-se na existência de
um processo químico diferente, o q u e é u m equívoco, pois a natureza eletroquímica da
corrosão permanece válida nos casos de corrosão por microrganismos. Segundo
VIDELA^^^) os microrganismos participam do processo de corrosão da seguinte maneira:
17
de uma célula de aeração diferencial. A formação de luna comunidade heterogênea de
microrganismos p r o d u z u m filme microbiano sobre a superficie do metal, q u e resuha na
depleção de oxigênio sob o filme. N e s t a s condições, uma área de d e p l e ç ã o de oxigênio
t o m a - s e anódica em relação a outra área mais oxigenada. N o ânodo o metal susceptível
sofre oxidação e vai para a solução, enquanto o s elétrons hberados combinam-se c o m a água
e o oxigênio n o cátodo^^^- A Figura 6 apresenta este processo de forma esquemática .
Area ^^^SlXÍ"
catódica e Area g
anódica i
Metal M
Figura 6 : Célula de aeração diferencial composta por uma comunidade microbiana aerobia
sobre a superficie de um metal (ATLAS^^
18
3Fe(OH)2
Fes
2-
SO^ * Z lactato
2 acetato + 2 CO2+ 2 H¿0
H* OH H*
OH" H* SO4"
H* OH"
19
2.1.5. A ecologia da corrosão microbiológica
• A interação exopolimero-metal; e
20
ambientais, tais c o m o p H , potencial de oxi-redução, e competição de íons. A ligação do
metal c o m o exopolímero microbiano depende da estrutura química do exopolímero.
21
22
2.2.1.2. Ação ácida na matriz de cimento hidratado
23
P r o d u ç ã o de g á s sulfídrico n o e s g o t o p o r bactérias redutoras d e sulfato e
d e c o m p o s i ç ã o de proteínas;
E s c a p e d o g á s sulfídrico do e s g o t o p a r a a atmosfera;
CONCRETO
• REGIÃO ANAERÓBIA
DO ESGOTO
24
p o u c o s anos, concretos novos, do esgoto, deterioraram-se apesar de serem cobertos por
tuna camada protetora de epoxi.
25
período de 50 dias, enquanto as amostras c o m p o s t a s p o r cimento Portland c o m u m levaram
120 dias para apresentar essa mesma alteração no pH. Em trabalho pubhcado
posteríormente. S A N D & BOCK^^^) constataram, depois de 270 dias d e incubação das
amostras de c o n c r e t o em câmara controlada de H2S, q u e os corpos de prova de concreto
confeccionados com cimento Portland de alta resistência a sulfatos apresentaram
deterioração neghgenciável; os corpos confeccionados c o m cimento Portland comum
apresentaram g r a u médio de deterioração, enquanto que os corpos confeccionados com
cimento Portland de alto-fomo exibham forte grau de deterioração.
26
1) Tanque de aeração
2) Soluf áo com lodo
3) Corpo de prova de concreto
4) Cavidade de vidro setn &mdo
5) Tampa de borracha
tf) Zona de capilares de wdro incorporados
ao concreto para obsenrajáo da atividade
vital ios microrganismos
1 2 3 4 5
Terrpo (semanas)
27
A detecção de espécies aeróbias e anaeróbias, e a sua proliferação, n o s p o r o s do
concreto, indicaram u m estado ativo da microbiota nas c o n d i ç õ e s e x t r e m a s de p H n o
interior do poro. O autor supõe que, as células microbianas, a o e n t r a r e m n o s p o r o s do
concreto, durante a infiltração e difiisào da água, do tanque para a b a s e d o corpo-de-prova,
adaptam-se às condições de p H do poro (igual a 12). Neste caso, o c o r r e a interação de dois
principios: a alcalinidade d o concreto age sobre os microrganismos, e, p o r outro lado, o s
microrganismos mudam o valor do p H do meio para as suas p r ó p r i a s condições ótimas
através da produção de ácido durante o seu metabolismo.
28
de 5,0, os T. thiooxidans iniciam o seu crescimento causando acidificação intensa, abaixando
para p H 2 a superfície d o concreto . A Figura 11 esquematiza o processo em questão. Esta
figura foi elaborada a apartir dos resultados apresentados p o r MILDE^^')
SUPERFÍCIE DO CONCRETO
pH<7
TTiiotacilhíS novetliís
Thiobacillus nmpvZitanttr
rhiobacillus thiooxidans «
29
representadas p o r Symtococcus sp. N e s t e processo t o m a m parte bactérias aeróbias e
anaeróbias, e algmnas destas encontram-se em associações tróficas.
-Bactérias heterotróficas
Thiobaafíus
Bactérias
Redutoras de
Sulfato
Microrregiões anaeróbias
com substôncías orgânicas
mm
5)
Concreto deteriorado
por dissolução ácida dos
compostos hidratados do
cimento
30
2.2.1.9. Estudo de biocidas no combate à biodeterioração
P o r r a z õ e s econômicas, o interesse na prevenção d o processo de biodeterioração
t e m aumentado n o s últimos anos. Uma possibilidade para reduzir a extensão da deterioração
p o d e ser a inibição d o crescimento dos Thiobacillus pela aplicação de biocidas. E M M E L e
colaboradores(2^) testaram 16 biocidas quanto capacidade de inibição d o crescimento de
Thiobacillus e obtiveram resultados satisfatórios em dois tipos de biocidas, o que pernoite
sugerir-se q u e estes p o d e m ser utilizados com sucesso para prevenir ou reduzir a
biodeterioração d o concreto por produção biológica d e ácido sulfúrico. Este trabalho não
revela a composição quimica destes biocidas.
31
Óleo, construídos em concreto e abastecidos de a e r a ç ã o suficiente. A ação das B R S na
corrosão da armadura do concreto não está bem definida. Supõe-se que o gás sulfídrico
produzido pelas B R S p o d e ser utilizado como substrato pelas bactérias sutfoxidantes no
processo de oxidação. Outra possibilidade é o sulfeto, produzido biologicamante, reagir com
I a superfície do aço da armadura causando a corrosão. E m tanques de estocagem de óleo,
onde coexistem condições aeróbias e anaeróbias, tanto as B R S , quanto as bactérias
sulfoxidantes p o d e m estar ativas cotr^letando o ciclo d o enxofre.
32
A N I R E X (Nuclear Industry Radioactive W a s t e Executive), uma empresa prestadora
de serviços de gerenciamento de rejeitos radioativos na Inglaterra, desenvolveu um
programa amplo de pesquisa para determinar a influência d o s microrganismos n o s locais de
deposição de rejeitos radioativos. O estudo observou como populações mistas de
microrganismos p o d e m sobreviver e crescer em m n repositório de concreto para rejeitos
radioativos d e nível babeo de radiação. Esta pesquisa confirmou que existem microrganismos
capazes de crescer sobre os componentes orgânicos d o s rejeitos, e m p H elevado, próximo
ao concreto do repositório. O p H de 12,25 parece ser o limite superior tolerável para o
crescimento microbiano. Embora os rejeitos não se apresentem c o m o substratos ótimos para
a atividade vital microbiana, as condições ambientais são suficientes para permitir o
crescimento d o s microrganismos^^^X
33
3. MÂTERÎAIS E MÉTODOS
3.1. Materiais
3 . 1 . 1 . Equipamentos
• Autoclave, marca Lutz Ferrando, m o d e l o Esteril-matic vapor Luferco, São
P a u l o , Brasil;
Autoclave, marca Phoenix, m o d e l o A V - 1 8 , Araraquara, São Paido;
Balança anaUtica com precisão de 0,001 mg, marca Mettler, Zurique, Smça;
Balança semi-anahtica com precisão de 0,1 g, marca Mettler, modelo Pn
1210, Zurique, Suiça;
Banho-maria, marca Quimis , Diadema, Brasil;
Contador de colônia, marca Gallenkamp, catálogo N o CX 300, Inglaterra;
Destilador de água, marca Corning, m o d e l o A G I 1, São Paulo, BrasU;
Estufa para esterilização e secagem, marca L u t z Ferrando, São Paulo, Brasil;
Fluxo laminar, marca Veco, modelo V L F S 18, Campinas, Brasil;
Incubadora bacteriológica, marca Precision PS Scientific, modelo 805,
E s t a d o s Unidos da América;
Incubadora bacteriológica construida n o I P E N ;
Potenciómetro marca Digimep, m o d e l o D M p H 2 , São Paulo, Brasil;
Refrigerador marca Brastemp, 320 ütros, Brasil;
Shaker, (agitador de erlenmeyers). marca N e w Brunswick Scientific, modelo
Incubator Shaker- serie 25, New Jersey, USA..
3.1.2. Materiais
• Balões volumétricos: de borossihcato (Pyrex ou vidro neutro) com
capacidade de 100 mL , 1 L e 2 L;
• Bico de Bunsen,
• Estantes de arame galvanizado, perfiiradas, para t u b o s de ensaio com 18 mm
de diâmetro X 180mm comprimento e para tubos com 16mm de diâmetro X
150mm de comprimento;
• Frascos para água de diluição, de borossihcato (Pyrex ou vidro neutro), com
t a m p a s de rosca que permitam boa vedação e sejam liwes de substâncias
tóxicas solúveis. Este frasco deve ter capacidade para volumes maiores do
q u e 100 m L para permitir boa h o m o g e n e i z a ç ã o ;
34
F r a s c o s de Erlenmeyer,de borossilicato com capacidade de 2 5 0 TDL, 500 mL,
1000 m L e 2 0 0 0 m L ;
Jarras de anaerobiose;
M e m b r a n a filtrante, marca MiUipore de p o r o s i d a d e 0,22 m i c r ô m e t r o ;
Pipetas,tipo M o h r de 5 e 10 mL com graduação de 1/10 e erro de cahbração
inferior a 2 , 5 % e com bocal para t a m p ã o de a l g o d ã o ;
Placas de Petri, de vidro pyrex ou plástico atóxico transparente;
P o r t a filtro para membrana filtrante;
Sistema g e r a d o r de dióxido de carbono e hidrogênio;
Tela d e amianto;
Tripé;
T u b o s de ensaio: de borossilicato (pyrex) ou vidro n e u t r o , de 18mm x
1 8 0 m m e 16mm x 150mm;
3.1.3. Reagentes
Acetato de c h u m b o p.a., Merck;
Ácido bórico p . a . , C A A L ;
Ácido sulfiirico p.a., Q.M.;
Agar; M e r c k
Agarose , Sigma:Type II Medium EEO/A-6877
Bicarbonato de sódio p.a., C A A L ;
Cloreto de amonio p.a., Merck;
Cloreto de cálcio p.a., C A A L ;
Cloreto d e c o b a h o hexahidratado p.a.,Merck;
Cloreto de magnesio hexahidratado p.a.; C A A L ;
Cloreto d e m a n g a n ê s tetrahidratado p.a.. Cario Erba;
Cloreto de potássio p.a.; C A A L ;
Cristal violeta p.a.. Nuclear;
Dextrose p . a . , M e r c k ;
Enxofre elementar p.a., Ecibra;
Extrato d e levedura; Difco;
Fosfato de potássio dibásico p.a.; Nuclear;
Fosfato d e potássio monobásico p.a.. Nuclear;
Hidróxido d e sódio p.a., Merck;
l o d e t o de p o t á s s i o p.a., Merck;
35
Iodo p.a., Reagen;
L a c t a t o de sódio p.a., Merck;
Molibidato de amonio p.a., Cario Erba;
Nitrato de cálcio P.A, C A A L ;
N e o p e p t o n a ; Difco
Nitrato de potássio p.a.. Nuclear ;
Oxalato d e amonio p.a.,Merck;
Safranina p.a., Fluka;
Sulfato d e amonio p.a., Ecibra;
Sulfato de cobre heptahidratado p.a.,Merck;
Sulfato ferroso amoniacal hexahidratado p.a., Merck;
Sulfato ferroso heptahidratado p.a., Nuclear;
Sulfato de magnesio heptahidratado p.a.; Nuclear;
Sulfato de zinco heptahidratado p.a.; Q.M.;
Tiocianato de amonio p.a., Merck;
Tiossulfato de sódio pentahidratado p.a., Merck;
Triptona, Difco;
V e r d e de bromocresol p.a., Merck;
Vermelho de fenol p.a.,.Merck.
3.1.4. Soluções
36
Tabela 3 : M e i o s de cultura e sua utilização
Meio de cultura titüização
Postgate liquido modificado para T.thioparus T e s t e presuntKo para T.thioparus
Postgate sólido modificado para T.thioparus Isolamento de T. thioparus
A T C C 238 líquido adaptado para T.thioparus Crescimento de T.thioparus
( 0 , 5 % de tiossulfato de sódio)
Postgate líquido modificado para T.thiooxidans T e s t e presuntivo para T. thiooxidans
Postgate sólido modificado para T.thiooxidans Isolamento de T. thiooxidam
9 K - SO Uquido Enriquecimento de T. thiooxidam
9K-Fe2+b'quido T e s t e presuntrvo para T.ferrooxidam
"TK" sóUdo Isolamento de T.ferrooxidam
A T C C 238 c o m 1% de S^ ( p H = 4,2) Crescimento de T. thiooxidam
A T C C 238 c o m 1% de SO ( p H = 12) Sobrevivência de T. thiooxidam
A T C C 238 - tiossulfato agar Isolamento de T. thiooxidam
Meio de cultura para indicação de espécie Teste presuntrvo para T.denitrificam
anaeróbia ( T.denitrificans)
Agar triptona extrato de levedura C o n t a g e m de bacterias heterotróficas
Agar Sabourand dextrose C o n t a g e m de fimgos
Meio de Starkey Teste presuntKo para
Bactéria redutoras de sulfato
Meio S6 Teste de identificação (cepa neutrofílica)
Meio S 5 Teste de identificação (cepas acidofihcas)
SO + 6% de riossulfato T e s t e de identificação (cepa neutrofilica)
S6 + 4 % de fosfato Teste de identificação (cepa neutrofilica)
5 5 + 4 % de fosfato Teste de identificação (cepas acidofilicas)
56 + 1% de S0(sem riossulfato) Teste de identificação (cepa neutrofilica)
5 5 + 1% de S0( sem riossulfato) Teste de identificação (cepas acidofilicas)
56 + 5% de NaCl Teste de identificação (cepa neutrofíhca)
S5 + 5 % de NaCl Teste de identificação (cepas acidofilicas)
S8 Teste de identificação para observar
denitrificação em anaerobiose
S7 Teste de identificação para observar
crescimento em tiocianato
Agar nutriente Teste de identificação para obser\'ar
crescimento heterotrófico
Agar citrato de Simon's Teste de identificação para observar utihzação
de citrato
37
3.2. Metodologia
38
CONTAGEM DE
CONCRETO
BACTtRUS
SOLO ANALISE
MICROBIOLÓGICA HETEROTRÓFICAS
í EFLORESCÊJCIA
QUANTITATIVA
(IhBT^BÜTANTAN) EBsak»
eoia.pkAeBtki«i ;
pH, UMIDADE,
MASSA SECA
LODO
^ (ETA.RIACHO GRANDE)
C01«nŒT0 »•
(GUARAPIRANGA)
ANAUSE TESTE
QUALITATIVA PRESUNTIVO
EFLORESCENOA
PARA POSITIVO
(PISCINA-CEPEUSP)
THtOBACãJ.US
AREIAS!
ITAQUAQUECETUBA - S.P.
ISOLAMENTO
BIRITIBA MIRIM-S.P.
JACAREÍ-SJ».
PURinCAÇAO
IDENTinCAÇAO
39
3.2.2.1. Concreto do reservatório de água do Instituto Butantan
O estudo-de-caso, n o qual se realizou o teste d o s t u b o s múltiplos para obtenção do
número mais provável de Thiobacillus, contagem de bactérias heterotróficas e fimgos, foi
efemado sobre o concreto de u m reservatório de água construído na década de 1970. Este
reservatório está situado próximo à Cidade Universitária A r m a n d o de Salles Olheira, e
pertence ao Instituto Butantan - São Paulo. O aspecto geral da estrutura de concreto pode
ser observado na Figiu-a 14 .
Figura 14; Estrutura geral d o reservatório de água do Instituto Butantan, São Paulo
40
F o r a m coletadas amostras de eflorescencia, abaixo da junta de concretagem, amostra
do concreto c o m corrosão da annadura e amostra de solo em c o n t a t o com a base da
estmtura do concreto. A s características das amostras coletadas estão apresentadas na
Tabela 4 .
41
42
A Figura 17 evidencia, em detalhe, u m a região onde o c o r r e fissura. A fiiixa
esbranquiçada, acima da fissura, mostra acúmulo de eflorescencia sem lunidade aparente. A
faixa esverdeada, abaixo da fissura, apresenta-se c o m vazamento de água, onde a
eflorescencia possui uma consistência gelatinosa e aspecto arenoso; causando a inq)ressão
da ocorrência de colonização por microrganismos
43
Figura 18 : Detalhe da região apresentando concreto com corrosão da armadura exposta-
reservatório de água do Intituto Butantan, São Paulo
44
3.2.2.2. Amostras coletadas do ambiente construido
na Tabela 5 .
distintas
Amostra Código Características Procedência
Brita graúda com C.7 Amostra parcialmente recoberta Captador de água bmta
concreto por limbo escuro da represa de Guarapi ranga
(São Paulo - S P )
E T A = Estação d e t r a t a m e n t o de água
45
3.2.2.3. Amostras de areias para construção civil
Itaquaquecemba
46
COMISCAD I - A l . C K / . . N E R 6 I A N U C L E A R / S P • IPE®
do IPT e as amostras de Jacareí foram coletadas em depósito no IPEN, enquanto as
amostras de Itaquaquecetuba foram coletadas diretamente do porto.
3.3. Métodos
47
3.3.1.1. Técnica dos tubos múltiplos para determinação do número mais
provável (NMP) de Thiobacillus
48
Meio de cultura Espécie de Reação Indicação de
Thiobacillus crescimentol
F u n d a m e n t o da técnica:
Neste caso, utUizaram-se cinco t u b o s para cada diluição, sendo q u e cada tubo é
marcado simplesmente como positKo ou negativo, não sendo necessário pesquisar o n ú m e r o
de microrganismos em cada tubo positivo. A combmação de resuhados positivos e negativos
da etapa de diluição, antes da extmção, é utilizada em conexão com tabelas estatísticas
apropriadas (como por exemplo a Tabela 8 ) para obter a contagem de bactérias viáveis.
49
Procedimento da técnica
50
l O m L e m cada t u b o * *
TTTTl
M 10
1)
T
Apót a inoculação
_ K incubar à temperatura
de 2 8 t 2 « C
durante 21 dias
10 mL i
1 mL em cada t u b o *
Após o período de
«#* íncubaçãD. verificar
o número de tubos
positivos e negativos
10-2 e aplicar a Tabela 8
10mL|,
n-ésjma diluição
1 mL em cada tubo*
10
1] Amostra
2) Água destilada estéril
3) Suspensão 1:10 da amostra em égua destilada estéril
após agitação de 200 rpm por 30 min.
51
Tabela 8 : índice de N M P e limites de confiança de 9 5 % , quando são utilizados inóculos de
10 mL, I m L e 0,1 m L em séries de cinco tubos^^l)
Índice de Liniilrs de conflança de
Número de tubos com reação positiva quando sao inoculados , em NMP/lOOniL 95%
séries de cincotubos, i n t u i o s de
10 mL ImL 0.1 mL Inferior Superior
0 0 0 <2 -
0 0 1 2 <1 10
0 1 0 2 <1 10
0 2 0 4 <1 13
a 0 2 <1 11
a I 4 1 15
j( 4 0 4 1 15
f 1 1 6 2 18
l 2 0 6 2 18
0 0 4 1 17
j 0 1 7 2 20
j 1 0 7 2 21
I 1 9 3 24
2 2 ü 9 3 25
2 J u 12 5 29
3 0 0 8 3 24
3 0 1 11 4 29
3 1 0 11 4 25
1 1 14 6 35
3 2 0 14 6 35
3 2 1 17 7 40
4 0 13 5 38
4 »0 1 17 7 45
4 1 0 17 7 46
4 1 1 21 9 55
4 1 2 26 12 63
4 2 a 22 9 56
4 2 1 • 26 12 65
4 3 0 27 12 67
4 3 1 33 15 77
4 4 0 34 16 80
ü 0 23 9 86
5 0 1 30 10 110
0 2 40 20 140
1 0 30 10 120
5 1 1 50 20 150
5 1 2 6(1 30 180
5 5(1 20 170
2
2 I
0 7Ü 3(1 210
2 2 90 40 25(1
3 0 8(1 3(1 250
5 3 1 IlU 4U 300
5 3 2 140 60 360
s 3 3 170 80 410
4 0 130 50 390
5 4 1 170 70 480
5 4 2 220 10(1 580
5 4 3 28U 120 690
5 4 4' 350 160 820
S 5 0 240 100 940
5 5 I 300 100 1300
5 5 2 500 200 2000
5 5 .3 900 30(1 2900
5 5 4 1600 60U 5300
5 5 5 >U)00 - -
52
Onde:
53
3.3.1.2. Ensaios complementares à análise microbiológica quantitativa
M2XIOO
ML
54
colonias, observáveis a p ó s d e t e r m i n a d o período de incubação. V o l u m e s decimais adequados
da amostra são inocxilados e m p l a c a s de Petri, adicionando-se a seguir o meio sólido Agar
Triptona Extrato de Levedura. A p ó s o período estabelecido para a incubação, é feita a
contagem das imidades f o r m a d o r a s d e colônias (UFC)/ mL c o m o auxílio de m n contador
tipo Quebec ou similar. E s t e m é t o d o foi efetuado conforme critéríos estabelecidos pela
N o r m a Técnica C E T E S B L5.201(22).
55
A anáhse química da matriz foi efetuada em duas regiões : uma região seca, sem
vazamento de água, e uma região com vazamento de água. Estas anáhses foram reahzadas
com o objetivo de conseguir-se a reconstituição de t r a ç o destas duas regiões, e tambéin com
o objetKo de observar se este concreto teria, na sua composição, um sulfeto potenciabnente
oxidável pelos Thiobacillus.
56
3 . 3 . 3 . Testes presuntivos qualitativos para Thiobacillus
57
'•íllkriJZir • TO
3.3.4.1. Seleção por passagens sucessivas em meio mineral
Este procedimento em meio seletivo por diluição do inoculo inicial, foi uma etapa
efetuada antes do isolamento em meio sólido. Esta técnica permitiu selecionar p o r pressão
seletiva, as bactérias que foram capazes de crescer n o s meios líquidos de cultura adequados
para cada espécie de Thiobacillus
58
• M e i o sólido de Postgate modificado para T.thioparus {T.thioparus); e
59
AMOSTRA
i
T E S T E S P R E S U N T I V O S POSITIVOS
TÉCNICA DE E N R I Q U E C I M E N T O P O R D I L U I Ç Ã O
[ 5 repiques s u c e s s i v o s e m m e i o líquido s e l e t i v o )
4.
r.tfiiooxidans r.tMoparus
- 9K-S°
r.ferrooxfdans P o s t g a t e modificado
— Postgate modificado 9 K Fe 2 * r.tMoparus
p/ T.thiooxidans
4.
ISOLAMENTO E M MEIO SÓLIDO SELETIVO
4.
T.thíoax/dans
^^^^ „ . T.ferroaxf'ífans r.tñ/oparus
• ATCC 2 3 8 T i o s s u l f a t o -Agar j ^ , ^ P o s t g a t e modificado
• P o s t g a t e s o l i d o p / r . ittiooxidans ^ir.thioparus
COLÔNIAS ISOLADAS
COLORAÇÃO D E G R A M
EXAME MICROSCÕPICO
BACILOS G R A M - N E G A T I V O S
S E M E A R E M M E I O S S Ó L I D O S SELETIVOS PARA O B T E N Ç Ã O
DE C U L T U R A P U R A
4^
CULTURA PURA
60
3.3.4.4. Testes com os isolados em meios de cultura com variação do pH
inicial.
61
62
CEPA PURA
INCUÇAÇAO
EU MEIO LIQUIDO
(2Í°C-3DIAS)
MEI0S6 MEIO S5
(NEUTROííUCAS) (AcmoniiCAS)
INOCUIO
1
estria com alça 0,02 mL
de platina
I^«:UBAÇÃO À TEMPERATURA DE 2 ^
DURANTE 28 DIAS
identificação d o s Thiobacillus.
63
¡i.
65
meio e a distribuição em placas foram efetuadas em fluxo laminar, p a r a evitar a
' contaminação p o r microrganismos indesejáveis.
66
Tabela 10 : Composição quimica da escoria granulada de alto-forao (COSIPA)
Determinações (%)
Resíduo insoiúvel (RI) 2,00
Anidrido silícico (SÍO2) 35,02
Oxido de aluminio (AI2O3) 11,32
Oxido de cálcio ( C a O ) 43,07
Oxido d e magnesio ( M g O ) 5,97
Oxido de ferro ÇÍZ-^ÒT^ 0,03
Oxido de m a n g a n ê s ( M n 2 0 3 ) 0,72
Dióxido de titanio (TÍO2) 0,43
Oxido de sódio ( N a 2 0 ) 0,15
Óxido de potássio (K2O) 0,44
Sulfeto ( S 2 - ) 0,95
Nitrogênio total 0,08
Fósforo total 0,01
O preparo deste meio foi idêntico ao descrito para o meio de escória granulada de
alto-fomo.
67
1| SUBSTRATO DE INTERESSE
2) AGUA DESTIUDA
1 2 3) AGAROSE EM ÁGUA DESTILADA
AUTOCUWAR SEPARADAMENTE
À 1 2 1 ° C . P 0 R 30 MINUTOS
1+2+3
68
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
(teste presuntivo) Cl Cl C3
69
Tabela 12 : Características d a s amostras de concreto deteriorado, e s t u d o - d e - c a s o
Determinações Cl C2 C3
Umidade (%) 56 5 22
Cl C2
D a t a da coleta 18/03/92 25/05/92 18/03/92 25/05/92
pH 9,60 8,95 9,70 10,0
T.thioparus 2,4 X \Çp 3,3 X 105 5,0 X 105 1,7 X 104
70
Tabela 14 : Composição quimica da matriz analisada em estudo-de-caso - reservatório de
71
¡ Conforme se observa na Tabela 11 , as amostras apresentaram bactérias
j heterotróficas, fimgos e mdicação para Thiobacillus, presentes em quanridades
I representativas, coexistindo n o mesmo nicho, embora em amostras distintas. A presença d o s
I* mesmos tipos de microrganismos nas três amostras indica que a contaminação parece vir d o
solo, p o i s este, além de apresentar os mesmos tipos de microrganismos encontrados no
» concreto, apresenta t a m b é m teste para presuntrvo positivo para espécie anaeróbia de
Thiobacillus e para T.thiooxidans (espécie aerobia acidofíhca).
72
• A indicação de bactérias redutoras de sulfato, na amostra de concreto com
c o r r o s ã o da armadura exposta, é coincidente com a p r o p o s t a para o
mecanismo d e biocorrosão das armaduras apresentado p o r MOOSAVI^^^)
E interessante observar que, neste estudo-de-caso, as armaduras
I apresentavam-se expostas ao ambiente, p o r t a n t o , em uma condição oxidante.
! » A presença destas bactérias, estritamente anaeróbias, confirma a existência de
n i c h o s anaeróbios e m microrregiões do concreto com armadura exposta
73
Tabela 15 R e s u l t a d o s dos testes presuntivos qualitativos para T.thioparus em amostras
coletadas a partir do ambiente construido
Procedência Amostra T.thioparus pH
74
Estas amostras, utilizadas como inoculo, carregavam consigo uma certa quantidade
de cimento hidratado do concreto. Este fato esclarece a mudança na coloração do meio de
cuhura nas amostras moculadas : o hidróxido de cálcio, do cimento hidratado, ao ser
solubilizado, libera íons O H ' elevando o p H do meio. A alcalinização do meio p o d e inibú o
crescimento dos Thiobacillus ou mascarar o teste por neutralização d o ácido produzido.
75
o aumento da alcalinidade d o meio também foi observado em u m teste de
sobrevivência efetuado com algumas cepas acidofilicas incorporadas na água de
amassamento para a confecção de u m corpo-de-prova de argamassa. Q u a n d o se inoculou os
corpos-de prova em meio liquido 9 K contendo 1% de enxofre com p H inicial de 2,8; o p H
do meio chegava a 9,0 após u m período de sete dias incubação.
76
Tabela 16 :Resultado d o teste presuntivo para Thiobacillus de areias de procedencias
diferentes
Biritiba M i r i m A.1 + + + + + +
Biritiba M i r i m A.3 + - + - -
Biritiba M i r i m A.4 - - + - -
Biritiba Mirim A.5 - - - - -
Jacareí A.6 + + - - -
Jacareí A.7 + + - - -
Jacareí A.8 + - - - -
Itaquaquecetuba A.9 - - + + -
Itaquaquecetuba A.IO - - + + + +
A. 1 = Areia bruta coletada no meio do monte
A.2 = Arelas bruta coleta em um canto do monte
A.3 = Areia lavada (molhada) em contato com o piso
A.4 = Areia lavada (molhada) de região superior do monte
A.5 = Areia lavada após secagem de região superio do monte
A.6 = Areia úmida coletada da região superior do monte
A.7 = Areia úmida coletada de região não exposta à atmosfera
A.8 = Areia úmida em contato com o solo
A.9 = Areia final para distribuição
A. 10 = A r e n h o cimentado por sulfetos
77
4.3.2. Discussão dos resultados
S o m e n t e as a m o s t r a s procedentes do p o r t o de areia de Itaquaquecetuba foram
coletadas n o p r ó p r i o p o r t o , aquelas procedentes d o s p o r t o s de Jacareí e de Biritiba Mirim
foram coletadas a p ó s o transporte, dentro das expectativas de manipulação das areias
destinadas à construção civil.
78
4.4. Isolamento e identificação preliminar para Thiobacillus
F o r a m isoladas onze cepas na forma de cultura pura, das quais d e z foram submetidas
a u m conjunto de testes preliminares para identificação de Thiobacillus.
79
A Tabela 17 :Caracteristicas da macromorforfologia das colônias isoladas
AlOTf Arenito "TK" com agarose Colônia mmúscula (< 1 mm), seca,
coloração alaranjada, aspecto ferruginoso
(Itaquaquecetuba)
A2Tf Areia coletada no "TK" com agarose Colônia minúscula (< 1 mm), seca,
Setor de arelas d o I P T coloração alaranjada, aspecto ferruginoso
(Biritiba Mirim)
80
A Figura 24 mostra colonias isoladas das cepa neutrofílica C2Ar ; a Figura 25
mostra colonias isoladas da cepa C l m , ambas em meio sólido S6. E a Figura 26 mostra
colonias isoladas da cepa acídofílica AlOTf; o crescimento das colonias desta cepa evidencia
a oxidação do Fe^"*" com formação de F e ( 0 H ) 3 de cor ferruginosa.
Figura 24 . Cepa C2Ar em meio sólido S 6 (isolada do concreto com armadura exposta d o
reservatório de água do Instituto Butantan) - Ampliação - 2x.
81
Figura. 25 : Cepa C l m em meio sólido S6 ( i s o l a d a da amostra de eflorescencia do concreto
do reservatório de água do Instituto Butantan) - Ampliação ~ 2,5 x.
"•"VI
' .VI.-!
Figura. 26 : Cepa A l O T f era meio "TK" solido com sulfato ferroso (isolada do p o r t o de areia
de Itaquaquecetuba - S . P . ) - Ampliação - 2,5 x.
82
13
12 A9Th
- H - AlOTh
pH 11
-A— Controle
10
' "
7 14
21
T e m p o (dias)
83
p H 4,0. N ã o h o u v e mdicação da presença destas cepas a p ó s 14 dias de incubação e m
condições ótimas.
C2Ar + -
Clp + -
Cies + -
Clm + -
C4R.G. + -
AlOTh - +
A9Th - +
A2Th - +
AlOTf - -
A2Tf - -
O s resultados obtidos mostraram que nenhuma cepa neutrofihca foi capaz de crescer
em meio de cultura c o m p H micial = 5,0, p o r outro lado nenhuma cepa acidofíhca foi capaz
de crescer em meio de cultura com p H = 6,6.
84
p o r esse motivo as cepas acidofilicas A l O T f e AlOTf^ capazes de oxidar o Fe^"*"» em meio
9K-Fe2''", n ã o cresceram em meio sólido S5.
85
Tabela 20 : Valor do p H fínal em meio liquido de P o s t g a t e modificado para T.thiooxidans
após a incubação com algumas cepas acidofihcas
Cepa Amostra p H final
AlOTh Arenito cimentado p o r sulfetos - 1,7
(Itaquaquecetuba)
A9Th Areia para construção civil 1,0
(Itaquaquecetuba)
A2Th Areia bruta 2,7
coletada n o Setor de areias d o I P T
(Biritiba Mirim)
4.4.2.5. Meio ATCC 238 e meio ATCC 238 adaptado para T.thioparus em
comparação com os meios de Postgate modificados para T.thiooxidans e
T.thioparus
86
6
pH
11 pH 4 ^
2.
— (» (
S 10 15 20 5 10 15 20
(a) (b)
Figura 28(a): Variação d o p H do meio de cultura líquido A T C C 2 3 8 contendo 1% 8 ° para
as cepas acidofilicas e 0,5 % de N a 2 S 2 0 3 para a cepa AsuJ
Figura 28(b): Variação do meio líqiddo de Postgate modificado para T.thiooxidans para a
cepa AlOTh e meio hquido de P o s t g a t e modificado para T.thioparus para a cepa A 6 T p
Visto que estas bactérías isoladas mostraram ser de crescimento lento, este ensaio
ío\ reahzado para observar se o móculo, para os testes de identificação, tería quantidade
87
significativa de bactérias n o terceiro dia de incubação em meio S6/S5, como é proposto por
HUTCHINSON e colaboradores í^^) A Tabela 21 mostra a concentração celular em
fimção do tempo de incubação, em meio de cultura líquido S6 para as cepas neutrofilicas e
meio líquido S5 para uma cepa acidofiílica.
contagem inicial 5,9 X 103 2,7 X 10 4 2,7 X 105 6,2 X 104 2,8 X 103
88
COMISCAD KACXN/
10
8.
• •
6.
4:
2.
E
H 1 1 1 1 1 1
2 3 4 5 6
TENRPO (DIAS)
0 1 2 3 4 5 6 7
Terrpo (dias)
89
4.4.4. Resultado dos testes preliminares para Identificação de Thiobacillus
Entre as cepas acidofilicas testadas nenhuma delas foi capaz de crescer em agar
nutriente, portanto t o d a s apresentaram-se autotróficas obrigatórias. D u a s destas cepas
exibiram capacidade d e oxidar o F e 2 + em meio 9K-Fe 2+. Apenas a cepa A I O T f mostrou
capacidade de oxidação d o tiossul&to em meio S5 de 98 % e dimmuição d o p H n o s meios
contendo enxofre e tiossulfato para ababco de 2,0. Esta cepa mostrou características t ç i c a s
de T. ferrooxidam. A cepa A 2 T f apresentou apenas 10 % de oxidação d o tiossulfato n o
meio S5, o p H neste meio c h e g o u a 3,95. Apenas em meio contendo enxofre o p H final
chegou a 1,85. Estes resultados evidenciaram que esta cepa não apresentou as
características típicas p a r a T.ferrooxidam, merecendo portanto, investigações posteríores
para a identificação da espécie.
Entre as chico cepas neutrofilicas testadas, a única cepa que não cresceu em agar
nutriente apresentando p o r t a n t o caracteristica autotrófica obrigatória foi a cepa C 4 R G . Esta
cepa apresentou 9 9 % de oxidação do tiossulfato em meio S6 e p H final deste meio = 4,6.
E m meio contendo enxofre o p H final chegou a 4,00. Esta cepa foi capaz de crescer em
meio sóhdo S8 em condições de anaerobiose, mas não foi capaz de denitrificar em meio S8
hquido nestas condições. Estes resuhados mostraram caracteristicas típicas de T. thioparus.
90
tiossulfato inferior a 1 0 % da concentração inicial e pH final p r ó x i m o a 7,0; o pH final e m
meio contendo enxofre ficou p r ó x i m o a 6,4. Estas cepas conseguiram crescer e m meio
sólido S8 em condições anaeróbias, p o r é m não apresentaram denitrificação e m meio líquido
S8 nestas condições. A s c e p a s C 2 A r e C l p não cresceram e m meio c o n t e n d o citrato c o m o
fonte de carbono, enquanto as cepas C l m e C i e cresceram n e s t e meio.
91
92
A s espécies p e r t e n c e n t e s ao g r u p o l a são apresentadas c o m o s e n d o provavelmente
linhagens de T.versutus s e g u n d o a classificação mais recente de K E L L Y & HARRISON^*^).
A s colónias isoladas desta espécie crescem em ágar c o m aparência d e " o v o fiito". Esta
característica p o d e ser observada na Figura 25 q u e apresenta colónias da cepa Clm
crescendo sobre o meio sólido S6. Esta característica é mais u m indício d e que as cepas
Clm e C i e (que t a b é m possui esta mesma característica) p e r t e n c e m a o grupo la. N o
entanto, o valor do p H final e m meio S6 líquido apresentou-se acuna d o e n e r a d o para este
g m p o . P o r estes motivos, d e v e m ser realizados testes complementares p a r a classificar estas
cepas neutrofilicas autotróficas &cuhativas isoladas neste trabalho.
93
Tabela 22 : Resultados dos testes preliminares para identificação de Thiobacillus
Meio de cultura Critériode avaliação Controle C2Ar Clp Clm Cie C4RG Controle AlOTh A9Th A6Th AIOTf A6Tf
S6/S6 pH final 6,60 6,90 6,95 7,00 6,95 4,6 4,90 0,00 0,00 4,20 0,80 3,95
SO + 6% Oxidação de tiossulfato 0 0 8 0 0 0 0 46 60 0 0 1
tiossulfato (%)
Enxofre pH final 6,40 6,40 6,44 6,40 6,44- 4,00 4,50 1,50- uo- 4,43- 1,33- 1,85-
Meio S5 Meio 86
Acidofilicas Neutrofilicas
M e i o SG
Neutrofilicas i
Meio S5 i pH final > 5 . 0
Acidofilicas
pH final
4/ 2.0-2.8 i
Motilidade
Meio 8 8
pH final < 2 , 0 pH f i n a l ^ 6.6 - 5.0 I Grupo 7 |
Denitrífica
em O
anaerobiose I G r u p o l"|
3.5-2.8 iGrupoT]
Oxidação Fe2* vi/
IGrupo 4 ~ | Citrato
vi/
I Grupo S | |G^"PO 6 | 6,6 - 3.5
O
I Grupo 3 Grupo 1 a
{ Grupo O I
pH final
pH final > 6 . 5 6.5 - 5.0
vO
4.5. Resultados dos testes qualitativos de crescimento de cepas Isoladas
em meio de cultura elaborados com suspensões de materiais de
construção.
escória argamassa
A Figura 31 mostra a cepa C2Ar crescendo sobre o meio sólido de uma suspensão
de escória granulada de alto-forao ( C O S I P A ) .
96
t í...-" ' • . j- * ' N ' -.-li . .'.J-.l. 'í'.- . - • *!l
1e
'li
r
97
5. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
! ^
98
V" U V- Î- -
A investigação de Thiobacillus denitrificans e de bactérias r e d u t o r a s de
sul&to em amostras de solo e c o n c r e t o são de grande inqjortância para a
compreensão do fenômeno de biodeterioração do concreto em condições
anaeróbias e também da b i o c o r r o s ã o das armaduras de concreto.
99
Região de interesse
Fatores
Area preliminar
de
rettríçio \ i
Area Potencial
> 4-
Locais candidatos
INVESTIGAÇÃO DA MICROBIOTA
Microrganismos de interesse :
SELEÇÃO DE LOCAL
I Teste menor I
e Bactérias do gênero Thichacüba concentração
quantitativo
• Bactérías autotróficas facultativas
que oxidan tiossulfato menor
concentração equivalente
o Bactérias redutoras de sulfato risco
Cultura pura
i
TESTES PRELIMINARES E M MEIO SÓLIDO :
100
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
101
102
Quanto seleção dos materiais de construção:
Os testes qualitativos d e crescimento sobre os meios de cultura sólidos, contendo
s u ^ e n s õ e s de materiais de c o n s t r u ç ã o , indicam que a cepa C 2 A r p o d e obter seus nutrientes
a partir destes materiais.
103
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
104
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112
ANEXO I
SOLUÇÕES
H3BO3 2,90 g
MnCl2.4H20- 1,80 g
i ZnS04.7H20 0,20 g
[(NH4)6Mo7024.4H20] 0,03 g
C0CI2.6H2O 0,08 g
FeS04.7H20 1,90 g
; CUSO4.7H2O- 0,10 g
Água destuada 1000 m L
Água de dilulçãoí^'')
113
Adicionar 1,25 m L da solução e s t o q u e A e 5 m L da solução estoque B e conq)letar o
volume para u m litro d e água destilada. Distribuir em frascos de diluição, quantidades adequadas
que assegurem, a p ó s esterilização em autoclave a 121 ± ^ C durante 15 min., volumes d e 90 mL
+-2mL.
• R e a g e n t e s p a r a c o l o r a ç ã o d e G r a m (^2) .J
Cristal violeta de H u c k e r :
Solução A :
Cristal violeta 2 g
Álcool etílico a 9 5 % - 20 m L
Solução B :
Oxalato de amónio 0,8 g
Água destilada 80 m L
Filtrar e m papel de filtro após 24 h s
Lugol:
N u m gral, j u n t a r 1 g de iodo, 2 g de iodeto de potássio e triturar. Adicionar e m pequenas
quantidades o v o l u m e de 300 m L de água destilada. Preparar em quantidade suficiente que seja
utilizada antes de 30 dias.
C o r a n t e d e f u n d o d e H u c k e r (solução e s t o q u e ) :
Dissolver 2,5 g de safranina em 100 m L de álcool etílico. Para usar, jimtar 10 m L desta
solução estoque em 90 m L de água destilada.
H4
ANEXO 11
MEIOS DE CULTURA
Na2S203.5H2a 5,00 g
NH4CI 1,00 g
K2HPO4 3,00 g
CaCl2 0,10 g
MgS04.6H20 0,50 g
Solução t r a ç o s de elementos 1,00 m L (ver A n e x o O)
Vermelho de fenol- 0,018 g
Água destilada 1000 m L
p H final a p ó s esterilização 7,4
Pesar t o d o s os reagentes, exceto a solução t r a ç o s de elementos e acrescentar 1000 m L de
água destilada fiia. Aquecer, agitando freqüentemente até a completa dissolução dos reagentes,
t o m a n d o cuidado para n ã o atmgir a temperatma de ebuhção. Ajustar o p H para 7,4 com N a O H -
I N . Esterilizar em autoclave a 121 ± 2^C durante 15 mm. Estabilizar o meio a temperatiua de
450c a 5 0 ^ 0 e juntar 1,0 m L da solução de t r a ç o s de elementos estéril recentemente preparada.
Distribuir assepticamente, c o m agitação constante, em tubos de ensaio esterilizados. Armazenar
sob refrigeração p o r período máximo de duas semanas.
Para a elaboração do meio de concentração dupla, pesar o d o b r o de reagentes para o
m e s m o volume de meio de concentração simples.
115
M e i o líquido A T C C 238 a d a p t a d o para T.thioparus ( 0 , 5 % de tiossulfato de sódio)
KH2PO4 0,lg
NH4CI- 0,lg
MgCl2.6H20- 0,lg
CaCl2 0,lg
Na2S203.5H20- 5,0g
Água destilada lOOOmL
Pesar todos os c o n ç o s t o s , dissolvê-los separadamente, juntar as soluções e c o n ç l e t a r o
volume para 1000 mL com água destilada. Ajustar o p H c o m N a O H I N para 7,5 ± 0,2 Esterilizar
em autoclave a 121 ± 2^C durante 15 minutos. Armazemar e m geladeira por imi período máximo
de duas semanas.
Na2S203.5H20- 5,00 g
NH4CI- 1,00 g ^ K
K2HPO4 3,00g
CaCl2 0 , 1 0 g o!L
• MgS04.7H20 0,50 g k.
Solução traços de elementos- 1,00 m L (ver Anexo I)
Vermelho de f e n o l - 0,018 g
Verde de bromocresol 0,01 g
Água destilada 1000 m L
p H final após esterilização : 4,5
Proceder da mesma forma c o m o para o preparo d o meio hquido d e P o s t g a t e modificado
para T.thioparus, ajustar o p H para 4,5 c o m H2SO4 - ION.
116
Meio líquido A T C C 2 3 8 a d a p t a d o c o m 1 % de 8 «
KH2PO4 0,lg
NH4CL- 0,lg
MgCl2.6H20- 0,lg
CaCl2 0,lg
Enxofre elementar 10,0g
H2O destilada lOOOmL
Dissolver os sais separadamente e m água destilada e c o n ç l e t a r o volume até 1000 m L ,
ajustar o p H para 4,2 c o m H C l e esterilizar e m autoclave a 121 ± 2^C p o r 20 min.
Esterilizar separadamente o enxofre por tindaUzação ( 3 0 minutos e m vapor fluente
dtuante três dias consecutivos). Utilizar 1 g de enxofre para 100 m L de meio líquido.
Meio 9 K - S 0 (21)
Solução 1: (sais de base)
(NH4)2S04 3,00 g
KCl 0,10 g
K2HPO4 0,50 g
MgS04.7H20- 0,50 g
Ca(N03)2 0,01 g
H2SO4(10N)- 1,00 m L
Água destilada 1000 m L
p H final após esterilização : 2,8 a 3,0
Para o preparo desta solução, pesar os reagentes e acrescentar 1000 m L de água destilada
fiia. Ajustar o p H para 2,8 a 3,0.com H2SO4 -10 N. Dissolver os sais p o r aquecimento agitando
freqüentemente até a ebulição, evitar aquecimento excessivo. Esterilizar em autoclave a 121 ±
2^C durante 15 min. A p ó s a esterilização, estabilizar a temperatura para 5 5 ° C . Adicionar 1 g de
enxofre elementar, esterilizado separadamente por tindalização, para cada 100 ml de meio Hquido
da solução 1.
11
• Meios de cuitura para T ferrooxidans
M e i o h q u i d o 9K-re2+(21)
Sohição 2:
FeS04.7H20- 44,22 g í
Água destilada, qsp 300 m L
Pesar 44,22 g de sulfato ferroso, colocar e m u m balão voliunétrico d e 300 m L e
c o n ç l e t a r o volume c o m água destilada acidificada c o m H2SO4 - lON ( p H 2,8). Homogeneizar
até completa dissolução esterilizar p o r filtração em membrana com porosidade d e 0,22 p m
Preparo do meio 9K-Fe2+ : juntar 700 m L da solução 1 e 3 0 0 m L da s o l u ç ã o 2 com
t o d o s os cuidados de assepsia.
Solução A
(NH4)2 SO4 0,5g
K2HPO4 0,5g
MgS04.7H20 0,5g
H2O destilada lOOOmL
Solução B
FeS04.7H20 167g
H2O destilada 1 OOOmL
Dissolver separadamente o s sais referentes á solução A, juntar o s solutos, completar com
água destilada até 1000 mL, ajustar o p H para 1,8 c o m H2SO4 concentrado e autoclavar a 121 ±
2^C p o r 15 min. A solução B deve ser filtrada p o r membrana de 0,22 p m a p ó s o ajuste do p H
para 1,8 c o m com H2SO4 concentrado. A s soluções devem ser estocadas separadamente em
geladeira ( 4 ° C ) e no momento d o uso , utilizar uma proporção de 4:1 respectivamente da
solução A e B. Para de obter o meio sólido "TK" deve-se preparar o meio em concentração dupla
em u m frasco e uma solução de agarose 0 , 5 % em outro, esterilizando a agarose e m autoclave nas
condições da solução A. Misturar o conteúdo d o s dois frascos quando a m b o s estiverem a
aproximadamente SO^C e distribuir em placas de Petri préviamante esterilizadas.
118
• Meio de Starkey para bactérias suifato-redutoras {DesulfovibríoY^^^
Lactato de sódio 3,5 g
NH4CI- 1,0 g
K2HPO4 0,5 g
MgS04.7H2a 2,0 g
Na2S04 0,5 g
CaCl2.2H20- 0,1 g
(NH4)2SO4.FeSO4.6H20 0,001 g
Agua destilada 1000 m L
p H final após esterilização : 7,2
Pesar t o d o s o s reagentes e acrescentar 1000 m L de água destilada fiia. A q u e c e r , agitando
freqüentemente, até completa dissohiçã d o s sais, tomando cuidado para que n ã o seja atingida a
t e n ç e r a t u r a de ebulição. Ajustar o p H para 7,2 com N a O H - IN. Distribuir e m t u b o s de ensaio.
Esterilizar em autoclave a 121 ± 2 0 C p o r 15 min.
119
• Meios de cultura para os testes preliminares de identificação
para Thiobacillusf^^^^
Meio S 7
Adiconar 0,02 g Í*>ÍH4CNS em 1000 m L de meio mmeral básico S O . Esterlizar e m
autoclave a 121 ±2'^C durante 15 minutos.
Meio S O + 6 % d e tiossulfato
Adicionar 60 g de N a 2 S 2 O 5 H 2 0 a o s demais compostos da fórmula d o meio mineral
básico S O e completar o v o l u m e par 1000 m L de água destilada estéril. Esterhzar e m autoclave a
121 ±20C durante 15 minutos.
Meio S 6 ou S 5 + 4 % d e fosfato
Adicionar 4 0 g C a 3 ( P 0 4 ) 2 a o s demais componentes do meio S6 o u S 5 . Completar o
volume com água destilada a t é 1000 mL. Esterihzar em autoclave p o r 15 min a 121.±20C
Meio S6 ou S 5 + 5 % d e NaCl
Adicionar 50 g d e NaCl aos demais componentes do meio S6 o u S5. Completar o volume
com água destilada até 1000 mL. Esterilizar em autoclave por 15 min. a 121.±20C
120
COMISCtC KÍ,C:CK/L CE E N E R G I A N U C L E R I R / S P -
M e i o S 6 ou M e i o S 5 c o m enxofre elementar
M e i o sólido d e Citrato d e S i m m o n s
NaCl- 5,0 g
MgS04.7H20- 0,2 g
(NH4) H2PO4 1,0 g
K2HPO4 1,0 g
Citrato de sódio 2,0-5,0 g
Ágar- 20,0 g
Azul de bromotimol- 0,08 g (solução a 0 , 0 0 2 % )
Água destilada 1000 mL
Agar nutriente
Extrato de carne 3g
4 Peptona lOg
Agar 15g
Água destilada 1 OOOmL
Pesar os componentes e adicionar 1000 mL de água destilada. Ajustar o p H para 7,2 com
N a O H IN. Distribuir em t u b o s de ensaio e esterilizar por 15 minutos à temperatura de 121 ±
2 ° C . Manter os tubos inclinados até solidificação do meio.
121