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Proteómica

Proteómica Preparación robótica de muestras para espectrometría de masas MALDI-TOF Proteómica es el estudio a

Preparación robótica de muestras para espectrometría de masas MALDI-TOF

Proteómica es el estudio a gran escala de las proteínas, en particular de su estructura y función. [1][2] Las proteínas son partes vitales de los organismos vivos, ya que son los componentes principales de las rutas metabólicas de las células. El término proteómica fue acuñado en 1997 [3] como una analogía con genómica, el estudio de los ge- nes. La palabra “proteoma” es la fusión de "proteína” y “genoma", y fue acuñada por Marc Wilkins en 1994, mientras trabajaba en ese concepto como estudiante de doctorado. [4][5] El proteoma es la dotación completa de proteínas, [4] incluyendo las modificaciones hechas a un conjunto particular de proteínas, producidas por un or- ganismo o sistema. Esto varía con el tiempo y con requi- sitos diferentes, o debido al estrés, que sufre una célula o un organismo.

La descripción del proteoma permite tener una imagen dinámica de todas las proteínas expresadas, en un mo- mento dado y bajo determinadas condiciones concretas de tiempo y ambiente. El estudio y comparación siste- máticos del proteoma en diferentes situaciones metabóli- cas y/o patológicas permite identificar aquellas proteínas cuya presencia, ausencia o alteración se correlaciona con determinados estadios fisiológicos. En el caso concreto del análisis proteómico asociado a patologías concretas, es posible identificar proteínas que permitirían diagnosti- car la enfermedad o pronosticar la evolución de la misma. Dichas proteínas se conocen con el nombre genérico de biomarcadores. [6]

La proteómica es una ciencia relativamente reciente. Pa- ra su despegue definitivo, ha sido necesaria la consolida- ción definitiva de la espectrometría de masas como técni- ca aplicada al análisis de moléculas biológicas y el creci-

miento exponencial en el número de entradas correspon- dientes a genes y/o proteínas en las bases de datos. Esto, combinado con el empleo de potentes métodos de frac- cionamiento y separación de péptidos y proteínas como el 2D-PAGE [7] (electroforesis de poliacrilamida de dos di- mensiones) y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), ha permitido consolidar la proteómica, desde mediados de los años 90 del siglo pasado, como ciencia para el análisis masivo de proteínas.

1 Complejidad del problema

La proteómica es considerada el siguiente paso en el es- tudio de un sistema biológico, luego de la genómica. Es más complicada que la genómica porque mientras que el genoma de un organismo es más o menos constante, el proteoma difiere de una célula a otra y de un momen- to a otro. Estos se debe a que en los distintos tipos de células se expresan genes distintos, lo que implica que se debe determinar hasta el conjunto básico de proteínas producido en una célula.Un factor adicional de comple- jidad son las modificaciones que puede sufrir la estruc- tura o secuencia básica de la proteína, esto es, aquella que aparece codificada en el genoma. Dichas modifica- ciones provienen básicamente de dos fuentes: el recor- te o Splicing alternativo [8] de los ARNm que codifican la proteína y las modificaciones postraduccionales (fos- forilación, metilación, acetilación, etc) que normalmente sirven para modificar o modular la actividad, función o localización de una proteína en diferentes contextos fi- siológicos o metabólicos. Ambas fuentes de complejidad incrementan sustancialmente el número de proteínas di- ferentes que pueden existir: se estima que a partir de los 25 000-30 000 genes que codifican proteínas en el geno- ma humano, podrían generarse un número de proteínas diferentes que oscilaría entre 500 000-1 000 000.

En el pasado, el análisis de los genes que se expresaban en diferentes tipos de células y tejidos y en diferentes contextos fisiológicos era realizado principalmente me- diante un análisis de ARNm, pero se encontró que a me- nudo no existe una correlación directa entre el conteni- do en ARNm y el contenido proteico. [9][10] Se sabe que el ARNm no siempre se traduce a proteína, [11] y que la cantidad de proteína producida por una cantidad dada de ARNm depende del estado fisiológico de la célula. No obstante, estudios recientes han confirmado que, al me- nos en levadura, existe una alta correlación entre el nú- mero de copias de ARNm y el de moléculas de proteína

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2 ÁREAS DE ESTUDIO

traducidas a partir de aquél. [12] Las técnicas proteómicas actuales permiten confirmar la presencia o ausencia de una o más proteínas concretas y determinar su cantidad, bien en valores absolutos o relativos [13]

2 Áreas de estudio

Las principales áreas de estudio de la proteómica son:

1. Identificación de proteínas y caracterización de sus modificaciones postraducionales

2. Proteómica de “expresión diferencial”

3. Estudio de las interacciones proteína-proteína

2.1 Separación de proteínas

La enorme complejidad (varios miles de proteínas dife- rentes) del proteoma de la mayor parte de los organismos vivos obliga al empleo de diversas técnicas para separar las proteínas. Entre las técnicas más comunes se encuen- tran la electroforesis mono y bidimensional así como la cromatografía líquida en sus distintas variantes.

La técnica más extendida es la electroforesis en geles de poliacrilamida (llamada SDS-PAGE por sus siglas en in- glés “Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Elec- trophoresis”). Se trata de una electroforesis en gel de poli- acrilamida al que se le añade el detergente dodecilsulfato sódico con el fin de desnaturalizar las proteínas, asegu- rar que todas se encuentren cargadas y por tanto puedan migrar en un campo eléctrico en función de su masa mo- lecular relativa (Mr). Una variante de este tipo de elec- troforesis es la electroforesis bidimensional o 2D-PAGE, en la que el fraccionamiento en geles SDS-PAGE es pre- cedido por una separación basada en el punto isoeléctri- co de las proteínas. La electroforesis 2D-PAGE permi- te alcanzar una mayor resolución y es por tanto utiliza- da en el análisis de proteomas muy complejos. Una vez realizado el fraccionamiento, distintos métodos de tin- ción (Azul Coomassie, tinción de plata, tinción Sypro Ru- bi, etc) permiten visualizar las proteínas separadas. La cromatografía líquida también se emplea en el fracciona- miento y separación de proteomas complejos. Las distin- tas variantes existentes permiten separar las proteínas en función de su hidrofobicidad (cromatografía de fase re- versa), carga eléctrica (cromatografía de intercambio ca- tiónico/aniónico) y tamaño (cromatografía de exclusión molecular).

2.2 Identificación de proteínas

2.2.1 Degradación de Edman

2.2.2 Espectrometría de masas

La espectrometría de masas (MS) permite analizar la composición de diferentes elementos químicos e isótopos atómicos, separando los núcleos por su relación masa- carga. Presenta numerosas ventajas frente al método de Edman: es más sensible, permite analizar directamente las mezclas proteicas y ofrece un mayor rendimiento por muestra. Por ello, es el método utilizado en las dos técni- cas de identificación de proteínas más comunes: la iden- tificación por huella peptídica y el análisis MS/MS.

Identificación por huella peptídica

Digestión en gel: Normalmente, la muestra se redu- ce y alquila. A continuación, se añade una protea- sa con una patrón de corte conocido (típicamente, tripsina), generándose una colección o conjunto de péptidos específicos de proteína. Habitualmente, es- ta colección de péptidos será lo suficientemente es- pecífica como para poder identificar la proteína con la que estamos trabajando.

Extracción de los péptidos

Análisis MS MALDI-TOF: este equipo traduce el tiempo de vuelo en masas, pues aunque todos los iones tienen la misma estructura y la misma carga, su peso es distinto.

Comparación del espectro de masas con la informa- ción almacenada en bases de datos de secuencias conocidas, como Swiss-Prot o nr-GenBank. Para ello existen motores de búsqueda como MASCOT que ordenan las proteínas identificadas asignándoles puntos en función del número de coincidencias.

Análisis MS/MS

Digestión solución

Extracción de los péptidos

Espectrometría de masas de ionización por electros- pray

La comparación de los datos del espectro de frag- mentación experimental con los almacenados en ba- ses de datos es similar al llevado a cabo en la identi- ficación por huella peptídica: las coincidencias entre los datos experimentales y los datos del servidor se muestran en orden decreciente de probabilidad.

Para evaluar la identificación de la proteína se ha de te- ner en cuenta su presencia en las bases de datos, maximi- zar la asignación de fragmentos generados y comprobar

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si las características de la proteína identificada y la pro- teína problema coinciden. No obstante, para mejorar la precisión de la identificación es recomendable repetir va- rias veces el proceso de identificación del péptido, para disponer así de varios espectros de fragmentación.

2.3 Interacciones proteína-proteína

La mayoría de las proteínas funcionan en colaboración con otras proteínas, y una meta de la proteómica es iden- tificar cuales proteínas interactúan entre sí. Esto es espe- cialmente útil para determinar asociaciones potenciales en las rutas de señalización celular.

Se dispone de varios métodos para probar las inter- acciones proteína-proteína. El método tradicional es el sistema de doble híbrido de la levadura. Los métodos nuevos incluyen microarrays de proteína, cromatografía de inmunoafinidad seguida por espectrometría de masas, interferometría de doble polarización y métodos experi- mentales como phage display y métodos computaciona- les.

3 Véase también

3.1 Bases de datos de proteínas

Proteopedia The collaborative, 3D encyclopedia of proteins and other molecules

3.2 Centros de investigación

4 Referencias

[1] Anderson NL, Anderson NG (1998). «Proteome and proteomics: new technologies, new concepts, and new words». Electrophoresis 19 (11): 1853-61. doi:10.1002/elps.1150191103. PMID 9740045.

[2] Blackstock WP, Weir MP (1999). «Proteomics: quan- titative and physical mapping of cellular proteins». Trends Biotechnol. 17 (3): 121-7. doi:10.1016/S0167- 7799(98)01245-1. PMID 10189717.

[3] P. James (1997). «Protein identification in the post-genome era: the rapid rise of proteomics.». Quarterly reviews of biophysics 30 (4): 279-331. doi:10.1017/S0033583597003399. PMID 9634650.

[4] Marc R. Wilkins, Christian Pasquali, Ron D. Appel, Ke- li Ou, Olivier Golaz, Jean-Charles Sanchez, Jun X. Yan, Andrew. A. Gooley, Graham Hughes, Ian Humphery- Smith, Keith L. Williams & Denis F. Hochstrasser (1996). «From Proteins to Proteomes: Large Scale Protein Iden- tification by Two-Dimensional Electrophoresis and Ar- nino Acid Analysis». Nature Biotechnology 14 (1): 61-65. doi:10.1038/nbt0196-61. PMID 9636313.

[6] Hanash SM, Pitteri SJ, Faca VM. Mining the plas- ma proteome for cancer biomarkers. Nature. 2008 Apr 3;452(7187):571-9. Review. PubMed PMID 18385731.

[7] Weiss W, Görg A. High-resolution two-dimensional elec- trophoresis. Methods Mol Biol. 2009;564:13-32. PubMed PMID 19544015.

[8] Keren H, Lev-Maor G, Ast G. Alternative splicing and evolution: diversification, exon definition and function. Nat Rev Genet. 2010 May;11(5):345-55. Epub 2010 Apr 8. Review. PubMed PMID 20376054.

[9] Simon Rogers, Mark Girolami, Walter Kolch, Katrina

M. Waters, Tao Liu, Brian Thrall and H. Steven Wiley

(2008). «Investigating the correspondence between trans- criptomic and proteomic expression profiles using coupled cluster models». Bioinformatics 24 (24): 2894-2900. doi:10.1093/bioinformatics/btn553. PMID 18974169.

[10] Vikas Dhingraa, Mukta Gupta, Tracy Andacht and Zhen F. Fu (2005). «New frontiers in proteomics research: A perspective». International Journal of Pharmaceutics 299 (1–2): 1-18. doi:10.1016/j.ijpharm.2005.04.010. PMID

[11] Buckingham, Steven (mayo de 2003). «The major world of microRNAs». Consultado el 14 de enero de 2009.

[12] Picotti P, Bodenmiller B, Mueller LN, Domon B, Ae- bersold R. Full dynamic range proteome analysis of

S. cerevisiae by targeted proteomics. Cell. 2009 Aug

21;138(4):795-806.

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6 Origen del texto y las imágenes, colaboradores y licencias

6.1 Texto

Proteómica Fuente: https://es.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%B3mica?oldid=91512051 Colaboradores: Llull~eswiki, Joseaperez, Moriel, Rafael Soriano, Dionisio, Nina Gerlach, Sms, LeonardoRob0t, Airunp, RobotQuistnix, BOTijo, YurikBot, Wiki-Bot, GermanX, KnightRi- der, Eskimbot, Maldoror, Rdominguez, CEM-bot, Retama, Carlatf, RickPol, Resped, Thijs!bot, Lauranrg, Lasai, Dav7mx, AlleborgoBot, Feministo, PaintBot, Ignacio Marin, Nubecosmica, Furado, Greek, Ficbot, DragonBot, Petruss, Alexbot, AVBOT, LucienBOT, MastiBot, NjardarBot, MelancholieBot, Luckas-bot, SuperBraulio13, Jkbw, Yabama, Ainoa afis, Aparadela, EmausBot, ZéroBot, ChessBOT, Grilli- tus, ChuispastonBot, XanaG, MetroBot, Invadibot, Elvisor, JYBot, Edelatorrev, Legobot, David P Minde, Lagoset, BenjaBot, GünniX y Anónimos: 20

6.2 Imágenes

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6.3 Licencia del contenido