Vous êtes sur la page 1sur 20

Para mejorar el rendimiento y la productividad de la producción de metabolitos, los investigadores

se han centrado casi exclusivamente en la amplificación de enzimas u otras modificaciones de

La vía del producto. Sin embargo, la sobreproducción de muchos

los metabolitos requieren una redirección significativa de las distribuciones de flujo en el


metabolismo primario, que puede no ser fácilmente

ocurren después de la desregulación del producto porque metabólica

Las vías han evolucionado para exhibir arquitecturas de control.

que resisten las alteraciones del flujo en los puntos de ramificación. Este problema

pueden abordarse mediante el uso de algunos conceptos generales de la rigidez metabólica, que
incluyen un medio para

identificar y eliminar puntos de ramificación rígidos dentro de una

marco experimental.

TODOS LOS ORGANISMOS UTILIZAN VÍAS METABÓLICAS PRIMARIAS A

suministrar metabolitos y energía precursores a las vías anabólicas que sintetizan los
constituyentes celulares que son necesarios

Para el crecimiento y mantenimiento. En muchas cepas industriales de microorganismos (así como


en cultivos de tejidos y plantas), estos anabólicos

Se han explotado vías para la sobreproducción de compuestos.

(tales como aminoácidos y ácidos nucleicos, antibióticos, vitaminas, enzimas y

proteínas) que no pueden ser producidas sintéticamente o para las cuales no es

Económico de hacerlo. En general, un metabolito particular se produce en exceso al desregular la


vía directamente asociada con la

síntesis de ese metabolito, o, más recientemente, mediante la transformación de un

organismo huésped robusto (típicamente Escherichia coli) con los genes que

codificar para la síntesis del producto deseado (1, 2). Esta

El enfoque, sin embargo, no necesariamente resulta en un alto producto

rendimientos (definidos como los moles de producto formado por mol de sustrato)

consumido) desde distribuciones de flujo de carbono en puntos de ramificación clave

(nodos) en el metabolismo primario [como la glucólisis, tricarboxílico

ciclo ácido (TCA), y vía de fosfato de pentosa] a menudo deben ser

redirigido radicalmente de las distribuciones de flujo que normalmente son


Asociado a un crecimiento equilibrado. Tales alteraciones del flujo metabólico son

A menudo se opone directamente a los mecanismos para controlar la enzima.

Actividad que ha evolucionado para mantener las distribuciones de flujo que son

Optima para el crecimiento. Nos referimos a esta resistencia inherente al flujo.

alteraciones como la rigidez metabólica o de la red y la genética.

Modificaciones de nodos específicos en el metabolismo primario para la

propósito de mejorar el rendimiento y la productividad como ingeniería metabólica (3). Si bien las
manipulaciones genéticas ahora se pueden realizar fácilmente, hay relativamente pocas cuentas
de flujo metabólico exitoso

Alteraciones debido a la naturaleza compleja y no lineal de las arquitecturas de control


metabólico.

La naturaleza y los tipos de rigidez metabólica se revisan en este

artículo junto con métodos para identificar y posiblemente burlar tales

Controles nodales indeseables. La sobreproducción de lisina por Corynebacterium glutamicum [y


las cepas relacionadas (4)] se utiliza como vehículo para

Ilustrar puntos clave debido a: (i) la falta de compartimentación

en las bacterias; (ii) la necesidad de alteraciones de flujo significativas para optimizar

biosíntesis de lisina; y (iii) el aparente éxito marginal de

técnicas de selección de mutaciones (5, 6) o ingeniería genética (7) utilizadas

Con ese fin. Los conceptos, sin embargo, son de valor general, y la

Los métodos son aplicables a otros productos metabólicos también.

Bases de la rigidez metabólica

Aunque las concentraciones de metabolitos intracelulares pueden fluctuar

Durante el crecimiento, en promedio, las distribuciones de los principales celulares

grupos (proteínas, ARN, ADN, lípidos, etc.) permanecen relativamente

Proporcional entre sí a lo largo de un crecimiento equilibrado (8). En

De hecho, los metabolitos y la energía necesarios para sintetizar una célula de E. coth.

se han calculado sobre la base de su composición conocida (9). En

Para preservar esta regularidad en la composición celular, la principal


El metabolismo ha evolucionado la coordinación del control de la vía, de modo que

metabolitos de bloques de construcción, energía [como el trifosfato de adenosina

(ATP)], y el poder reductor biosintético [como la nicotinamida

adenina dinucleótido fosfato (NADPH)] se sintetizan en

Razones estequiométricas aproximadas durante el crecimiento equilibrado. Alabama

aunque el metabolismo celular puede soportar un flujo radicalmente diferente

Distribuciones en respuesta a diferentes estímulos ambientales (10).

Tales alteraciones de flujo son una consecuencia de las retroalimentaciones metabólicas.

Que controlan la síntesis óptima de los principales grupos celulares.

Requerido para la supervivencia de la célula.

Dado que el metabolismo primario está coordinado para sintetizar un

Distribución uniforme de los metabolitos de bloques de construcción y energía, es

no es adecuado para la sobreproducción de cualquier metabolito individual.

En consecuencia, si la sobreproducción de un metabolito particular exige

Alteraciones significativas del flujo en el metabolismo primario en comparación con

Las distribuciones de flujo observadas bajo crecimiento equilibrado, luego simples.

La desregulación de la inhibición de la retroalimentación del producto frecuentemente resulta en

Los rendimientos de los productos son significativamente menores que los teóricos. Un ejemplo

de los efectos que la sobreproducción de un metabolito puede provocar en

las distribuciones de flujo metabólico se muestran en los diagramas de flujo de la Fig. 1,

que representan la sobreproducción de lisina por C. glutamicum ATCC

21253 bajo cargas metabólicas variables. Las distribuciones de flujo que

apoyar la producción de lisina en los rendimientos típicamente observados (30 a 40%

rendimiento molar) (11) (Fig. 1B) no se desvían significativamente del flujo

Distribuciones que soportan un crecimiento equilibrado (Fig. 1A). sin embargo, el

distribuciones de flujo requeridas para soportar el rendimiento máximo de lisina (Fig.

1C) representan una divergencia significativa de las distribuciones de flujo

que ocurren durante el crecimiento equilibrado o la producción típica de lisina


condiciones Si el metabolismo primario pudiera cambiar fácilmente para coincidir con la síntesis
de lisina

demandas, entonces se podrían obtener mejoras significativas de rendimiento por

simplemente bloqueando los caminos que conducen a los subproductos, como el

complejo de piruvato deshidrogenasa (PDC) que conduce al TCA

ciclo. Sin embargo, tales intentos no han dado como resultado un rendimiento significativo.

mejoras (5, 6), lo que indica que la red metabólica

No responde fácilmente a las exigencias de tales perturbaciones.

Desde la modificación del metabolismo primario para redireccionar.

Los flujos en apoyo del rendimiento máximo del producto es el objetivo de

ingeniería metabólica, las fuentes de rigidez metabólica deben ser

identificado.

Nodos principales

A menudo se asume que un rendimiento de producto pobre resulta de una enzima

o enzimas en una secuencia de reacción que limitan el rendimiento al

producto. Aunque la actividad enzimática global a lo largo del producto

La rama ciertamente gobierna la tasa de síntesis del producto, el rendimiento del producto es

En última instancia, una función de partición de flujo que se produce en intermedio

puntos de ramificación. Los últimos, también denominados nodos, son puntos en un

red metabólica donde una secuencia de reacción se bifurca entre dos

o más caminos diferentes. Desde las vías que sintetizan.

los metabolitos primarios generalmente pueden soportar flujos sustanciales, los esfuerzos de
ingeniería metabólica deben dirigirse hacia la alteración del flujo

partición en puntos de rama metabólica seleccionados para mejorar el producto

rendimiento.

Una importante realización en el análisis de redes metabólicas es

ese rendimiento del producto depende típicamente de la partición de flujo que

ocurre solo en un pequeño subconjunto de todos los nodos posibles que comprenden el

Red metabólica. Identificación de estos nodos, denominados


nodos principales, se logra buscando esos nodos en el

Red metabólica donde los cambios significativos en la partición de flujo

Ocurren en función del rendimiento del producto. Distribuciones de flujo requeridas para

Este análisis puede determinarse a partir de restricciones de balance de metabolitos.

con o sin (como en la Fig. 1) el uso de datos experimentales (ver

abajo). El ejemplo de la lisina ilustra el punto. De -30 sucursales

Puntos en la red biosintética de lisina, cambios significativos en el flujo.

la partición ocurre en solo tres nodos, glucosa-6-fosfato (G6P),

Fosfoenolpiruvato (PEP) y piruvato (Pyr), como rendimiento de lisina.

aumenta del 35% (Fig. 1B) al 75% (Fig. 1C). Inspección cercana de

el punto de ramificación de oxaloacetato (OaA) revela que es un trivial

nodo principal (12) ya que todos los OaA sintetizados a partir de PEP

Se condensa con Pyr para formar lisina. La OaA sintetizada a través de

La malato deshidrogenasa es consumida por la citrato sintasa, por lo que

La producción de OaA se produce solo a través de la reacción de PEP carboxilasa anaplerótica (10).
El nodo de fructosa-6-fosfato (F6P) también puede

Ser descartado como nodo principal. Para un rendimiento de lisina inferior al 60%,

El nodo F6P es simplemente un punto de condensación; sin embargo, para rendimientos

superior al 60%, F6P se convierte en un nodo principal y G6P se convierte en

Un punto de condensación (Fig. 1C). Este cambio se debe a la pentosa.

vía de fosfato, que debe funcionar de manera cíclica para cumplir

Los requisitos de NADPH cuando el rendimiento de lisina supera el 60%. Dado que los
rendimientos de lisina observados típicamente son del 30 al 40%, las modificaciones metabólicas

solo necesita apuntar a los nodos principales G6P, PEP y Pyr. Por lo tanto

los esfuerzos de ingeniería metabólica solo necesitan centrarse en estos tres nodos

y no en toda la red, lo que reduce drásticamente el problema

complejidad. La dualidad de los nodos G6P y F6P también ilustra

El punto en que la ubicación de los nodos principales depende de la


producto bajo investigación, el sustrato utilizado y los subproductos que típicamente están
asociados con el producto. La disposición de conectividad de los nodos principales en la red
también es una

Importante consideración.

En general, las arquitecturas de red se dividen en dos clases básicas:

Dependiente e independiente. Si cada nodo principal de una red, o

Subred, aporta un componente consumido estequiométricamente.

del producto final, entonces la red o subred se considera

dependiente (Fig. 2A), como en la red de lisina (NADPH, OaA,

y Pyr son todos los precursores de lisina). En tales redes, el flujo en todas

Las ramas de condensación deben estar estequiométricamente equilibradas para prevenir

acumulación o excreción de componentes intracelulares (por ejemplo,

la partición de flujo en los nodos 1 y 2 de la Fig. 2A debe ser igual). Debajo

esta restricción, la división del flujo en todos los nodos principales que comprenden

una red dependiente debe ser coordinada, y todos los nodos principales

debe considerarse de igual importancia, independientemente de su "lejanía" del producto de


interés. Por el contrario, si los metabolitos

producidos a partir de los nodos principales no se condensan (Fig. 2B), entonces

La red se considera independiente, y el rendimiento del producto puede ser

mejorado al alterar la partición de flujo que se produce en un solo

nodo principal En la red simple de dos nodos (Fig. 2B), el rendimiento

del producto deseado P puede mejorarse si la partición de flujo en

se modifica el nodo 1 o el 2 para favorecer la síntesis de P, mientras que en el

Red dependiente, la partición de flujo en ambos nodos debe ser alterada.

Aunque la arquitectura de la red afecta la respuesta metabólica a

modificaciones enzimáticas, tanto en redes dependientes como independientes, el grado de


rigidez metabólica reside finalmente en el

Facilidad por la cual se puede alterar la partición de flujo en los nodos principales.

para obtener una distribución de flujo que sea óptima para la formación del producto.

Dado que el tipo de rigidez nodal dicta los tipos de metabolismo


modificaciones requeridas para hacer el nodo rígido flexible, factores que

Se debe examinar la partición del flujo nodal de influencia.

Clasificaciones de puntos de ramificación

Las estructuras de control metabólico utilizadas por diferentes organismos para

Los flujos de regulación de vías varían notablemente (13). Es, sin embargo,

posible clasificar estas estructuras de control en tres

Las categorías en función de la rigidez de sus puntos de ramificación. En el

La discusión que sigue, cinética de la rama se refiere a la respuesta concentrada de todas las
enzimas que constituyen la rama, y la

relación de división de rama se refiere al flujo de carbono canalizado a través de ese

Ramificación normalizada por el flujo hacia el nodo.

Nodos donde la división de flujo en cada rama cambia fácilmente a

Satisfacer las demandas metabólicas se denominan nodos flexibles. en un

Nodo flexible, enzimas que participan en cada rama muestran similares

afinidad por el metabolito del nodo, y las velocidades de reacción de cada uno

Las ramas son de magnitud similar. El flujo a través de cada rama es

Controlado por inhibición de retroalimentación por el terminal correspondiente.

metabolito (fig. 3a). Como resultado, la relación de división de la rama puede cambiar

De cero a uno para satisfacer las demandas del terminal.

metabolitos Por ejemplo, si la inhibición de la retroalimentación por el metabolito P

(Fig. 3A) se elimina, o si P (pero no el subproducto B) es un precursor

a un producto deseado, la relación de división de la rama P se acercaría

La unidad como el rendimiento del producto se maximiza. Muchos ramal terminal

Los puntos en la biosíntesis de aminoácidos exhiben tal flexibilidad (14). por

Por ejemplo, el flujo en el punto de ramificación del semialdehído aspartato puede

ser completamente redirigido hacia la síntesis de lisina mediante la desregulación de la

inhibición concertada de la aspartoquinasa por la lisina más treonina (15). Los nodos flexibles son
los más susceptibles de alteraciones de

Distribuciones de flujo de ramificación y rara vez requieren modificación. Quizás

Debido a esto, muchas modificaciones metabólicas pretenden mejorar


el rendimiento del producto asume los nodos principales (de ahí la red) a ser

Flexible, algo que no se puede esperar que sea en general cierto.

Se dice que un nodo es débilmente rígido si la división del flujo en el

El nodo está dominado por la cinética de una de sus ramas. Esto puede ser

El resultado de una alta actividad enzimática o una alta afinidad enzimática para

El metabolito del nodo y la falta de inhibición offeedback en el dominante

rama (fig. 3b). Incluso si la rama subordinada (producto) es

desregulado (o una alta demanda se coloca en P), una fracción significativa

Del flujo todavía entra la rama dominante y limita el rendimiento del producto.

El rendimiento del producto todavía puede mejorarse, sin embargo, atenuando el

Actividad de la rama dominante. Esto puede tener que ser acompañado

Amplificación por actividad de la rama subordinada o producto final.

Desregulación para evitar la acumulación del punto de ramificación.

intermedio (N). Sin embargo, los nodos débilmente rígidos son típicamente

susceptible de técnicas de selección de mutaciones.

Los nodos débilmente rígidos se encuentran a menudo en las vías catabólicas que conducen

a la formación de CO2. Un ejemplo es el punto de ramificación isocitrato en E.

coli entre la derivación de glioxilato y el ciclo de TCA. Cuando la glucosa

se agrega a un cultivo de E. coli cultivado en acetato, el flujo soportado por

isocitrato liasa (ICL), la primera enzima de la derivación de glioxilato, gotas

a cero aunque la derivación de glioxilato está completamente activa (16).

En estas condiciones, ciclo de TCA isocitrato deshidrogenasa.

(ICDH) exhibe dominio completo sobre ICL desde el Michaelis

la Km constante de ICDH para isocitrato es 1/75 la de ICL, y ambos

Las enzimas exhiben actividad similar (16-18). Sin embargo, si la actividad de

ICDH se atenúa en un 60% o más, una fracción significativa de la

El isocitrato sintetizado se desvía hacia la derivación de glioxilato (16-19).

En E. coli, la actividad de ICDH se atenúa por la fosforilación, de modo que

El crecimiento en acetato puede ser sostenido.


Se dice que un nodo es fuertemente rígido si la relación de división de uno o más

De sus ramas está estrechamente controlada. Esto se logra comúnmente por un

Combinación de control de retroalimentación y transactivación de enzimas por una

metabolito en una rama opuesta (fig. 3C). En este caso particular,

Además de inhibir su propia síntesis, también actúan los metabolitos P y B.

como efectores positivos de la rama opuesta, una propiedad exhibida por

Muchas enzimas alostéricas (20). Esta arquitectura efectivamente estabiliza

la partición de flujo en el nodo, siempre que las concentraciones en estado estacionario de P y B


sean lo suficientemente altas para inhibir su propia síntesis

en ausencia de sus correspondientes activadores de rama, B y P.

respectivamente (21). Por ejemplo, si el flujo a través de la rama B es

atenuado como medio para aumentar la relación de división de la rama P, el

La tasa de síntesis de P también se atenuaría debido a la pérdida de

Activación por B y dominancia del producto final restante.

inhibición por P, dejando las relaciones de división de cada rama en forma relativa

inafectado. Curiosamente, las simulaciones indican que otras modificaciones nodales, como el
aumento de la demanda de P (por afinidad o

modulación de la actividad), eliminando la retroalimentación inhibitoria de P, o

el bloqueo de la demanda de B. tiene poco efecto en la relación de división de la

P rama también. Debido a la naturaleza hipotética de este ejemplo,

Los detalles de estas modificaciones no son discutidos. Sin embargo,

Varios ejemplos de nodos rígidos han sido documentados previamente.

En Bacillus subtilis, la histidina activa la antranilato sintetasa, una

enzima necesaria para la síntesis de triptófano (22). Esta activacion por

La histidina permite que B. subtilis crezca en presencia de 5-metiltriptófano, un antimetabolito del


triptófano. Además, la adición de histidina aumenta la excreción de triptófano en un factor de 4 en

Cepas mutantes que expresan antranilato sintetasa de forma constitutiva. Eso

Se plantea la hipótesis de que esta transactivación, que los investigadores

denominado "bloqueo metabólico", ha evolucionado para controlar el nivel

de 5-fosforibosil-1-pirofosfato, un metabolito que es común


A la síntesis de ambos aminoácidos. Este tipo de interacción vía también se ha denominado
control compensatorio o activación.

(14, 23, 24). Los efectores remotos también influyen en la biosyn de fenilalanina

Tesis mediante la modulación de la profenato deshidratasa en ambas corineformas

bacterias y B. subtilis (25). En lo que respecta al metabolismo primario,

Se han identificado interacciones de acoplamiento significativas entre las vías anapleróticas (PEP y
Pyr carboxilasas) y la catabólica.

Vías de glucólisis y ciclo del TCA (24, 26). En general, el flujo.

la partición en nodos fuertemente rígidos no se puede modificar fácilmente ya que

La cinética de las enzimas asociadas con el punto de ramificación puede

requieren modificaciones específicas, tales como alteraciones en efector y

Afinidades del sustrato.

Respuestas de red

La presencia de un nodo rígido (fuerte o débil) en un

red metabólica puede tener profundas implicaciones con respecto a

El resultado de las perturbaciones destinadas a mejorar el rendimiento del producto.

Considere nuevamente la red independiente simple (Fig. 2B), donde

Aumentar el rendimiento de P es el objetivo deseado. Se supone además que

el nodo 1 es flexible, el nodo 2 es muy rígido y B1 no lo hace

Inhibir su propia síntesis. Si la rama B1 está bloqueada, el rendimiento de P

se incrementaría; sin embargo, si la rama B2 está bloqueada, el rendimiento

de P en realidad disminuiría debido a la rigidez del nodo 2. Este

Se produce debido a la atenuación del flujo a través de la rama B2.

una disminución en el flujo a la rama del producto (debido a la rigidez del nodo 2).

Como el nodo 1 es flexible, el flujo al nodo 2 se desviaría a B1,

disminuyendo así el rendimiento de P. Si la arquitectura se invierte, entonces

ese nodo 1 es rígido pero el nodo 2 es flexible, luego bloquea la síntesis B2

mejoraría el rendimiento de P. Sin embargo, si se bloquea la síntesis B1,

el rendimiento de P no se vería afectado mientras que la tasa de síntesis de P

Sería severamente atenuado.


La rigidez nodal en redes dependientes presenta aún mayor.

Problemas en ingeniería metabólica. Por ejemplo, si el nodo 1 o

El nodo 2 en la red dependiente simple (Fig. 2A) es rígido, entonces

la atenuación de la síntesis de B1 no afectaría el rendimiento de P. pero

causaría que su tasa de síntesis disminuyera en la misma medida que

Síntesis B1. Por lo tanto, las modificaciones destinadas a mejorar las distribuciones de flujo en las
redes dependientes a menudo dan como resultado un metabolismo global.

colapso (o excreción de metabolitos intermedios). En un dependiente

red, la respuesta de la distribución de flujo es independiente de la ubicación de

La rigidez desde las alteraciones en la partición de flujo en todos los nodos principales.

debe coordinarse si se desea mejorar el rendimiento del producto.

Las redes metabólicas no siempre muestran la respuesta binaria a

perturbaciones de flujo implicadas por las clasificaciones anteriores debido a la

Diversas arquitecturas de control y cinética de enzimas asociadas.

con puntos de ramificación. Así, la atenuación de una rama de un fuerte

nodo rígido solo puede resultar en una atenuación parcial de la competencia

Rama, para que pueda lograrse alguna mejora en el rendimiento del producto.

En una red dependiente que alberga un nodo rígido. Además, atenuando.

Las vías no deseables pueden causar la excreción de metabolitos intermedios en lugar del colapso
del flujo metabólico o la redirección del flujo. Finalmente al igual que con la ubicación de los nodos
principales, el estado de una rama

El punto (es decir, si es flexible o rígido) puede depender del producto

bajo investigación. Por ejemplo, si un nodo consiste en los dos

ramas, A - B + C y A -> D, donde B y D (pero no C)

inhibir su propia síntesis, entonces el nodo parecería ser

Flexible a los productos que consumen B o D, pero débilmente rígido a

productos que requieren solo C. En cualquier caso, el grado de rigidez de

Los nodos principales en una red deben evaluarse primero antes de

Se pueden sugerir modificaciones metabólicas.

Evaluación de la rigidez del nodo principal


Una vez que los nodos principales para el producto de interés han sido

identificados en la red metabólica, su grado de rigidez debe ser

juzgado. Existen varias técnicas para analizar el metabolismo.

Redes, todas con sus propias ventajas y desventajas pero ninguna.

completamente comprensivo Si hay disponibles expresiones cinéticas detalladas para todas las
enzimas incluidas en la representación de la red de

La bioquímica del organismo, luego un modelo matemático de la

Se puede construir un metabolismo, como los desarrollados para la glucólisis y la respiración (27,
28) y para los eritrocitos (29). Con la ayuda

de dichos modelos, se realizan simulaciones de la red metabólica o subred para evaluar la rigidez
de los nodos principales mediante

comparando las distribuciones de flujo de estado estable para el caso nominal a

Los generados desde la misma red tras una perturbación.

destinados a mejorar el rendimiento del producto (es decir, la alteración de un

relación de división del nodo), como la eliminación de enzimas o la desregulación. Las sugerencias
para alteraciones metabólicas se basan entonces en el tipo de

Nodos principales identificados (fig. 3). Aunque estas perturbaciones

Las técnicas se rigen por ensayo y error, son bastante informativas, ya que los modelos incorporan
la naturaleza no lineal completa de

Redes metabólicas. La desventaja obvia de la simulación basada

Técnicas de evaluación es que la información cinética detallada es limitada.

y, cuando esté disponible, su aplicabilidad a situaciones in vivo no fácilmente

establecido.

Otros enfoques relacionados, como la teoría del control metabólico.

(MCT) (30) o teoría de sistemas bioquímicos (BST) (31), tienen

recibió amplia atención (2, 32); sin embargo, su valor para dirigir los esfuerzos de ingeniería
metabólica sigue siendo cuestionable (33). Ambos

Las técnicas se basan en aproximarse al sistema metabólico real.

(suponiendo que la cinética de la enzima esté disponible) alrededor de un punto de operación


particular, de modo que la sensibilidad de los flujos de estado estable pueda ser

Evaluado con respecto a las perturbaciones en las velocidades enzimáticas. Los


Los resultados de este análisis de sensibilidad a su vez proporcionan la base para

sugiriendo diversas modificaciones metabólicas. Un gran inconveniente de

Estos métodos son que son válidos solo en el barrio local.

del punto de operación evaluado. Sin embargo, el objetivo en el metabolismo.

la ingeniería es modificar el metabolismo primario de modo que el resultado

Las distribuciones de flujo (como en la Fig. 1C) difieren radicalmente de las observadas

durante el crecimiento (como en la Fig. LA). Además, enzimas con grandes

Los coeficientes de control de flujo (30) no son siempre los que deben modificarse,

especialmente si están involucrados en bucles de control de retroalimentación. por

Por ejemplo, en una secuencia de reacciones con un circuito de retroalimentación simple, el

La enzima que consume el metabolito de retroalimentación controla fuertemente la

flujo. Sin embargo, generalmente es la eliminación del circuito de retroalimentación lo que

Debe considerarse, no la amplificación de la actividad de las enzimas que

consumir el metabolito de retroalimentación. Sin embargo, MCT, BST, y

Las técnicas de análisis relacionadas (34) siguen siendo herramientas útiles en el análisis de

Redes metabólicas.

Cuando la cinética enzimática no está disponible o está incompleta, el metabolismo

Las distribuciones de flujo se pueden obtener aplicando estequiométricamente

limitaciones derivadas del balance de masa a los datos experimentales sobre las tasas de

Acumulación o agotamiento de metabolitos extracelulares. Nosotros (35-37)

así como otros (19, 38, 39), han utilizado este método para determinar

Los flujos metabólicos en diferentes condiciones y durante diferentes

fases de la cultura. Obviamente hay un límite en la medida en que la

La estructura de una red bioquímica se puede delinear usando

solo mediciones extracelulares (40), y el uso de radiactivos (16,

41) o trazadores de isótopos estables (42) pueden mejorar el poder de este

enfoque. Sin embargo, tales mediciones de trazadores deben hacerse en

Además de las medidas extracelulares habituales tomadas en el curso.

de una fermentación si la red metabólica y sus distribuciones de flujo


Hay que aclarar más. La aplicación de balances de masa también puede

producir distribuciones de flujo para una carga metabólica específica (como en

Fig. 1, A y B), así como estimar el rendimiento teórico máximo

para un producto (como en la Fig. 1C) pero no se puede utilizar para predecir el flujo

Respuestas a las perturbaciones metabólicas. Sin embargo, en conjunto con

perturbaciones experimentales, las estimaciones de distribución de flujo a menudo pueden ser

utilizado para identificar la fuente o fuentes de rigidez metabólica, como

descrito abajo.

El grado en que la división del flujo en un nodo principal limita

El rendimiento del producto se puede evaluar perturbando experimentalmente una rama.

que es proximal al nodo principal bajo investigación y

comparando las distribuciones de flujo local resultantes con las observadas

en condiciones nominales Si la partición de flujo en el nodo puede ser

claramente redirigido de una manera consistente con la perturbación, entonces

el nodo es flexible o débilmente rígido; de lo contrario, el nodo puede

ser fuertemente rígido No es posible proporcionar un mapa completo

Relacionando la respuesta metabólica con el tipo nodal ya que las respuestas metabólicas.

son específicos de cada caso debido a la variabilidad de la estructura de la red (dependiente versus
independiente), la arquitectura de control y la perturbación

usado. Por esta misma razón, los tipos de perturbaciones utilizadas para evaluar

o atenuación de

actividad enzimática a través de modificaciones genéticas; (iii) ambiental

perturbación, como un cambio en la La rigidez nodal también es específica de cada caso, pero se
puede clasificar en cuatro

categorías generales: (i) atenuación de la actividad enzimática a través de

adición de un inhibidor específico; (ii) Amplificación fuente de carbono; y (iv) la desregulación de


un metabolito diferente para aumentar la carga metabólica. Estas

Se aplicaron tipos de perturbaciones para investigar la rigidez de la

Nodos principales de G6P, Pyr y PEP en la biosintética de lisina

red (fig. 1) (37).


Para examinar la posibilidad de que la síntesis de lisina sea limitada.

por disponibilidad de NADPH (es decir, la rigidez del nodo G6P), C.

Glutamicum se cultivó en gluconato en lugar de glucosa ya que el

Se sabe que el primero omite el nodo G6P ingresando directamente al

vía de fosfato de pentosa (43). Partición de flujo en el nodo G6P

(Fig. 4) calculada a partir de los datos de fermentación revela que el 50%

más NADP se redujo por mol de sustrato consumido en el

la fermentación de gluconato que en la fermentación de glucosa (un resultado de

El mayor flujo soportado por la segunda deshidrogenasa en el

rama oxidativa de la vía del fosfato de pentosa). Rendimiento de lisina en

ambas fermentaciones, sin embargo, fueron -30% molar, lo que indica

ese rendimiento de lisina no está limitado por la partición de flujo en el nodo G6P.

En apoyo de estos hallazgos, una segunda perturbación del nodo G6P

Se realizó en el que se aisló una cepa de C. glutamwum que

Expresó la isomerasa G6P en solo el 10% de su actividad nativa. Curiosamente, la mutación no


afectó el rendimiento de lisina o la partición de flujo

pero resultó en una atenuación del 75% de todos los flujos metabólicos (37), una

Respuesta consistente con una red dependiente que alberga un rígido.

nodo. Estos resultados, junto con la eficiencia por la cual las distribuciones de flujo en el nodo G6P
cambiaron en respuesta a una mayor demanda

Para NADPH durante la síntesis de lisina en la fermentación de control.

(37), estableció el nodo G6P como flexible e implica que o bien el

Los nodos Pyr o PEP deben ser rígidos.

La posibilidad de que el rendimiento de lisina esté limitado por la partición de flujo.

en el nodo principal de Pyr se examinó perturbando este nodo (37)

agregando fluoropiruvato [un inhibidor competitivo de la PDC (6)]

Durante la fermentación normal de lisina. Distribuciones de flujo estimadas

de los datos de fermentación (Fig. 5) demuestran que el piruvato fue

desviados del ciclo TCA, pero el aumento en la disponibilidad de piruvato

No mejoró el rendimiento de lisina. En un segundo experimento de perturbación.


(37), se determinaron las distribuciones de flujo para una cepa de C. glutamicum

que expresaba solo el 1% de la actividad nominal de PDC. Esta mutacion hizo

no afectó el rendimiento de lisina instantáneo o la partición de flujo, pero sí

resulta en la reducción de los flujos metabólicos en un 75% de una manera análoga

como la mutación isomerasa G6P. Estos dos experimentos de perturbación indican que el
rendimiento de lisina no está limitado por la disponibilidad de piruvato

(es decir, el nodo Pyr es flexible), lo que implica, junto con el

resultados anteriores, que el nodo PEP debe ser la fuente de la

Rigidez de la red. Sin embargo, la arquitectura de control subyacente a la

causa de la rigidez del nodo PEP no se puede determinar a partir de la

técnica de análisis de flujo de perturbación; por lo tanto, la cinética de la

Las enzimas asociadas con el nodo PEP fueron examinadas en detalle.

Desde la inspección, la arquitectura de control del nodo PEP en C. glutamicum exhibe las
características de un nodo fuertemente rígido desde PEP

La carboxilasa (PPC) está fuertemente inhibida por el aspartato, pero esto

la inhibición se alivia mediante la activación por acetil coenzima A (AcCoA)

(44). Para examinar más a fondo la rigidez del punto de derivación PEP, un

El modelo cinético del nodo fue construido utilizando cinética enzimática.

disponible de las bacterias del ácido glutámico (37). El modelo consiste en

expresiones cinéticas para enolase (ENO), PPC, Pyr quinasa (PK) (45),

aspartato aminotransferasa, PDC, aspartato quinasa (AK) y citrato

sintasa (CS). El flujo soportado por el sistema de glucosa: PEP fosfotransferasa (43) se asumió que
era la mitad del flujo de enolasa,

y todo el aspartil fosfato sintetizado se asumió que

se condensan con piruvato para producir lisina (la cinética de la dihidrodipicolinato sintasa no se
incluyó en el modelo).

La rigidez del nodo PEP se ilustra mediante el flujo de estado estable

Distribuciones obtenidas del modelo tras atenuación de PK.

actividad (fig. 6). Para el sistema nominal (Fig. 6, líneas continuas),

la atenuación de los resultados de la actividad de PK en una disminución del flujo de PPC y una
Colapso general del flujo a través del nodo PEP. Si los efectos de Asp

y AcCoA se eliminan de la cinética de PPC, el nodo PEP

vuelve a un nodo débilmente rígido debido a la atenuación de los resultados de la actividad de PK

en un desvío de desvío hacia la rama PPC (Fig. 6, líneas discontinuas). los

La fuerte rigidez del nodo PEP se ve reforzada por (i) la alta actividad

de PK y su fuerte afinidad por PEP y (ii) la baja actividad de AK

y su pobre afinidad por Asp, que mantiene el alto nivel intracelular

Piscina de Asp. Sobre la base de estas simulaciones, parece que el flujo

la partición en el nodo PEP puede ser favorable para la lisina

síntesis mediante la transformación de C. glutamicum con un PPC desregulado

enzima a aproximadamente diez veces su actividad nativa (amplificación de

la actividad PPC nativa no dio como resultado una partición de flujo significativa

mejora en simulaciones).

El análisis del nodo PEP plantea un punto importante.

En cuanto a la mitigación de la rigidez fuerte. Aunque se pueden usar técnicas de ingeniería


genética para modificar un nodo rígido y renderizarlo

flexible (como cambio de afinidad de sustrato o inhibidor), en este momento

Tales modificaciones son todavía bastante difíciles de lograr. Otro

El procedimiento que puede resultar más ventajoso es usar enzimas.

De organismos que tienen diferentes arquitecturas de control para el mismo.

Vía bioquímica. Un buen ejemplo es la regulación del PPC.

Flujo en fotoautótrofos. Dado que las plantas C4 y algunas cianobacterias utilizan

PPC en la fijación de CO2 (46), la arquitectura de control del nodo PEP

en muchos fotoautótrofos se diferencia de los heterótrofos en que PPC es

no inhibido (o no inhibido tan fuertemente) por Asp ni lo hace

requiere activación por AcCoA (47, 48). En consecuencia, la partición de flujo

en el nodo PEP en C. glutamicum puede mejorarse transformando

esta cepa con PPC de una cianobacteria, como Anacystis

nidulans (48), aunque existen otras posibilidades (49). Es importante


Para darse cuenta de que las distribuciones de flujo que son óptimas para el producto

La síntesis puede no soportar el crecimiento. En consecuencia, tales modificaciones.

Las instrucciones deben construirse de modo que puedan "encenderse" después de

Se ha acumulado suficiente biomasa.

Conclusiones

Relativamente pocos ejemplos se han ofrecido en la mejora de la tensión

A través de alteraciones del metabolismo primario. Esta falta de significante

El progreso en el campo se atribuye en parte a las complejas interacciones

de redes metabólicas, sino también a la falta de un enfoque general, práctico

aproximación a la ingeniería metabólica. Para abordar este problema, nosotros

Han propuesto una hipótesis de trabajo sobre la rigidez metabólica.

y han desarrollado un enfoque para identificar la fuente o fuentes de

Rigidez que debe fomentar los intentos de optimizar el flujo metabólico.

Distribuciones para la sobreproducción de metabolitos. Hemos propuesto que

La arquitectura de control del metabolismo primario, que se optimiza.

Para la síntesis de componentes celulares, evita alteraciones radicales.

De las distribuciones de flujo metabólico que permitirían ciertos metabolitos.

para ser sobreproducido cerca de rendimiento máximo. Análisis del flujo metabólico.

Las distribuciones que son óptimas para la síntesis de productos revelan que

las modificaciones en la partición de flujo deben ocurrir solo en el principal

Nodos de la red. La arquitectura de control o la cinética de un

El nodo principal puede limitar la medida en que la partición de flujo lo haría

ocurren después de la desregulación del producto. Mapeo de flujo junto con

Las perturbaciones metabólicas pueden utilizarse para evaluar la flexibilidad de la

Nodos principales. Dado que la alteración o bypass de un fuertemente rígido

nodo puede requerir alteraciones significativas de la cinética de la enzima, nosotros

proponer que la rigidez nodal puede aliviarse recurriendo a la

Diversidad de arquitecturas de control que se encuentran en otros organismos.


Fig. 4. Partición de flujo en el punto de ramificación de la glucosa-6-fosfato (G6P)

durante las fermentaciones de lisina de C. glutamicum ATCC 21253 con (A) glucosa

(control) o (B) gluconato en la fuente de carbono primaria. Las fermentaciones fueron

realizado aeróbicamente en un fermentador de 10 litros en el que el consumo de

glucosa (o gluconato), oxígeno y amonio y la producción de

La lisina, la biomasa, el dióxido de carbono y los subproductos (trehalosa, acetato,


piruvato, alanina, valina y lactato) se controlaron con frecuencia (37). Se determinaron las tasas de
acumulación o consumo de metabolitos extracelulares.

Tras la terminación del crecimiento exponencial y el comienzo de

Sobreproducción de lisina. Estas tasas fueron utilizadas con el metabolito.

Restricciones de balance para estimar las distribuciones del flujo metabólico. Absoluto

Los flujos (entre paréntesis) están en unidades de milimoles por hora por gramo de
células.

Fig. 4. Partición de flujo en el punto de ramificación de la glucosa-6-fosfato (G6P)

durante las fermentaciones de lisina de C. glutamicum ATCC 21253 con (A) glucosa

(control) o (B) gluconato en la fuente de carbono primaria. Las fermentaciones fueron

realizado aeróbicamente en un fermentador de 10 litros en el que el consumo de

glucosa (o gluconato), oxígeno y amonio y la producción de

La lisina, la biomasa, el dióxido de carbono y los subproductos (trehalosa, acetato, piruvato,


alanina, valina y lactato) se controlaron con frecuencia (37). Se determinaron las tasas de
acumulación o consumo de metabolitos extracelulares.
Tras la terminación del crecimiento exponencial y el comienzo de

Sobreproducción de lisina. Estas tasas fueron utilizadas con el metabolito.

Restricciones de balance para estimar las distribuciones del flujo metabólico. Absoluto

Los flujos (entre paréntesis) están en unidades de milimoles por hora por gramo de células.

.Higo. 5. La partición de flujo en los puntos de las ramas PEP y Pyr durante (A) la

controle la fermentación de lisina y (B) una fermentación idéntica después de la

adición de 2 mM de fluoropiruvato (FP) en la terminación de exponencial

Crecimiento y al inicio de la sobreproducción de lisina (37). La adición de FP

dio lugar a la acumulación extracelular de piruvato (Pyrx-r) y disminuyó el flujo hacia el ciclo TCA;
sin embargo, el rendimiento de lisina no se vio afectado.

al 30% molar. Los flujos absolutos (entre paréntesis) están en unidades de milimoles por

hora por gramo de células, y flujos a la biosíntesis no se muestran. Ver leyenda

de la Fig. 4 para las medidas tomadas para construir diagramas de flujo.