Microbiología avanzada

“Candidatus liberibacter americanus”

Introducción
El enfoque molecular ha permitido reconocer claramente la existencia de microorganismos
"no cultivables". De muestras ambientales, de diferentes suelos o del interior de plantas,
se puede aislar ADN o en los casos en los que es posible, (como del océano) se recuperan
bacterias de las que se extrae ADN sin pasar por un paso de cultivo. El ADN se usa como
molde para la síntesis de los genes ribosomales existentes en la muestra. Esto se logra
con una polimerasa y oligonucléotidos dirigidos a las regiones que se encuentran
conservadas de los genes ribosomales en todas las bacterias (oligonucléotidos
universales). Los fragmentos así sintetizados se clonan en vectores y la secuencia
nucleotídica se determina. Esta metodología se ha optimizado y es posible gracias a que
el protocolo de secuencia de nucleótidos se volvió simple. Ahora existen secuenciadores
automáticos o se pueden pagar los servicios de secuencia a compañías especializadas.
Las secuencias obtenidas de los genes del ARN ribosomal se comparan con las existentes
en los bancos de datos, hay más de 5000 existentes de un número casi igual de especies
bacterianas. Con este enfoque se ha revelado una diversidad que no se detecta con los
métodos de microbiología tradicional.

El visualizar a las bacterias es un paso hacia su aislamiento, pero el cultivar a muchas de

las bacterias que han sido detectadas de este modo no siempre ha sido posible. El
encontrar las condiciones para cultivar bacterias no cultivables es un reto para los
microbiólogos.

Se ha acordado que a las bacterias "no cultivables" detectadas sólo por su secuencia de
genes ribosomales se les designe "candidatos". Un ejemplo es la bacteria candidatus
"Liberibacter" un patógeno de cítricos que es cercano a bacterias simbiontes benéficas del
género Mesorhizobium que crecen con facilidad en el laboratorio. La posición filogenética
de algunas de estas bacterias no cultivables se sitúa en ramas aisladas de otros
microorganismos en el árbol universal.

Esta bacteria es conocida como Candidatus Liberibacter americanus, que provoca una
serie de síntomas como cambios de color en el follaje, especialmente de verde a varios
tonos de amarillo, deformación de hojas y frutos, sustitución de órganos o en casos
severos, pérdida de estructuras reproductivas (botones, flores y frutos). Las variantes de
esta bacteria son transmitidas por diferentes insectos vectores.

Historia.

La sintomatología causada por este agente era conocida desde el siglo XIX por citricultores
de China donde se le denominaba enfermedad de los brotes amarillos que provocaba la
muerte de cítricos en corto tiempo; después fue bautizada como “Huanglongbing” que
significa dragón amarillo; posteriormente se reportó en el continente africano a finales de
1920, aun sin reconocer la identidad del patógeno.

Fue en 1994 cuando Jagoueix y colaboradores trabajando con extractos del floema de
plantas de cítricos infectadas provenientes de Asia y África identificaron organismos
parecidos a bacterias (BLO), que no pudieron cultivar In Vitro. Por medio de la técnica PCR
(reacción en cadena de la polimerasa) amplificaron el gen 16S ribosomal de esos
organismos para poder comparar sus secuencias y determinaron que estos BLOs
formaban dos cepas bien diferenciadas aunque ambas pertenecían a una subdivisión de
la clase Proteobacteria. Con esta información se sugirió el nombre “Liberibacter” (del latín
Liber = corteza y bacter = bacteria) para este nuevo grupo de bacterias. Dado a que
pertenecían a organismos no cultivables artificialmente, propusieron el término de
“Candidatus”.

Anteriormente los síntomas de esta enfermedad eran atribuidos a otros patógenos, como
hongos, bacterias cultivables, virus y fitoplasmas, no obstante los análisis para detectar
éstos organismos fueron negativos. La estrategia utilizada para identificar el tipo de
bacteria implicó el uso de cebadores específicos para PCR en combinación con cebadores
universales para 16S rRNA. El análisis reveló que las bacterias compartían alta identidad
con especies Candidatus Liberibacter.
Taxonomía y morfología de Candidatus Liberibacter .

Es una bacteria filamentosa, Gram negativa, que se desarrolla en el floema de las plantas
hospederas y en el sistema digestivo del insecto vector. Taxonómicamente pertenece al
grupo α de la subdivisión Proteobacteria.

Morfológicamente puede ser redonda con un diámetro promedio entre 0.2 – 0.3 µm, sin
sobrepasar los 0.5 µm. Esta bacteria carece de una membrana externa pero posee una
pared de peptidoglicanos apenas visible, sin evidencias de flagelos o pilis. Posee tres
capas de células sobre la pared de la membrana exterior y en la membrana citoplasmática
interna. Su citoplasma es menos denso con respecto a otras bacterias fitopatógenas y con
frecuencia muestran plasmólisis

La caracterización bioquímica es casi nula, dada la dificultad para aislarla en medio de

cultivo, y de allí que está ubicada dentro de los organismos Candidatus. Sin embargo, se
han reportado por un lado que CaLam parecen tener mayor capacidad metabólica para
algunos aminoácidos y vitaminas, y es capaz de producir arginina, glutamina y ornitina.

Los métodos de detección de CL y de diagnóstico de las enfermedades que produce

deben, por tanto, ser lo suficientemente precisos para distinguir aquellos casos en los que
la existencia de la bacteria implica enfermedad, de aquellos en los que simplemente se
está detectando una bacteria endófita sin ninguna consecuencia para la salud del cultivo.
Los CL son transmitidos por psílidos, insectos que se alimentan del floema de las plantas,
y cuya gama de hospedador determina en muchos casos la presencia de la bacteria en un
determinado cultivo. Unos investigadores reportan que el tiempo mínimo de alimentación
es de 5-7 horas para adquirir y transmitir el patógeno.

La detección fiable de la bacteria, en conjunto con clonación y secuenciación. La PCR es

la más usada para la detección de esta bacteria, por ser una técnica muy sensible y rápida.
Para realizarla es necesario contar, para cada una de las especies descritas de Candidatus
Liberibacter con oligonucleótidos específicos, cuyo diseño se basa en la secuencia de
nucleótidos de la región 16S rDNA de su genoma.
Existen diversas opiniones en torno al problema de no poder cultivar microorganismos de
los que se ha documentado su existencia. Se ha pensado que éstos pueden requerir
nutrientes particulares que sólo se encuentran en condiciones naturales. Algunos
nutrientes tal vez sean proporcionados por microorganismos asociados. En la naturaleza,
es común encontrar comunidades bacterianas en las que coexisten varias especies y
géneros de bacterias. En estas comunidades pueden existir dependencias metabólicas
complejas. El enfoque de microbiología tradicional tiene como primer paso el obtener
cultivos puros de bacterias y tal vez esto ocasiona que sólo se cultive parte de los
miembros de la comunidad. Otra posibilidad es que los medios típicos de crecimiento sean
demasiado ricos, aún los medios mínimos tienen un exceso de carbono o de nitrógeno o
de fósforo, e inhiban el crecimiento de microorganismos que en condiciones naturales, en
general, viven precariamente.

Conclusión.
Debido a la capacidad de la proteobacteria para propagarse, se han reportado casos de
HLB en diversas partes del mundo, y a consecuencia de los síntomas que presentan las
plantas de todas las variedades cítricas después de ser infectadas (manifestando
amarillamiento de uno o más brotes que con el tiempo se extiende a toda la planta
ocasionando su muerte en algunos meses o años), se requiere una forma de cultivar la
proteobacteria y así desarrollar un pesticida que permita la inhibición del crecimiento de la
bacteria, evitando así la muerte de dichas plantas.

Bibliografía

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