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Practica 1
Manual de practicas
Ingeniería de bioprocesos
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Aislamiento y conservación, Ing Bioprocesos 2017 (S2), Ing Bioq
Practica 1
Introducción.
El presente manual cuanta con una selección de practicas que permitarán al estudiante desarrollar las
modo, se presentan temáticas y puntos críticos que son necesarios se aborden durante el quiahacer del
ingeniería bioquímico.
Al realizar las practicas propuestas, el alumno retomara conceptos básicos como la preparación de
soluciones amortiguadoras, medios de cultivo complejos y quimicamente definidos, así como pondrá en
practica los conocimientos adquiridos sobre ingeniería genética, metabolismo secundario, bioquímica y
Además, las practicas se encuentran estructuradas para ayudar al ñalumno a cumplir con un proyecto
semestral, el cual tiene como fin el diseñar, modelar y optimizar un bioproceso existente, partiendo del
desarrollo regional, por lo cual, al final de cada practica se retoman conceptos teóricos esenciales para la
Se toman como estudios de caso, para el diseño de estas practicas, bioprocesos exitosos que
concluir con el escalamiento de un proceso relacionado con la bioingeniería en donde se retomaran los
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Practica 1
Contenido.
Producción de ácido cítrico por fermentación sumergida con A. niger (upstream & downstream). .......... 21
Anexos. ....................................................................................................................................................................27
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Practica 1
1. Objetivo.
2. Introducción.
Introducción aquí…
Materiales de laboratorio.
Reactivos y soluciones.
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Practica 1
Material biológico
4. Metodología.
Aislamiento primario.
(1) Pesar 1 g de la muestra y agregar a un tubo con 9 mL de agua destilada estéril, agitar vigorosamente
(2) Realizar diluciones seriadas base 10, transfiriendo 1 mL de la dilución inicial a un tubo con 9 mL de
(3) Transferir 500 µL de las diluciones impares, a partir de la dilución 10-5, a una placa de agar
Czapek , selle las placas con papel parafilm e incubar a 30ºC ± 2ºC de 24 a 48 h y hasta 3 días de
ser necesario.
(4) Registre la morfología macroscópica y microscópica de las colonias aisladas, seleccione las de
interés y realice un resiembra en agar Czapek selle las placas con papel parafilm e incube a 30ºC ±
(5) Realizar una suspensión 1.0 McF de los aislamientos primarios y realizar las siguientes
aminoácidos.
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Practica 1
• Realizar una suspensión 1.0 McF de la cepa de S. aureus en solución salina estéril al 0.85%,
insertar un hisopo estéril, exprimir el excedente en las paredes del tubo y sembrar
masivamente en una placa de AST. Sobre está, colocar la gota de los cultivos problema,
incubar a 30ºC ± 2ºC por 72 h. Al término de la incubación registrar los halos de inhibición.
identificado:
• Cultivos bacterianos:
- Realice un cultivo en CST y deje incubar a 30ºC ± 2ºC durante toda la noche, una vez
conservación.
min, decante el líquido cuidando de dejar una porción junto con el pellet.
crioprotector debe realizarse en función del tipo del microorganismo, para esto
a -20ºC ± 2ºC.
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Practica 1
Conservación en crioperlas.
- Lavar y neutralizar las perlas de vidrio, para esto se deben colocar en un matraz o
lograr la separación de las impurezas, retirar el ácido y lavar repetidamente con agua
hasta lograr la neutralidad (pH 7.0 ± 0.2), colocar en un frasco limpio y esterilizar a
- Una vez que se ha estabilizado la suspensión, retirar el liquido con ayuda de pipeta y
• Cultivos fúngicos:
Preservación en arena.
- Filtre el líquido al vacío en un soporte de filtrado estéril; esto separará las hifas y
conidias de las esporas, transfiera el filtrado a un tubo para centrífuga tipo falcon de
Preservación en sílica.
- Utilizar un cultivo esporulado como inoculó. Llenar un tubo con tapón de rosca de
13 x 100 mm a un tercio con cristales de sílica y esterilizar los tubos a 160ºC - 180ºC
tomar 1 mL de la suspensión y dispensar en los tubos con sílica (ya enfriada), agitar
por inmersión para asegurar que se expone a la mayor área superficial, hasta que el
líquido sea absorbido por los cristales de sílica y congelar a -20ºC ± 2ºC.
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(7) Realizar el seguimiento de la conservación a las 4, 8 y 16 semanas, para esto utilizar el siguiente
- Retrire una de las replicas del congelador e inmediatamente lleve a un baño de agua
caliente a 30ºC ± 2ºC, mantenga durante 5 min y retire, una vez que se haya
- Siembre una gota en una placa de Czapek o AST, según corresponda, e incube a
5. Resultados.
(1) Utilice las tablas para registrar sus observaciones y, posteriormente; discuta sus resultados.
Muestreo:
Muestra: Cantidad utilizada (g):
Punto de recolección:
Condiciones durante el
muestreo:
Identificación:
Características Características
Aislamiento Identificación final Medio utilizado
macroscópicas microscópicas
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Practica 1
Método: ID Cepa:
4 sem
8 sem
16 sem
Método: ID Cepa:
4 sem
8 sem
16 sem
Método: ID Cepa:
4 sem
8 sem
16 sem
6. Manejo de residuos.
(1) Manejar todos los desechos provenientes de cultivos y resiembras de microorganismos como
• Colocar todo el material autoclave en bolsas plásticas y esterilizar a 121ºC @15 min a 15 lb,
esterilizarse a parte de los autoclavables en un ciclo de 121ºC @15 min a 15 lb, dejar enfriar
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(2) Manejar todos los residuos de sustancias químicas o mezclas de sustancias químicas como
• Colocar una etiqueta para identificar el residuo, esta debe listar los componentes de la
• Los residuos químicos peligrosos se almacenan hasta por 1 año, coloque el frasco en el
lugar destinado para este fin, consulte con el jefe del laboratorio.
9. Ejercicios.
(1) Describa los procesos generales de aislamiento para los siguientes géneros de microorganismos:
• Aspergillus spp.
• Spirulina spp.
• Methanococcus spp.
• Sphingomonas spp.
• Bacillus spp.
• Acinetobacter spp.
(2) Describa brevemente las características que debe tener un organismo para ser considerado como
(3) Menciona 5 organismos de interés, además de los presentados en esta práctica, y describa
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Practica 1
de acción.
(6) Menciona las colecciones o bancos biológicos más importantes a nivel internacional, que son
(7) Realice un resumen de una cuartilla sobre la importancia de los bancos biológicos en el desarrollo
2. Cinar A, Parulekar S J, Ündey C, Birol G, Batch fermentation modeling, monitoring and control, Marcel
Dekker Inc., (2003), ISBN: 0-82-47-4034-3.
3. Doble M, Kruthiventi A K, Gaikar V G, Biotransformations and bioprocess, Marcel Dekker Inc., (2004), ISBN:
0-8247-4775-5.
4. Baltz R H, Demain A L, Davies J E, Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, 3rd Ed., ASM Press,
(2010), ISBN: 978-1-55581-512-7.
5. Simpson R, Sastry S K, Chemical and bioprocess engineering: Fundamentals concepts for first-year students,
Springer.
9. Humber R A, Capitulo V-5 Fungi: Preservation of cultures, en Manual of Techniques in Insect Pathology,
esitado por Lacey L A, Academic Press, London, 1997, Pages 269-279, ISBN 9780124325555, http://
dx.doi.org/10.1016/B978-012432555-5/50015-4.
10. Stanbury P F, Whitaker A and Hall S J, Capitulo 6 - Culture preservation and inoculum development, en
Principles of Fermentation Technology, 3rd Ed., Butterworth-Heinemann, Oxford, 2017, Pages 335-399, ISBN
9780080999531, http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-08-099953-1.00006-5.
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Parámetros de control, Ing Bioprocesos 2017 (S2), Ing Bioq
Practica 1
1. Objetivo.
2. Introducción.
Saccharomyces cerevisiae fue uno de los primeros microorganismos utilizados para la producción de
(Suárez-Machin C, et al, 2016). Es capaz de metabolizar diferentes tipos de azucares, entre ellos la
glucosa (como monosacáridos reductores) y sacarosa (disacárido no reductor), siendo este ultimo el de
La presente practica tiene por objetivo introducir al estudiante en los procesos relacionados con la
Materiales de laboratorio.1
1Nota: utilice material estéril, a menos que se indique lo contrario. Todo material consumible (plásticos, aplicadores, puntas de pipetas, pipetas de cristal, etc.) que sea esterilizado por
vapor húmedo tiene una caducidad de 1 mes a partir de la fecha de esterilización.
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Practica 1
Reactivos y soluciones.
Material biológico
4. Metodología.
(1) A partir de una cepa tipificada de Saccharomyces cerevisiae en agar YPD, realice una suspensión en
solución salina 0.85%, y lleve a 1.0 McF (aprox. 3.0 x 108 cel·mL-1), prepare 100 mL.
(2) Tome 1 mL y diluya en 99 mL de SS 0.85 (Dil 1:100), a partir de esta realice diluciones seriadas hasta
10-9, transfiera 10 mL en cada paso; y siembre las diluciones 10-6, 10-7, 10-8 y 10-9 por vaciado en
placa en agar DSA, transfiriendo 1 mL de cada dilución por triplicado, incube a 28ºC ± 2ºC durante
toda la noche, conserve en refrigeración la suspensión 1.0 McF hasta su uso, no más de 7 días.
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Parámetros de control, Ing Bioprocesos 2017 (S2), Ing Bioq
Practica 1
(3) Calcule el log10 de la cuenta bacteriana además de la media, desviación estándar y desviación
estándar relativa (SDR), elabore una hoja de calculo y reporte sus observaciones.
Reactor 1:
Reactor 1:
Reactor 3:
Reactor 3:
(2) Realizar perforaciones en la tapa de un frasco para cada uno de los tubos dispensadores y para la
jeringa de muestreo mostrados en la figura 1, agregar una barra de agitación magnética de 3 cm,
cerrar los frascos y colocar un tapón de algodón en cada orificio y cubrir con cinta, esterilizar a
121ºC@15 lb por 15 min, esterilizar también las mangueras y puntas de jeringa necesarias.
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Parámetros de control, Ing Bioprocesos 2017 (S2), Ing Bioq
Practica 1
(3) Utilice los datos obtenidos en la preparación del inoculo (3) para calcular el volumen de inoculo
necesario, a partir de la suspensión 1.0 McF, considere que se requieren 1.0 x 108 cel/mL, tome el
• Aireación: tome una manguera adecuada y con ayuda de una T divida el flujo, como máximo
coloque tres tomas por bomba, el flujo deberá diseccionarse al fondo del frasco sin que este
interfiera con la agitación; conecte a la punta de la manguera un filtro para jeringa de 0.20
µm, uno por cada división, el nivel de aireación debe ser de 0.6 - 0.9 vvm.
• Extracción de CO2: coloque un tubo de plástico estéril o cuerpo de jeringa en el orificio para
la extracción de los gases, la punta que se introduce en el frasco no debe tocar el caldo de
• Jeringa de muestreo: colocar la aguja de jeringa estéril en el orificio, cuidando de sellar con
algodón, este se debe retirar con asepsia cada vez que se coloque la manguera para retirar la
muestra.
• Alimentación de medio nuevo: en una botella estéril coloque una cantidad suficiente de
solución estéril a utilizar y ajuste el flujo de la manguera para una adición de 5 a 10 gotas por
min.
(4) Incube los reactores a 28ºC ± 2ºC con agitación y tome muestras a los tiempos 0, 1, 2, 16, 24, 48 y 72
h, en cada muestreo retire 50 mL de caldo, conserve en congelación todas las muestras tomadas,
(5) Conserve un blanco del medio de cultivo sin inocular bajo las mismas condiciones que las muestras.
(1) Analizar las muestras tomadas durante el proceso de fermentación de acuerdo a lo siguiente:
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Parámetros de control, Ing Bioprocesos 2017 (S2), Ing Bioq
Practica 1
• Cuantificación de la biomasa:
a 600nm.
vaciado en placa las diluciones 10-6, 10-7 y 10-8 en agar DSA e incube a 28ºC ± 2ºC
cuantificar el volumen. Secar los filtro con la biomasa en una estufa a 70ºC durante
24h, dejar enfriar en un desacador y determinar el peso seco. Calcular el peso seco de
• Con ayuda de un electrodo o tiras medidoras, tome el pH de cada filtrado, realice una
• Prepare una curva patrón de glucosa en agua destilada estéril y filtrada, para los
siguientes puntos: 1.0, 5.0, 7.5, 10.0, 15, 20, 25 y 30 g/L, (una curva por todo el grupo).
Realice la cuantificación de los azucares reductores a través del método de DNS tanto
para la curva patrón como para 1 mL de cada muestra problema, en caso de no poder
utilizar este método cuantifique por medio del método de Fehling, de acuerdo a lo
indicado en el anexo 2.
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Parámetros de control, Ing Bioprocesos 2017 (S2), Ing Bioq
Practica 1
• Prepare una solución estándar de etanol al 10% (v/v) en agua destilada, a partir de esta
realice diluciones tomando 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 y 5.0 mL y lleve cada
destilado.
• Llene el picnómetro con agua hasta el aforo y tome el peso con precisión.
• Repita para cada muestra destilada, utilice un picnómetro a peso constante por
Wp+m − Wp
ge =
Wp+H2O − Wp
alcohol en la muestra:
(Vm )(vtabla )
VEtOH,mL =
100
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Parámetros de control, Ing Bioprocesos 2017 (S2), Ing Bioq
Practica 1
5. Resultados.
• Rendimiento respecto al sustrato (YX/S) y del producto (YP/S) discuta sus resultados,
(2) Utilice el software necesario para realizar las gráficas de concentración, crecimiento y de afectación
de parámetros, cree las tablas adecuadas para presentar la información, los gráficos deben
presentarse con las barras de error, (utilice la desviación estándar de tres mediciones consecutivas).
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Parámetros de control, Ing Bioprocesos 2017 (S2), Ing Bioq
Practica 1
(3) Realice un diagrama de flujo de proceso que muestre cada una de las etapas de la práctica
realizada, así como los controladores que se requieren para asegurar que los parámetros de control
se mantienen correctamente.
6. Manejo de residuos.
(1) Manejar todos los desechos provenientes de cultivos y resiembras de microorganismos como
• Colocar todo el material autoclave en bolsas plásticas y esterilizar a 121ºC @15 min a 15 lb,
esterilizarse a parte de los autoclavables en un ciclo de 121ºC @15 min a 15 lb, dejar enfriar
(2) Manejar todos los residuos de sustancias químicas o mezclas de sustancias químicas como
• Colocar una etiqueta para identificar el residuo, esta debe listar los componentes de la
• Los residuos químicos peligrosos se almacenan hasta por 1 año, coloque el frasco en el
lugar destinado para este fin, consulte con el jefe del laboratorio.
9. Ejercicios.
(1) Conteste las siguientes preguntas, deberá entregarlas anexas a su diagrama de flujo al iniciar la
sesión de laboratorio.
1. ¿Cuáles son las rutas metabólicas que deben permanecer inalteradas durante la fermentación
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Parámetros de control, Ing Bioprocesos 2017 (S2), Ing Bioq
Practica 1
3. ¿Existe algún tipo de inhibición en la fermentación alcohólica? y si es así, ¿Qué rutas se ven
involucradas?.
4. ¿Las simulación puede ser utilizada como una alternativa rentable al trabajo de laboratorio?
Explique su respuesta.
5. Describa la ruta metabólica para la obtención de etanol, glicerol y ácido acético a partir de
carbohidratos.
6. Referencias bibliográficas.
2. Baltz R H, Demain A L, Davies J E, Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, 3rd Ed., ASM Press,
(2010), ISBN: 978-1-55581-512-7.
3. Cinar A, Parulekar S J, Ündey C, Birol G, Batch fermentation modeling, monitoring and control, Marcel
Dekker Inc., (2003), ISBN: 0-82-47-4034-3.
4. Clarke K G, Bioprocess engineering: an introductory engineering and life science approach, Woodhead
Publishing, (2013), ISBN: 978-1-78242-168-9 (online).
6. Doble M, Kruthiventi A K, Gaikar V G, Biotransformations and bioprocess, Marcel Dekker Inc., (2004), ISBN:
0-8247-4775-5.
7. Doran M P, Bioprocess engineering principles, 2nd Ed., Academic Press, Elsevier, (2013), ISBN:
978-0-12-220851.
9. Nielsen J, Villadsen J, Lidén G, Bioreaction engineering principles, 2nd Ed., Kluwer Academic (2003), ISBN:
0-306-47349-6.
10. Okafor N, Modern industrial microbiology and biotechnology,Science Publishers, (2007) ISBN
978-1-57808-434-0.
11. Simpson R, Sastry S K, Chemical and bioprocess engineering: Fundamentals concepts for first-year students,
Springer.
12. Waites M J, Morgan N L, Rockey J S, Higton G, Industrial Microbiology: An introduction, Blackwell Science,
(2001), ISBN: 0-632-05307-0.
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Prod. ácido citrico por A. niger. Ing Bioprocesos 2017 (S2), Ing Bioq
Practica 1
1. Objetivo.
Desarrollar las habilidades y aptitudes para el análisis de bioprocesos en la generación del upstream &
2. Introducción.
El ácido cítrico…
Materiales de laboratorio.2
2Nota: utilice material estéril, a menos que se indique lo contrario. Todo material consumible (plásticos, aplicadores, puntas de pipetas, pipetas de cristal, etc.) que sea esterilizado por
vapor húmedo tiene una caducidad de 1 mes a partir de la fecha de esterilización.
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Prod. ácido citrico por A. niger. Ing Bioprocesos 2017 (S2), Ing Bioq
Practica 1
• KOH, 2N.
• Patrón de turbidez de McFarland.
• Solución de patrón de glucosa (1.0 g·L-1 hasta 30 g·L-1).
Material biológico.
4. Metodología.
(1) A partir de una cepa tipificada de Aspergillus niger, realice una suspensión de esporas en solución
salina 0.85%, y lleve aprox. 1.0 x 108 cel/mL utilizando SS 0.85 como diluyente, prepare 10 mL.
(1) Llene un frasco de reacción hasta el 80% de su capacidad con el caldo de fermentación estéril,
agregue una barra de agitación. La tapa del frasco no debe tener orificios, o en su caso deben
inmediatamente coloque en agitación orbital sumergida a 28ºC ± 2ºC, en caso de no contar con el
(3) Tome muestras de 50 mL al tiempo 0, 2, 8, 16, 24, 48, 72, 96 y 120 h, recolecte el líquido en tubos
• Cuantificación de la biomasa:
de cuantificar el volumen. Secar los filtro con la biomasa en una estufa a 70ºC durante
24h, dejar enfriar en un desecador y determinar el peso seco. Calcular el peso seco de
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Prod. ácido citrico por A. niger. Ing Bioprocesos 2017 (S2), Ing Bioq
Practica 1
• Con ayuda de un electrodo o tiras medidoras, tome el pH de cada filtrado, realice una
• Prepare una curva patrón de glucosa en agua destilada estéril y filtrada, para los
siguientes puntos: 1.0, 5.0, 7.5, 10.0, 15, 20, 25 y 30 g/L, (una curva por todo el grupo).
Realice la cuantificación de los azucares reductores a través del método de DNS para
la curva patrón.
gotas de fenolftaleina, titule con NaOH 0.1N hasta observar el primer vire de color
• Al término de la fermentación, filtre el volumen total del caldo con ayuda de una
± 0.2, para esto agregue una gota de fenoftaleina y lleve a neutralidad, una vez
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Prod. ácido citrico por A. niger. Ing Bioprocesos 2017 (S2), Ing Bioq
Practica 1
• Deje enfriar a temperatura ambiente y separe el citrato de calcio por filtración al vacío
• Agregue un volumen igual de H2SO4 concentrado del 60 - 70% y lleve a 90ºC durante
20 min, la mezcla no debe hervir, mantenga tapado el vaso de precipitados con ayuda
de un vidrio de reloj.
de ácido cítrico.
5. Resultados.
• Rendimiento respecto al sustrato (YX/S) y del producto (YP/S) discuta sus resultados,
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Prod. ácido citrico por A. niger. Ing Bioprocesos 2017 (S2), Ing Bioq
Practica 1
(2) Utilice el software necesario para realizar las gráficas de concentración, crecimiento y de afectación
de parámetros, cree las tablas adecuadas para presentar la información, los gráficos deben
presentarse con las barras de error, (utilice la desviación estándar de tres mediciones consecutivas).
(3) Realice un diagrama de flujo de proceso que muestre cada una de las etapas de la práctica
realizada, así como los controladores que se requieren para asegurar que los parámetros de control
se mantienen correctamente.
6. Manejo de residuos.
(1) Manejar todos los desechos provenientes de cultivos y resiembras de microorganismos como
• Colocar todo el material autoclave en bolsas plásticas y esterilizar a 121ºC @15 min a 15 lb,
esterilizarse a parte de los autoclavables en un ciclo de 121ºC @15 min a 15 lb, dejar enfriar
(2) Manejar todos los residuos de sustancias químicas o mezclas de sustancias químicas como
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Prod. ácido citrico por A. niger. Ing Bioprocesos 2017 (S2), Ing Bioq
Practica 1
• Colocar una etiqueta para identificar el residuo, esta debe listar los componentes de la
• Los residuos químicos peligrosos se almacenan hasta por 1 año, coloque el frasco en el
lugar destinado para este fin, consulte con el jefe del laboratorio.
6.9. Ejercicios.
(1) Conteste las siguientes preguntas, deberá entregarlas anexas a su diagrama de flujo al iniciar la
• Explique la importancia del ácido cítrico en los procesos industriales, de tres ejemplos de su uso.
• Describa la ruta metabólica para la obtención de ácido cítrico a partir de sacarosa y/o glucosa.
6.10.Referencias bibliográficas.
2. Baltz R H, Demain A L, Davies J E, Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, 3rd Ed., ASM Press,
(2010), ISBN: 978-1-55581-512-7.
3. Cinar A, Parulekar S J, Ündey C, Birol G, Batch fermentation modeling, monitoring and control, Marcel Dekker
Inc., (2003), ISBN: 0-82-47-4034-3.
4. Clarke K G, Bioprocess engineering: an introductory engineering and life science approach, Woodhead
Publishing, (2013), ISBN: 978-1-78242-168-9 (online).
6. Doble M, Kruthiventi A K, Gaikar V G, Biotransformations and bioprocess, Marcel Dekker Inc., (2004), ISBN:
0-8247-4775-5.
7. Doran M P, Bioprocess engineering principles, 2nd Ed., Academic Press, Elsevier, (2013), ISBN:
978-0-12-220851.
9. Nielsen J, Villadsen J, Lidén G, Bioreaction engineering principles, 2nd Ed., Kluwer Academic (2003), ISBN:
0-306-47349-6.
10. Okafor N, Modern industrial microbiology and biotechnology,Science Publishers, (2007) ISBN
978-1-57808-434-0.
11. Simpson R, Sastry S K, Chemical and bioprocess engineering: Fundamentals concepts for first-year students,
Springer.
12. Waites M J, Morgan N L, Rockey J S, Higton G, Industrial Microbiology: An introduction, Blackwell Science,
(2001), ISBN: 0-632-05307-0.
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Prod. ácido citrico por A. niger. Ing Bioprocesos 2017 (S2), Ing Bioq
Practica 1
Anexos.
1. Preparación de medios de cultivo.
Agar Czapek (ATCC M-312 modificado). Medio comercial: BD Diagnostic Systems.
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Prod. ácido citrico por A. niger. Ing Bioprocesos 2017 (S2), Ing Bioq
Practica 1
Solución de dicromato:
K2Cr2O7 34 g
H2SO4 conc. 325 mL
Agua destilada 500 mL
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