Análisis basados en sistemas biológicos.

Biosensores y
bioanálisis para el monitoreo de procesos biomineros y
biorremediación
Dr. Eduardo Cortón

1
1
 Biosensores y bioensayos, que
son?
 Sistemas que se basan en la especificidad del reconocimiento biológico
para la detección de un analito en particular (o grupos de analitos). Pueden
trabajar en matrices analíticas muy complejas, como la sangre o la leche.

Algunos tienen baja especificidad Otros tienen alta especificidad

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Biosensores, definiciones IUPAC
 IUPAC recommendation for the definition: “A biosensor is a device
that uses specific biochemical reactions mediated by isolated enzymes,
immunosystems, tissues, organelles or whole cells to detect chemical
compounds usually by electrical, thermal or optical signals.”1 Using
this definition, it is clear that the canary itself is not a biosensor.
However, it could be considered a precursor or antecessor of
biosensors.

 IUPAC also defines a bioassay as “a procedure for determining the

concentration or biological activity of a substance (e.g. vitamin,
hormone, plant growth factor, antibiotic) by measuring its effect on an
organism or tissue compared to a standard preparation.1 This concept
is quite broad, and encompasses both the canary in a cage as well as
most microbial assays. 3
Un actor más, relacionado con el
ambiente, el bioindicador

4
 Los perros espaciales, un precursor
de los biosensores o al menos de la
idea!
Scientists were no sure if can be possible to survive at high altitude. Perhaps microgravity has a
lethal effect over animals, or maybe the radiation would be very dangerous. In 1948, USA sent
the first monkeys, using V2s. The Soviet Union sent the denominated “Space Dogs”, some 13
dogs were sent in different missions, in order to probe pressurized suits. In the picture Laika in
the Sputnik 2, in 1957. Was the first animal in terrestrial orbit.

LAIKA
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 Historia de los bioensayos
One of the first applications of bioassays in the life sciences,
where useful assays were performed in 1890 by Ehrlich,
involving the quantitation and standardization of the diphtheria
antitoxin, which was an important medical treatment.

Una antitoxina es un anticuerpo formado en un organismo como respuesta

a la presencia de una toxina bacteriana en su interior, a la cual puede
neutralizar. Al inyectar a un animal que generalmente son caballos con
altas dosis de alguna toxina, estos producen una gran concentración de
antitoxinas en su sangre. Con estos anticuerpos altamente condensados, se
preparan los llamados antisueros.
Hoy en día, las antitoxinas son usadas también en el tratamiento del
botulismo, la disentería, la gangrena gaseosa y el tétanos.

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 Típico set-up de un bioensayo

Las dos plantas son leguminosas que crecen silvestres en México, HTP es
hidrocarburos totales de petróleo.
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Pasos para realizar un bioensayo

1. Exponer los organismos a diferentes

concentraciones de la sustancia a probar
(puede ser un tóxico o no)
2. Observar los efectos sobre los organismos,
en algún parámetro observable o medible
3. Determinar si a alguna concentración la
sustancia tiene algún efecto (cuando se
compara con los controles)

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 La dosis hace al veneno (o a todo lo
demás)
Según Paracelso, Alle Dinge sind ein Gift und nichts ist ohne Gift. Allein die
Dosis macht, daß ein Ding kein Gift ist («Todo es veneno, nada es sin veneno.
Solo la dosis hace el veneno»)

100
All Affected
75
% Response

50 Half Affected

25 No Effect

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Dose (mg/kg body weight)

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 La dosis hace a todo lo demás…

Welshons, WV, KA Thayer, BM Judy, JA Taylor, EM Curran and FS vom Saal. 2003. Large
effects from small exposures. I. Mechanisms for endocrine disrupting chemicals with estrogenic
activity. Environmental Health Perspectives 111:994-1006.
10
 Métodos usados habitualmente en
bioensayos
Table 1 Microbial bioassay methods
Method Technique

Turbidometric, potentiometric, spectrophotometric,

biochemical testing, electronic cell counters (e.g., flow
Growth rate, biomass, numbers
cytometer), viable cell counting (MPN), direct
observation

Respirometric (manometric, electrolytic, DO,

Aerobic respiration
biosensors)

Nitrification inhibition NH4+ utilization, NO3- production, MINNTOX, AMtox

Enzyme assays Esterases, dehydrogenases, phosphatases

Vibrio fischeri bioluminescence BioTox, LUMIStox, Microtox, ToxAlert
Chemiluminescence Horseradish peroxidase, Eclox, Aquanox

Reporter genes, e.g., lux, luc, gfp marked

Genetically modified bacteria
microorganisms

Escherichia coli, Pseudomonas putida, Salmonella

Biosensors for cytotoxicity, genotoxicity
typhimurium

11
 Muchos organismos son utilizados en bioensayos de toxicidad en agua

Bioensayos para Toxicidad

12
Bioensayos Microbianos
para la determinación de toxicidad total están basados en la inhibición
del metabolismo, medido como disminución de la producción de luz
en bacterias luminiscentes, disminución de la respiración u otros
indicadores metabólicos.

Sustancia tóxica que reduzca

respiración producirá un
decremento de la
luminiscencia. Porcentaje de
perdida de intensidad luminosa
respecto al control indica grado
de toxicidad. Microtox

Vibrio fischeri NRRL B-11177

13
 Premio INNOVAR, un bioensayo basado en una bacteria
recombínate, para la determinación de As en aguas
categoría Producto Innovador

SensAr: producto innovador, experiencia

excepcional

Equipo "Buenos Aires 2013"

Dr. Nadra
14

14
BIOSENSORES

15
Biosensor más exitoso
comercialmente

16
 Biosensores – Todavía más
definiciones…

“Instrumentos analíticos que transforman procesos

biológicos en señales eléctricas u ópticas y permiten su
cuantificación”

Otra mas:
A self-contained integrated device, which is capable of
providing specific quantitative or semi-quantitative analytical
information using a biological recognition element
(biochemical receptor) which is retained in direct spatial
contact with an electrochemical or not transduction element .

17
Biosensores
By simply exposing a Pt wire to the redox enzyme
glucose oxidase, he developed the basics for future
electrochemical biosensor development.

Leland C. Clark Jr.

18
 Partes y componentes de un biosensor
Señal Señal Señal
Bioquímica Eléctrica Eléctrica
Material Procesado
Biológico Transductor Amplificador y archivo

 Los biosensores son instrumentos

analíticos basados en la respuesta de un
material biológico en estrecho contacto
con un transductor físico/químico, que
convierte la respuesta biológica en una
señal eléctrica.
 La especificidad del reconocimiento
biológico permite que muchos de los
biosensores puedan operar en matrices
complejas (sangre, leche, aguas).

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 Ventajas de los Biosensores
 Permiten medir un analito sin purificación previa
 Altamente específicos (enzimas), o mas o menos
inespecíficos (microbianos)
 La información obtenida es mucho mas real que con
los métodos analíticos clásicos (biodisponibilidad)
 Mediciones rápidas y equipos portátiles han sido
diseñados
 La lista de posibles compuestos tóxicos en el
ambiente aumenta continuamente
 Es necesario, entonces, sistemas analíticos de amplio
espectro, inespecíficos

20
Tipos de biosensores. Según la biología
utilizada
(a) Enzyme
Molecular Antibody
Nucleic acid
Others

Prokaryotic
Cellular
Eukaryotic
Natural
(from life)
Organelles based

Plant
Tissue based
Animal
Organs based
Recognition
agents

Monoclonal antibodies

Catalytic antibodies
Artificial MIPs
(bioinspired)
Aptamers and NA analogs

Artificial ion channels

21
Tipos de biosensores. Según el transductor
utilizado
(b) Amperometric

Electrochemical Potentiometric

Impedimetric

Fluorescence
Surface plasmon resonance
Optical
Absorbance
Reflectance
Transducers

Piezoelectric

Surface acoustic wave

Mechanical
Cantilever resonance

Thermal
22
 Electrodos realizados por SPE son los
mas populares para único uso

SPE (screen printing electrodes), el standard de

la industria.

23
Electrodo SPE modificado con enzima y
mediador

24
Fotolitografía – Capa fina

25
BIOSENSORES, algunas aplicaciones
1. Control de metabolitos críticos durante las operaciones quirúrgicas.
2. Consultas y urgencias hospitalarias:
– Obvia análisis caros y lentos en laboratorios centrales
– Acelera la diagnosis y el comienzo del tratamiento
– Menor riesgo de deterioro de la muestra
3. Diagnóstico doméstico:
• Ensayos de embarazos
• Control de glucosa en diabéticos
4. Aplicaciones in vivo:
– Páncreas artificial
– Corrección de niveles de metabolitos
– Problemas : Miniaturización y biocompatibilidad
5. Aplicaciones Industriales, militares y medio ambientales:
– Alimentación
– Cosmética
– Control de fermentaciones
– Controles de calidad
– Detección de explosivos
– Detección de gases nerviosos y/o toxinas biológicas
– Control de polución.

26
 Medición de BOD por el método estándar

Es problemático medir
varias muestras
simultáneamente
Sin sensor
electroquímico de
DO (oxígeno
disuelto) la titulación
consume mucho
tiempo
Muestras grandes,
diluciones intensivas

27
 Biosensor para BOD y Calibración
Biosensores. Las células se
inmovilizan utilizando
membranas de filtración
(similar a papel de filtro) u
otros métodos (geles) al
electrodo. La señal eléctrica
entregada por el electrodo
es medida y registrada en
forma continúa. Mediante el
agregado de patrones se
puede calcular la BOD de
una muestra incógnita. El
patrón es una mezcla
estandarizada de material
orgánico.

28
Biosensor microbiano para BOD

-60
-58

Biosensor response (mV)

-64
-60
-68

Biosensor response (mV)

-62
-72
-64
-76
Y = -77.48 + 0.374 X
-66 r2 = 0.991
0 10 20 30 40 50
-68 BOD5 (mg L )
-1

-70
-72
-74
-76
-78

0 50 100 150 200

Time (minutes)

Sensors and Actuators B 148 (2010) 103–109

29
 Biosensor para Toxicidad
Biosensores Biosensores Enzimáticos Basados
Microbianos
para la determinación de a)
toxicidad total están
basados en la
inhibición del
metabolismo, medido
como disminución de
la producción de luz en b)
bacterias luminiscentes,
disminución de la
respiración u otros
indicadores
metabólicos.
en dos principios básicos:
Utilizando una enzima que
degrada el tóxico que se quiere
medir. Por ejemplo, la enzima
polifenol oxidasa para medir
fenol
Utilizando la inhibición de la
actividad enzimática provocada
por diversos tóxicos en enzimas
sensibles; órgano fosforados y
carbamatos inhiben fuertemente
la acetilcolinesterasa
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 Biosensor para pesticidas basado
en inhibición enzimática Los organofosforados y
carbamatos son inhibidores
de la colinesterasa, enzima que
cataliza la hidrólisis de los
ésteres del neurotransmisor
acetilcolina. Los
organofosforados se unen a la
acetilcolinesterasa e inhiben su
actividad de manera
irreversible, tanto en los
glóbulos rojos como en el
plasma, por lo cual su
restauración depende de la
síntesis de nuevas moléculas
de la enzima, a diferencia de
Acetilcolina: La acetilcolina es el neurotransmisor específico de las los carbamatos en los que esta
sinapsis, tanto del sistema nervioso somático como en las sinapsis unión es reversible de manera
ganglionares del sistema nervioso autónomo y en los órganos diana de la espontánea
división parasimpática. La síntesis de acetilcolina tiene lugar en el botón
terminal y es metabolizada por la acetilcolinesterasa en el espacio
sináptico

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 Biosensor para pesticidas basado
en inhibición enzimática
La detección de cambios de pH muchas veces
no es útil, por ello la combinación con una
segunda enzima, como la colina oxidasa (que
toma la colina y la oxida, produciendo H2O2,
fácil de medir amperométricamente).

La acetilcolina es
degradada a colina y
acetato, por lo tanto el pH
de la solución circundante
se acidifica S. Sotiropoulou et al., Analytica Chimica Acta, 530, 14, 2005, 199-204
Órganofosforado usado como insecticida. 32
 Pocos biosensores de toxicidad en el mercado
Bio-Sensor model 7008. Algae Toximeter - Online
Biomonitoring Using
Green Algae

What These Fish Know

Can Hurt You!
Employing fish sensors,
the Bio- Sensor® detects
the presence of a broad
range of toxic substances.
Changes in ventilatory
behavior and certain
locomotor activities are
detected immediately
through noninvasive
electronic sensors in each
tank

bbe Moldaenke GmbH

Biological Monitoring, Inc. (BMI) Alemania
Virginia, USA

33
Laboratorio de Biosensores y
Bioanalísis

Gracias!
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