PRÁCTICA No.

CUANTIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS

1. INTRODUCCIÓN

Una vez se ha realizado la extracción de ADN, Y ARN para muchas

aplicaciones, se requiere conocer la cantidad y/o la calidad del acido nucleico
obtenido. Generalmente, se realiza mediante la medición de la cantidad de
irradiación ultravioleta absorbida por las bases y para verificar la calidad se
evalúa por electroforesis.

2. OBJETIVOS

• Identificar varios métodos de cuantificar ácidos nucleicos,

• Conocer la cantidad del ADN obtenido en la extracción realizada en
clase
• Adquirir conocimiento básico para el manejo y funcionamiento del
espectrofotómetro, para realizar la medición del acido nucleico en
estudio

3. MARCO TEORICO

Para cuantificar el material genético obtenido después de una extracción de

ácidos nucleicos o la síntesis química de un oligonucleico, se debe tomar una
lectura a longitudes de onda de 260 nm y 280nm. La lectura a 260nm permitirá
calcular la concentración de ácidos nucleicos en la muestra.

Se toma como referencia que una O.D. ( Densidad Óptica), medida a 260 nm,
corresponde aproximadamente a:

1 50 ug/ml de ADN de doble cadena,

2 40 ug/ml de ARN o de ADN de cadena sencilla
3 20 ug/ml cuando se trata de oligonucleotidos.

1 (A260) unidad de dsDNA=50 µg /ml

La proporción de la lectura entre 260 y 280 (OD 260/OD280) proporciona una

estimación de la pureza del acido nucleico. Es así como preparaciones puras
de ADN tienen OD 260/OD280 de 1.8. Cuando se trata de ARN el valor OD
260/OD280 es muy cercano a 2.0. Si hay contaminación con proteínas, fenol
u otras soluciones empleadas durante la extracción, el valor de la proporción
es menor a 1.8 y no es posible cuantificar de manera precisa el DNA.

Si no es posible cuantificarlo por este método por la poca cantidad de DNA

obtenido (<250ng/ml) o el DNA está contaminado con otras sustancias que
absorben radiación ultravioleta, se puede realizar utilizando fluorescencia
inducida por luz UV emitida por agentes que se intercala en el DNA, debido a
que la cantidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN en la
muestra . De esta manera, puede estimarse la cantidad de acido nucleico,
comparando la fluorescencia producida por muestra en estudio, con una serie
de estándares o patrones. La sensibilidad de este método es de 1 a 5 ng de
DNA.

Ejemplo:

De una solución del plásmido pUC19 se diluyo una alicuota a razon de 5µl /
1000µl en agua, las lecturas de absorbancia son: 260 = 0.789; 280 = 0.4475.

(xµg/ml) / (0.789) = (50µg / ml) / (1.0 OD) x= 19.74 µg/ml multiplicando por
(1000 µl / 5 µl) = 3948µg dsDNA/ ml

La relación A260 /A280 del dsDNA es 0.789 / 0.447 = 1.76

4. PRECAUCIONES

Asegurarse que el espectrofotómetro este calibrado y tenga la lámpara

adecuada en funcionamiento.
Las cubetas de cuarzo son extremadamente frágiles y costosas por lo cual
deben ser usadas con sumo cuidado y debe tener la preparación de lavado
adecuado.

5. PRE- LABORATORIO
• Cual es el fundamento de la cuantificación espectrofotométrica del ADN
• Porque se toman medidas en el espectrofotometro a 260 nm y 280 nm?
• En en plano cartesiano, Que tipo de curva espera observar al visualizar
el ADN en un espectrofotómetro
• Con que tipo de lámpara en el espectrofotómetro espera poder realizar
la medición?
• En que tipo de espectro se realiza la medición?
• Porque se utilizan cubetas de cuarzo para realizar esta medición?

6. MATERIALES REACTIVOS Y EQUIPOS

ADN obtenido con anterioridad

Micropipetas
Puntas estériles
Vortex
Microcentrifuga para viales de 1.5 ml
Guantes
Agua desionizada estéril
Solución TE
Espectrofotómetro
Cubetas de cuarzo
Toallas de papel o servilletas
Gradilla para tubos eppendorf 1.5 ml

7. PREPARACION DE REACTIVOS

Tris HCL pH 8.0 1M 10 ml

EDTA 0.5 M 10 ml
A partir de las anteriores soluciones preparar 5 ml de solución TE que
contiene: Tris HCL 10 mM y EDTA 1 mM

8. PROCEDIMIENTO

Prenda el espectrofotómetro con antelación, ya que requiere que las

lámparas estén preparadas antes de ser utilizado

• Tomar el ADN en estudio y realizar una dilución 1/10 en buffer TE.

Preparar 1ml de esta dilución.
• Colocar la solución de ADN en la cubeta de cuarzo.
Esta cubeta debe haber sido previamente lavada con 1 ml de extran
diluido 1/10 , agua destilada y purgada con solución TE. Si es
necesario, adicionar etanol absoluto para lograr su completo secado.
• En otra cubeta colocar como solución blanco, el TE si el ADN fue
rehidratado con este buffer o agua destilada, si fue esta la solución de
hidratación
• Realizar la medición a 260 nm y a 280 nm
• Realizar los cálculos respectivos.

9. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

• Investigue que otros métodos se utilizan en la actualidad para realizar

la cuantificación de acidos nucleicos, cuales son sus ventajas?

10.BIBLIOGRAFIA

1. Chomczynski P and Sacchi. 1987. Anal Biochem. 162: 156.

2. David, L.G. Dibner, M.D. & Battery, J.F. Basic methods in molecular
biology. Elsiever Science publishing Co. Ind. NY. 1986.
3. Sambrook, J. et al. 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd
edition, Cold Spring. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York,
4. Catálogos de PROMEGA para obtencion de caderna complementaria de
DNA.
5. Fundamentos moleculares en medicina. Fernando Lizcano Losada.Manual
Moderno. Universidad de la Sabana. 2005.
6. Biología molecular e ingenieria genetica. Texto ilustrado de biología molecular e
ingenieria genetica. Luque jose et l. Primera edicion. 2001.
11.AUTOEVALUACION.

NUMERO DE LOGRO FORTALEZAS DEBILIDADES SUGERENCIAS

LA PRACTICA (Objetivos A CADA
cumplidos) DEBILIDAD
SI NO