Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
Objetivos
Introducción
1
Prácticas de Bioquímica I Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea
Catalasa
2H2O2 O2 + 2H2O
Peroxido de hidrógeno
En los mamíferos esta enzima se encuentra en todo tipo de células, siendo su actividad
mayor en el hígado, riñón y eritrocitos. Un mol de catalasa puede descomponer 5.000.000 de
moléculas de H2O2 por minuto a 37°C, esto se conoce como número de recambio y representa
uno de los más altos de toda la enzimología.
desaparición del H2O2 puede estimarse por varios métodos, uno de ellos es el método
2
Prácticas de Bioquímica I Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea
MATERIALES Y REACTIVOS
- Matraces erlenmeyer
- Tubos de ensayo
- Embudo
- Bureta y soporte universal
- Gradilla
- Baños de calentamiento
- Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL.
- H2SO4 2 N
- Buffer fosfato 0,01 M, pH 3, 7 y 8. Debe contener H2O2 para gastar aproximadamente
15 mL de KMnO4 0,012 N.
- KMnO4 0,012 N
- Soluciones de KCN 10-2 M., 10-3 M., 10-4 M a pH 7 las cuales deben ser preparadas el
día de su uso.
Para obtener una preparación cruda y altamente activa de la enzima se sigue el siguiente
procedimiento:
1.- Pipetear 25 mL de agua destilada en un tubo de ensayo grande y enfriarla sobre hielo
picado.
2.- Con ayuda de una lanceta estéril, extraer sangre capilar (del dedo pulgar), descartar la
primera gota de sangre y luego pipetear 0,02 mL de sangre con una pipeta de Shalli.
3.- Agregar los 0.02 mL de sangre en los 25 mL de agua destilada fría. Lavar varias veces la
pipeta en el agua.
4.- Mantener la preparación de enzima en baño de agua helada con suficiente hielo para
prevenir el deterioro de la enzima.
3
Prácticas de Bioquímica I Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea
Experimentos.
a. Concentración de enzima.
b. Concentración de substrato.
c. Temperatura.
d. pH.
Experimento 1
mL
Frasco H2O2 Tiempo
Enzima H2SO4 2N gastados
N° pH 7 en min
KmnO4
1 5 mL 0,1 mL 5' 5 mL
2 5 mL 0,2 mL 5' 5 mL
3 5 mL 0,4 mL 5' 5 mL
4 5 mL 0,8 mL 5' 5 mL
5* 5 mL ----- 5' 5 mL
*Tubo control.
4
Prácticas de Bioquímica I Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea
b. Una vez agregada la enzima deberán transcurrir exactamente 5 minutos en cada frasco
para luego detener la reacción con ácido sulfúrico (en todos los frascos).
c. Titule los frascos con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado pálido permanente.
Efecto de la temperatura.
Toda reacción enzimática presenta una temperatura óptima la cuál es definida como la
temperatura a la cual la velocidad de la reacción es mayor, manteniendo constante los otros
factores. En este experimento se utilizaran tres temperaturas diferentes para observar el efecto
de la misma sobre la actividad de la catalasa.
a. Preparar tres series de tubos de ensayo (cada serie consta de dos tubos).
c. Agregar a cada uno de los tubos los reactivos y volúmenes indicados en la siguiente
tabla:
5
Prácticas de Bioquímica I Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea
mL
Tubo H2O2
Temperatura Enzima Tiempo H2SO4 2N gastados
Nº pH 7
KmnO4
1A 5 mL 10°C -- 5' 5 mL
1B 5 mL 10°C 0,5 mL 5' 5 mL
2A 5 mL 37°C -- 5' 5 mlL
2B 5 mL 37°C 0,5 mL 5' 5 mL
3A 5 mL 60°C -- 5' 5 mL
3B 5 mL 60°C 0,5 mL 5' 5 mL
d. Una vez agregada la enzima deberán transcurrir exactamente 5 minutos en cada frasco
para luego detener la reacción con ácido sulfúrico.
e. Transfiera el contenido de los tubos a frascos erlenmeyer y titule con KMnO4 hasta
Temperatura Velocidad de
°C reacción
(calculada)
10
37
60
Experimento 3
Efecto del pH
6
Prácticas de Bioquímica I Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea
mL gastados
Frasco H2 O2 H2 O2 H2O2
Enzima Tiempo H2SO4 2N KmnO4
N° pH 3 pH 7 pH 8
1A 5 mL -- --- -- 5' 5 mL
1B 5 mL -- --- 0,5 mL 5' 5 mL
2A -- 5 mL --- -- 5' 5 mlL
2B -- 5 mL -- 0,5 mL 5’ 5 mL
3A -- -- 5 mL -- 5’ 5 mL
3B -- -- 5 mL 0,5 mL 5’ 5 mL
c. Una vez agregada la enzima deberán transcurrir exactamente 5 minutos en cada frasco
para luego detener la reacción con ácido sulfúrico.
d. Titule con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado pálido permanente. Anote el
Velocidad de reacción
pH
(calculada)
3
7
8
7
Prácticas de Bioquímica I Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea
Experimento 4
Procedimiento:
mL gastados
Frasco H2 O2 H2 O H2SO4
Enzima Tiempo KmnO4
No. pH 7 destilada 2N
1A 1,25 mL 3,75 mL -- 5' 5 mL
1B 1,25 mL 3,75 mL 0,5 mL 5' 5 mL
2A 2,50 mL 2,50 mL -- 5' 5 mL
2B 2,50 mL 2,50 mL 0,5 mL 5' 5 mL
3A 5 mL --- -- 5' 5 mL
3B 5 mL --- 0,5 mL 5' 5 mL
c. Una vez agregada la enzima deberán transcurrir exactamente 5 minutos en cada frasco
para luego detener la reacción con ácido sulfúrico.
d. Titular con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado pálido permanente. Anote el
8
Prácticas de Bioquímica I Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea
Experimento 5
Efecto de la concentración progresiva del substrato sobre una sola concentración del
inhibidor
9
Prácticas de Bioquímica I Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea
KNC mL
Frasco H2O2
H2O -3 Enzima Tiempo H2SO4 2N gastados
N° pH 7 10 M KmnO4
1A 1,25 mL 3,75 mL 0,5 mL -- 5’ 5 mL
1B 1,25 mL 3,75 mL 0,5 mL 0,5 mL 5’ 5 mL
2A 2,50 mL 2,50 mL 0,5 mL -- 5’ 5 mL
2B 2,50 mL 2,50 mL 0,5 mL 0,5 mL 5’ 5 mL
3A 5 mL -- 0,5 mL -- 5’ 5 mL
3B 5 mL -- 0,5 mL 0,5 mL 5’ 5 mL
d. Una vez agregada la enzima deberán transcurrir exactamente 5 minutos en cada frasco
para luego detener la reacción con ácido sulfúrico.
e. Titule con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado pálido permanente. Anote el
Experimento 6
10
Prácticas de Bioquímica I Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea
c. Una vez agregada la enzima deberán transcurrir exactamente 5 minutos en cada frasco
para luego detener la reacción con ácido sulfúrico.
d. Titular con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado pálido permanente. Anote el
11
Prácticas de Bioquímica I Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea
Auto evaluación
1. ¿Como cree usted que será el efecto de las temperaturas 15°C, 37°C y 60°C sobre la
actividad enzimática de la catalasa sanguínea?
2. Explique que diferencia existe entre los tubos controles y experimentales de esta práctica.
Bibliografía
12