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Universidad Nacional Autónoma de

México

Facultad de Estudios Superiores

Zaragoza

Laboratorio de Genética Clínica

Practica 1:
Extracción y Cuantificación de Ácidos Nucleicos

Equipo 8
González Genis Diana
Herrera Pérez Sergio Alfonso
Valenzuela Martínez Eréndira

Ciudad de México a 1 de marzo de 2019


Objetivos
● Extraer y purificar ácidos nucleicos a partir de diversos tejidos biológicos, usando sus
propiedades fisicoquímicas.
● Cuantificar los ácidos nucleicos extraídos durante el desarrollo de la práctica.
● Comprender la importancia y fundamento de la función que llevan a cabo los ácidos
nucleicos.

Introducción
Los ácidos nucleicos son macromoléculas de elevado peso molecular constituidas por unas
unidades básicas llamadas nucleótidos unidos mediante enlaces fosfodiéster y se clasifican de
la siguiente manera:

Imagen 1. Clasificación general de los ácidos nucleicos

Los nucleótidos a su vez están constituidos por tres grupos: pentosas (Ribosa en el ARN,
Desoxirribosa en el ADN), ácido fosfórico y bases nitrogenadas. Un polinucleótido es un
polímero de nucleótidos unidos mediante enlaces fosfodiéster, que se establecen entre el –
OH del carbono 5’ de la pentosa de un nucleótido y el –OH del carbono 3’ de la pentosa del
nucleótido siguiente. La unión de una pentosa y una base nitrogenada constituyen un
nucleósido.
Las bases nitrogenadas son heterocíclicos y son de dos tipos: bases púricas que derivan de la
purina y bases pirimidínicas que derivan de la pirimidina.

Imagen 2. Bases púricas y pirimidínicas.


Estructura ADN
El ADN es un polinucleótido compuesto por desoxirribonucleótidos de adenina, guanina,
citosina y timina. Mientras que en el ARN está compuesto por ribonucleótidos de adenina,
guanina, citosina y uracilo.
El ADN tiene un elevado peso molecular y presenta varios niveles estructurales. Entre estos
niveles tenemos la estructura primaria que es la secuencia de nucleótidos de una cadena de
ADN. Presenta un esqueleto de fosfatos y pentosas del que parten las bases nitrogenadas (A,
G, C, T). Estas bases se encuentran en igual porcentaje en todos los seres vivos de una
misma especie, por lo que su mensaje genético es semejante. En la estructura primaria reside
la información necesaria para la síntesis de proteínas.
Adenina se une a Timina mediante 2 puentes de Hidrógeno. A = T C se une a Guanina
mediante 3 puentes de Hidrógeno ( C ≡ G).
Mientras que la estructura secundaria Es la disposición espacial que adoptan dos cadenas de
polinucleótidos (hebras) dispuestas en doble hélice y con las bases enfrentadas y unidas
mediante puentes de hidrógeno. La doble hélice da una vuelta cada 34 Å y la distancia entre 2
pares de nucleótidos es de 3.4 Å, por lo que habrá 10 pares por vuelta, y su diámetro es de 20
Å y los cambios o mutaciones en la secuencia de nucleótidos alteran la información genética.
Propiedades del ADN
● Estabilidad: En condiciones normales la molécula de ADN es muy estable. Pero para
que se produzca la duplicación es necesaria la separación de las dos cadenas, y lo
mismo para la transcripción (formación de ARN mensajero).
● Desnaturalización: Si el ADN se somete a temperaturas superiores a los 100 ºC se
rompen los puentes de hidrógeno que unen las bases, separándose las dos cadenas.
Ocurre lo mismo con variaciones de pH . Los enlaces fosfato-pentosa-base no se
rompen.
● Renaturalización: Si se restablecen las condiciones iniciales, el ADN recupera su
estructura.
● Hibridación: Si se desnaturaliza una mezcla de ADN de distintas especies, en la
renaturalización aparecerán formas híbridas. Esto se llama hibridación del ADN.
Imagen 3. Estructura del DNA

ARN
Es un polinucleótido compuesto por ribonucleótidos de Adenina, Guanina, Citocina y Uracilo,
nunca Timina. Es monocatenario, excepto en algunos virus, por lo que presenta estructura
primaria, y los nucleótidos se unen siempre en la dirección 5’→ 3’. A veces se enrolla en doble
hélice, presentando estructura secundaria y otras veces se asocia a proteínas, por lo que tiene
estructura terciaria.
Transcripción es la formación de ARN a partir del ADN. Y la traducción es la formación de
proteínas según la información del ARN mensajero. Existen varios tipos de ARN:
● ARN mensajero (ARNm): Es una molécula corta y lineal de hasta 5000 nucleótidos, de
vida corta y estructura primaria. Se origina a partir del ARN heterogéneo nuclear, que
es complementario de un fragmento de ADN, por lo que contiene su información
genética. .
● ARN transferente (ARNt) está formado por moléculas pequeñas. Su función es captar
aminoácidos específicos en el citoplasma y transportarlos hasta los ribosomas, donde,
siguiendo la secuencia dictada por el ARNm, se sintetizan las proteínas.
● ARN ribosómico (ARNr): Es el más abundante y se encuentra asociado a proteínas
formando los ribosomas. Su función es formar los ribosomas donde se realizará la
síntesis de proteínas. En células procariotas los ribosomas son 70S, formados por dos
subunidades, 30S y 50S.
Metodología
Extracción de ADN
Extracción de DNA en papel FTA

Extracción de ARN
Hidratación y cuantificación de ADN
Hidratación y cuantificación de ARN

Resultados
● DNA
Tabla 1. Concentración μg/mL de DNA a partir de sangre

Longitud de Absorbancia Concentració


onda (nm) n
μg/mL

260 0.299 2.39

280 0.299

𝑃𝑃𝑃 260
𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 = 𝑃𝑃𝑃 280
0.999
𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 = 0.999 = 1

● RNA
Tabla 2. Concentración μg/mL de RNA por método Chomczynsky y Sacchin

Longitud de Absorbancia Concentració


onda (nm) n
μg/mL

260 0.468 4.68

280 0.475

Imagen 4. Obtención de ADN por Técnica “DNAIQ”


Análisis de Resultados
Para los métodos por extracción orgánica de DNA, se obtuvo un precipitado blanquecino
resultado de la precipitación de DNA por etanol. Al cuantificar por espectrofotometría de luz
UV a una longitud de onda de 260 nm, resultó una concentración de 2.39 μg/mL.
Para estimar la pureza del ADN se considera la proporción de la absorbancia a 260 nm y 280
nm. Una proporción de 1.8 es aceptada como ADN puro; sin embargo en este caso la pureza
fue de 1 indicando presencia de proteínas, a causa de la ineficaz separación de proteínas y
lípidos mediante fenol-cloroformo-alcohol isoamílico.
La concentración de RNA fue 4.68 μg/mL, aunque varios factores pueden incidir en la
concentración del ARN que se obtiene tras el proceso de extracción y purificación. Entre ellos:
la cantidad de células, el volumen de muestra que se extrae y la conservación óptima de la
muestra. Por las razones anteriores, no es posible predecir la concentración, ni recomendable
prescindir de la cuantificación.
En cuanto a la técnica por DNAIQ no se obtuvieron resultados de concentración de ADN, lo
que indica que el procedimiento no fue el adecuado, ya que posiblemente se perdió el material
genético al momento de realizar los lavados, pues al quitar los sobrenadantes en cada etapa
también se desechó parte de la resina que contenía el ADN. Otra causa pudo haber sido que
el cartucho que se utilizó ya tenía algunos componentes secos y se tuvo que cambiar dos
veces de cartucho, por ello la resina no funcionó que debía hacerlo y se perdió todo el
material genético.

Para el método de separación de ADN en el papel FTA, el papel quedo blanquecino y se


guardó para su utilización como molde en la amplificación por PCR.

Conclusiones
La extracción de ADN íntegro y sin contaminantes es esencial para tener éxito en la obtención
de datos genéticos, es el primer paso en la lista de técnicas moleculares que nos llevarán a
comprender mejor y conservar la diversidad biológica a partir del conocimiento de genes y
genomas que anteriormente era inaccesible para le ecología y la evolución.
El uso de los métodos modernos de extracción y preservación permite mejorar la precisión,
obtener resultados reproducibles y reducir el tiempo de extracción, y aumentar el tiempo de
preservación sin alterar las propiedades del DNA.
Por ejemplo el sistema de DNAIQ que permite obtener una muestra de ADN más limpio
independientemente de donde se obtenga la muestra y así poder cuantificarlo con exactitud,
evitando el uso de solventes dañinos. Además de que se pueden procesar mayor cantidad de
muestras en un menor tiempo.
Bibliografía
1. Illana J. Biología molecular y estructura del ADN [Internet]. 1st ed. Real Sociedad
Española de Quimica; 2014 [cited 28 February 2019]. Available from: http:/www.Dialnet-
BiologiaMolecularYEstructuraDelADN-6072412.pdf
2. Smcg.ccg.unam.mx. 2019 [cited 28 February 2019]. Available from:
http://smcg.ccg.unam.mx/enp-unam/01-IntrodYEvolucion/structfuncDNA.pdf
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