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18• Isolement et identification

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des bactéries anaérobies


Plan du chapitre il ne peut se développer dans le tube digestif.
1• Contextes cliniques La destruction d'une flore de barrière par une
2• Objectifs antibiothérapie permettra sa multiplication et
3• Méthodes de mise en évidence la sécrétion des toxines.
4• Sensibilité aux antibiotiques © les intoxinations (Clostridium botulinum).
C'est l'ingestion de la toxine préformée qui
Les bactéries anaérobies sont responsables d'une est responsable de la maladie.
grande variété d'infections localisées ou générali-
➥ Les infections mixtes : elles se développent au
sées. Dans plus de 80% des cas il s'agit d'une infec-
voisinage des muqueuses. Les anaérobies strictes
tion mixte, associant bactéries aérobies ou aéro-
sont associées à d’autres bactéries, elles peuvent
anaérobies et anaérobies strictes.
se compliquer de métastases infectieuses à dis-
La plupart de ces bactéries se développent lente-
tance.
ment. Leur isolement et leur identification deman-
dent un certain délai. Leur mise en évidence reste
2• Objectifs
toujours délicate.
Un certain nombre d'indices permettent de suspecter * Isolement et identification des bactéries anaéro-
leur présence : bies strictes :
• mauvaise odeur des échantillons, présence de • La recherche des anaérobies ne se pratique ni
gaz dans la lésion, pour les intoxications ni pour les toxi-infec-
• localisation de la suppuration (abcès sous maxil- tions d'origine exogène. Le diagnostic est
laire ou cervical, pleurésie purulente, péritonite, essentiellement clinique.
abcès de la sphère gynécologique). • L’origine des infections à anaérobies est
Les échecs de culture sont fréquents, les principales essentiellement endogène, la composition de
causes en sont : mauvais prélèvements, mauvaises ces flores est importante à considérer car de
conditions de transport, méthodes de culture inadé- sa connaissance dépende la nature des
quates, malgré l'utilisation d'enceintes anaérobies espèces isolées dans leur voisinage
(jarre ou chambre). (tableau 1).
* Les bactéries anaérobies sont surtout recher-
1• Contextes cliniques chées dans les prélèvements suivants :
• hémocultures,
Deux grands types d'infections :
• liquides de ponction (pleurale, péricardique,
➥ Les infections à Clostridium sécréteurs de
articulaire),
toxines. Ils sont généralement d'origine exogène.
• abcès du poumon : dans la mesure où le pré-
Ils survivent dans la nature grâce à leur spore.
lèvement a été réalisé grâce à une technique
On distingue :
protégeant le prélèvement de la contamina-
© les toxi-infections (Clostridium tetani , tion bucco-dentaire),
Clostridium perfringens, Clostridium diffici - • ostéite,
le). Le germe pénètre dans l'organisme à l'oc-
casion d'une blessure (Clostridium tetani), il • abcès du cerveau,
se développe localement, sécrète sa toxine • péritonite,
qui provoque la maladie (tétanos). • abcès abdominaux ou gynécologiques.
C. perfringens responsable des gangrènes Les anaérobies ne doivent pas être recherchés dans
gazeuses (myonécroses, cellulites, fasciites), un prélèvement hébergeant habituellement une flore
pénètre à l'occasion de blessures mais peut commensale : crachats, selles, prélèvements vagi-
être d'origine endogène secondaire à des naux.
lésions de la paroi digestive. Clostridium dif - La recherche de C. difficile lors d’une diarrhée au
ficile pénètre dans l'organisme par voie décours d'un traitement antibiotique est un cas parti-
digestive mais dans des conditions normales culier.
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Tableau 1 : Les anaérobies de la flore endogène (d’après SM Finegold)

Peau Flore buccale


Propionibacterium acnes +++ Prevotella pigmentées
Peptostreptococcus spp Porphyromonas spp
Prevotella groupe oralis
Fusobacterium nucleatum
Peptostreptococcus spp
Eubacterium spp
Actinomyces spp
Flore vaginale
Lactobacillus : +++ Flore colique
Prevotella bivia, P. disiens
Bacteroides groupe fragilis +++
Prevotella pigmentées
Bilophila wadsworthia
Peptostreptococcus spp
Peptostreptococcus spp
Clostridium spp
Bifidobacterium spp
+++ : germe dominant Eubacterium spp

3• Méthodes de mise en évidence Après prélèvement, il faut veiller à :


des anaérobies © empêcher la dessiccation du produit patholo-
gique,
1- Prélèvement et transport © protéger les bactéries de l’oxygène de l’air.
L’une des principales causes d’échec d’isolement des Le milieu de transport idéal doit préserver la multi-
bactéries anaérobies est la mauvaise qualité du pré- plication ultérieure des anaérobies, mais aussi des
lèvement et/ou du transport. aérobies.
La recherche de ces bactéries peut se faire soit sur un Il doit contenir des substances réductrices.
prélèvement aspiré : seringue ou pipette (les pipettes La plupart des milieux de transport commercialisé
en plastique ont des propriétés oxydantes qui les ren- ont pour base le milieu de Stuart. Les meilleurs
dent toxiques pour les bactéries anaérobies), soit sur milieux sont gélosés: Portagerm (bioMérieux), TGV
un écouvillon (écouvillon d'alginate ou en dacron), il anaérobie (Sanofi-Pasteur), Port A Cul (Becton
doit être obligatoirement placé dans un milieu de Dickinson).
transport. Le mieux est d’utiliser une seringue pur-
gée d’air. 2- Méthodes d'orientation rapide
Les prélèvements à la seringue ou à la pipette ont L'isolement et l'identification demandent un délai de
deux avantages par rapport aux prélèvements sur quelques jours à quelques semaines.
écouvillon : Il importe de signaler rapidement la présence des
© ils permettent de prélever le pus au niveau du anaérobies dans un prélèvement.
foyer infecté, en évitant la contamination par les © L'aspect du pus est souvent très évocateur : pus
flores du voisinage, ce qui est plus délicat avec abondant d'odeur nauséabonde.
un écouvillon,
© L'examen du frottis après coloration par la
© ils évitent la dessiccation ou la rétention de bac- méthode de Gram.
téries dans l’écouvillon, et l’exposition à l’oxy-
gène, © La flore bactérienne est abondante et poly-
morphe associant des bacilles et des cocci à
© ils permettent de noter les caractères organolep- Gram positif et négatif.
tiques.
Trois aspects peuvent se rencontrer :
En pratique cependant, l’écouvillon demeure un
- le pus est très évocateur avec une flore poly-
moyen de prélèvement utilisé.
morphe typique (60% des suppurations),
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- la flore peu abondante mais associant plu- © Pour les Clostridium : TSN, gélose au jaune
sieurs catégories de bactéries (20 à 30% des d'œuf et néomycine, Columbia au sang avec
suppurations), cyclosérine et cefoxitine pour C. difficile.
- l'examen direct non évocateur, les cultures Certaines bactéries peuvent avoir des difficultés à se
sont monomicrobiennes (10 à 15% des cas). développer sur une gélose au sortir de l'organisme. Il
© On peut utiliser des méthodes immuno-enzyma- faut toujours associer un bouillon anaérobie à un
tiques pour Clostridium difficile pour mettre en milieux gélosé. Ce bouillon est repiqué après 48 à
évidence les toxines dans les selles. 72 heures sur des géloses sélectives.
© La localisation de la suppuration permet de pré- ➥ Les conditions d’anaérobiose
juger des anaérobies que l'on peut isoler Il existe actuellement des sachets permettant de
(tableau 2). faire l'anaérobiose en moins d'une demi heure
sans catalyseur.
3- Mise en culture
Elle est réalisée dans des jarres ou des sacs en
➥ Les milieux plastique fermés hermétiquement.
L'isolement nécessite des milieux gélosés, conte- Les chambres anaérobies sont très utiles, mais
nant de nombreux facteurs de croissance et ren- pas indispensables pour l'isolement des anaéro-
dus sélectifs grâce à l'addition d'antibiotiques. bies, elles nécessitent une surveillance constante.
Il est important de toujours utiliser des milieux L’alternative peut être réalisée par un système
désoxygénés (régénérés), fraîchement préparés et permettant de faire le vide dans une jarre et d'in-
conservés en anaérobiose avant leur utilisation. jecter un mélange gazeux.
Différents milieux ont été proposés, ils peuvent Il est nécessaire de bien vérifier l'anaérobiose
être limités : réalisée à l'aide d'un indicateur d'oxydo-réduc-
tion (bande de papier buvard imprégné de bleu
© Milieu gélosé pour les bacilles à Gram néga-
tif (exemple Schaedler au sang avec vanco- de méthylène ou de résazurine).
mycine (7,5 mg/l) et néomycine (75 mg/l)). 4- Identification
Ce milieu permet l'isolement des Bacteroides
du groupe fragilis, des Prevotella, des L'identification s’effectue en deux temps :
Fusobacterium. ➥ Identification présomptive
© Gélose Columbia au sang et au phényléthyl- Elle utilise des méthodes simples accessibles par
alcool (4,2 g/100 ml) spécifique des bactéries tous les laboratoires :
à Gram positif et des Porphyromonas.

Tableau 2 : Répartition des anaérobies dans les suppurations mixtes


Suppurations Pus Pneumonie Abcès du poumon Tête Tissus
abdominales gynécologiques de déglutition Pleurésie purulente et cou mous
Bacteroides fragilis +++ (+) / + (+) +
B. du groupe fragilis ++ (+) (+) + (+) +
Prevotella bivia / +++ / 0 0
Prevotella oralis / + +++ +++ ++ +
Porphyromonas spp / + (+) (+) + ++
Fusobacterium nucleatum / + ++ +++ ++ /
Fusobacterium necrophorum / / / / ++ /
Peptostreptococcus spp + ++ ++ ++ ++ ++
Actinomyces spp / ++ + ++ ++ (+)
Clostridium perfringens ++ / + / 0 +
+++ : espèce présente dans la majorité des prélèvements
+ à ++ : présence dans 20 à 80 % des prélèvements
(+) : espèces isolées dans 10 à 20 % des prélèvements
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© étude de la mobilité entre lame et lamelle en


Tableau 3 : Antibiotiques à étudier
contraste de phase, pour une bactérie anaérobie
© coloration de Gram, Bacteroides amoxicilline
© recherche d'une oxydase et d'une catalase, du groupe fragilis amoxicilline + ac. clavulanique
céphamycine
© croissance en présence d'antibiotiques (kana- (céfoxitine ou céfotétan)
mycine, colistine, vancomycine) ou d'inhibi- céfotaxime
teurs (bile, vert brillant), imipénème
clindamycine
© étude de la fermentation des sucres, de la
métronidazole
production d'indole et d'une gélatinase à l'ai-
de d'une galerie miniaturisée, Autres bacilles amoxicilline
à Gram négatif amoxicilline + ac. clavulanique
© étude des caractères enzymatiques grâce à (Prevotella, métronidazole
une galerie d'identification rapide. Fusobacterium)
Les bactéries les plus fréquentes sont identifiées Cocci à Gram + pénicilline
par ces méthodes simples à mettre en œuvre : et Bacilles à Gram + métronidazole
Bacteroides fragilis, Bacteroides ureolyticus, non sporulé vancomycine
(Propionibacterium, ofloxacine
Prevotella melaninogenica, Prevotella bivia,
Actinomyces) (pour Propionibacterium)
Fusobacterium nucleatum, F. necrophorum,
Porphyromonas gingivalis, Bilophila wadswor - Clostridium ampicilline
amoxicilline + ac. clavulanique
thia, Clostridium perfringens, Clostidium diffici -
métronidazole
le, Propionibacterium acnes, Actinomyces meye - vancomycine
ri. clindamycine
Cette orientation présomptive permet la détermi-
nation du genre bactérien de la grande majorité
des anaérobies (ce qui est souvent suffisant).
➥ Identification définitive Bibliographie
L'identification précise de certaines espèces est BARTLETT J.G. Anaerobic bacterial infections of the
plus délicate et nécessite des examens complé- lung and pleural space. Clin. Infect. Dis. 1993; 16,
mentaires : chromatographie en phase gaseuse, 248-255
biologie moléculaire. BROOK I. Comparison of two transport systems for
recovery of aerobic and anaerobic bacteria from
4• Sensibilité aux antibiotiques absceses. J. Clin Microbiol. 1987; 25-2020-2022.
CITRON D.M. Specimen collection and transport,
Les bactéries anaérobies provoquent un nombre Anaerobic culture techniques, and identification of
important d'infections qui nécessitent une thérapeu- anaerobes. Rev Infect Dis. 1984; 6- S51 -S58.
tique spécifique. JOUSIMIES-SOMER H.R., FINEGOLD S.M. Problems
encountered in clinical an aerobic bacteriology. Rev
Les Bacteroides du groupe fragilis sont résistants à Infect Dis. 1984; 6- S45 - S49.
de nombreux antibiotiques. Certaines espèces sont SÉDALLIAN A. Mise en évidence des bactéries anaé-
sécrétrices de ß-lactamases, d'autres sont résistantes robies. Rev. Franç. Lab. 1993; 255 : 21-24
au métronidazole. L'isolement, l'identification et la SUMMANEM P., BARON E.J., CITRON D.M.,
détermination de la sensibilité aux antibiotiques sont STRONG C.A., WEXLER H.M., FINEGOLD S.M.
aussi importants pour ces bactéries que pour les Wadsworth Anaerobic Bacteriology Manual 5° ed,
autres pathogènes (tableau 3). Star publishing company, Belmont California (USA),
1993.