DETERMINACION Y DIFERENCIACION DE ESCHERICHIA COLI Y

COLIFORMES TOTALES USANDO UN MISMO SUSTRATO

CROMOGENICO
GOEZ LOPEZ, Mariano; VÁZQUEZ GARCÍA, María José; PENA CAAMAÑO, Pilar
Laboratorio Central. Aquagest Galicia.
Rua Isidro Parga Pondal 7
E-15702 Santiago de Compostela (España)
email: mgomezl@www.agbar.es

INTRODUCCIÓN

La próxima entrada en vigor de la Directiva 95/C 131/03 [1], sobre la calidad de las aguas
destinadas al consumo público, que obliga a la determinación individual de la Escherichia coli, además
de las coliformes totales supone, para las empresas suministradoras de agua, la adopción de nuevas
estrategias de medida de dichas bacterias. Esta nueva reglamentación modifica a las nacionales de
diversos países de la CEE y USA [2-6], que hasta este momento exigían solo la determinación de
coliformes fecales y coliformes totales y, se adapta a las nuevas recomendaciones que la OMS [2] dio
para la calidad bacteriológica de aguas potables en 1993. Estas directrices se enmarcan dentro de
nuevos criterios de contaminación, según los cuales los organismos coliformes se analizan solo como
señalizadores de la eficacia del tratamiento y la integridad del sistema de distribución no como
indicadores de la presencia de patógenos, mientras que los organismos coliformes termotolerantes, en
este caso los E. coli se analizan como indicadores de polución fecal.
Hasta este momento, en casi todos los laboratorios de estas empresas se determinan
coliformes totales y coliformes fecales de acuerdo con la definición siguiente: todo bacilo gramnegativo,
capaz de desarrollarse en presencia de sales biliares u otros agentes (tensioactivos) que tengan
propiedades similares inhibitorias del crecimiento y que sean capaces de fermentar la lactosa a
temperaturas de 35º ó 37ºC, con producción de ácido, gas y aldehido en un lapso de 24 a 48 horas;
también son oxidasa negativas, no esporágenas y reducen el nitrato a nitrito. Este grupo comprende,
según la clasificación de Clark y Pagel los géneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y
Enterobacter pertenecientes a la familia de las enterobacterias. Sin embargo, hay autores que discrepan
de esta clasificación como Lecrerc y Mossel [7] que incluyen Serratia y Buttiauxella.
 En 1904, Eijkman [8] propuso que la producción de gas a partir de glucosa a 46º C podría
ser un buen método para la determinación de coliformes de origen fecal. Una modificación de este
método sirve para definir las bacterias coliformes fecales termotolerantes, que son las que poseen las
propiedades antes citadas a una temperatura de 44º ó 45ºC. Estas últimas, cuando fermentan tanto la
lactosa como otros sustratos adecuados, como el manitol, a las mismas temperaturas con producción de
ácido y gas y que también forman indol a partir del triptófano, se consideran como E. coli presuntivas.
Se puede confirmar que se trata de E. coli mediante la demostración de un resultado positivo en la
prueba del rojo de metilo, al no producir acetilmetilcarbinol y no utilizar citrato como única fuente de
carbono. Estas no son definiciones taxonómicas sino prácticas de trabajo que se usan en el análisis del
agua y, en ese sentido, están comprendidos miembros de diversos géneros. Así por ejemplo, algunos
organismos que desde el punto de vista taxonómico se identificarían como coliformes no serán
reconocidos como tales cuando se analizan en el agua, como también algunas cepas de E. coli que no
son termotolerantes. En estos ejemplos se incluyen especies de bacterias coliformes que son
anaerogénicas y algunas que no fermentan la lactosa. Dentro de los coliformes termotolerantes aparte
de la E. coli, se pueden encontrar, entre otros menos frecuentes, Citrobacter freundii y Klebsiella
pneumoniae.

IMPORTANCIA DE LOS ORGANISMOS COLIFORMES

El uso de organismos intestinales normales como indicadores de contaminación fecal, en

lugar de los patógenos mismos, es un principio de aceptación universal en la vigilancia y evaluación de
la seguridad microbiana en los sistemas de abastecimiento de agua. Lo ideal sería que el hallazgo de
dichas bacterias indicadoras denotara la presencia posible de todos los organismos patógenos
pertinentes. Las exigencias a las que debe responder un organismo indicador las podemos agrupar en:

Epidemiológicas: La relación entre un indicador, su naturaleza o concentración y la

probabilidad de aparición de infecciones en la población debe establecerse a partir de estudios o
encuestas epidemiológicas.

Ecológicas: Un buen indicador debe ser específico de contaminación fecal; debe

hallarse de forma constante en las heces de los animales de sangre caliente y estar asociado de forma
exclusiva a las aguas residuales. Es decir, su presencia en ambientes no polucionados debe ser mínima
o nula.

2
 Bacteriológicas: Los organismos indicadores deben ser más resistentes que los
patógenos a los agentes desinfectantes y por otra parte, ser incapaces de reproducirse o crecer, en el
ambiente acuático.
Taxonómicas: Los organismos indicadores deben ser fácilmente reconocibles y
clasificables en especies de acuerdo con los criterios bacteriológicos existentes. Es decir, cuando un
organismo indicador corresponda a una población de determinados organismos, ésta debe estar
perfectamente definida.

Metodológicas: Un buen organismo indicador debe ser fácilmente aislable,

identificable y enumerable en el menor tiempo posible y con el menor coste. Debe ser capaz de crecer
en los medios de cultivo empleados, estar distribuido al azar en las muestras y ser resistente a la
inhibición de su crecimiento por otras especies.

En la práctica, todos estos criterios no pueden darse en un solo organismo, aunque las
bacterias coliformes cumplen muchos de ellos: están siempre presentes en aguas que contienen
patógenos entéricos, su tiempo de supervivencia es muy superior al de microorganismos productores de
enfermedades: Mc Feters y colaboradores [9] señalan que mientras un coliforme sobrevive una media
de 17 horas, una Salmonella typhi tiene una vida media de 6 horas y un Vibrio cholerae tiene una vida
media de 7,2 horas, razón por la cual puede suponerse que en la mayoría de los casos en los cuales el
agua no contenga coliformes estará libre de bacterias productoras de enfermedades. Por otra parte, el
mejor indicador conocido de contaminación fecal de origen humano o animal es la presencia de
coliformes fecales, ya que las heces contienen dichos microorganismos, presentes en la flora intestinal,
y, de ellos, entre un 90% y un 100% son E. coli mientras que en aguas residuales y muestras de agua
contaminadas este porcentaje disminuye hasta un 59% [10]. De echo, un gramo de heces humanas
contiene entre 5*109 y 5*1010 bacterias. Es decir, más del 40% del peso húmedo de las heces
humanas está compuesto de células bacterianas.
Si bien las bacterias coliformes pueden no tener relación directa con la presencia de virus
en aguas potables, el uso de la prueba coliforme sigue siendo esencial para vigilar la calidad microbiana
del agua en los sistemas de abastecimiento. Se sabe que los quistes de algunos parásitos son más
resistentes a la desinfección que los organismos coliformes. La ausencia de estos últimos en agua de
superficie que solamente ha sido desinfectada no significa necesariamente que también haya ausencia
de quistes de Giardia, amebas u otros parásitos. Es preciso tener en cuenta que las bacterias coliformes
no provienen solo de las heces de los animales de sangre caliente, sino también de la vegetación y el
suelo [11-13]. Bajo ciertas condiciones, dichas bacterias pueden también persistir en nutrientes que
provienen de materiales de construcción no metálicos. Por las razones expuestas, la presencia de

3
algunos microorganismos coliformes (1-10 ufc/100ml), especialmente en aguas subterráneas que no
hayan sido tratadas, puede tener poca importancia desde el punto de vista sanitario, siempre que haya
ausencia de organismos coliformes fecales.
También se han encontrado relaciones entre la E. coli y la fauna heterótrofa presente en el
agua, de tal suerte que en experiencias de laboratorio se ha podido comprobar que en agua esterilizada
en autoclave el número de E. coli presentes es inversamente proporcional al número de bacterias
heterótrofas presentes [14]. Este resultado se refleja claramente en el gráfico 1:

Período de Supervivencia de la E. coli

en agua de mar esterilizada tras la adición de bacterias marinas

5 Agua de mar esterilizada en autoclave + 100.000 bacterias marinas por mL

Colif. 1/L.

Agua de mar esterilizada en autoclave + 1000 bacterias marinas por mL

Agua de mar esterilizada en autoclave + 10 bacterias marinas por mL

4
Agua de mar esterilizada en autoclave

2
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Días
Microbiologia de las aguas
G. Rheinheimer

Existen otros organismos que satisfacen algunos de estos criterios, aunque sin alcanzar el
grado de satisfacción de las bacterias coliformes, y que en determinadas circunstancias, pueden usarse
también como indicadores suplementarios de contaminación fecal. El significado que puede adjudicarse
a la presencia o ausencia de determinados indicadores fecales varía con cada organismo y
especialmente con el grado de relación que dicho organismo guarda con las heces.

IMPORTANCIA DE LA ESCHERICHIA COLI

Además de las características ya citadas, de todos los organismos coliformes, solo los E.
coli tienen un origen específicamente fecal, pues están siempre presentes en grandes cantidades en las
heces de los seres vivos de sangre caliente y rara vez se encuentran en agua o suelo que no haya
sufrido algún tipo de contaminación fecal. Por tanto, se considera que la detección de éstos como
organismos fecales o la presunción de E. coli constituye una información suficiente como para estimar
la naturaleza fecal de dicha contaminación. Es poco probable que en el sistema de explotación se

4
desarrollen nuevamente organismos fecales [15], salvo que existan los suficientes nutrientes bacterianos
( DBO > 14 mg/L, T>13ºC y no haya cloro libre residual). Sin embargo, estudios recientes inyectando E.
coli en sistemas de distribución, han demostrado que una vez contaminado éste, al cabo de unos diez
días, se produce acumulación de bacterias en el biofilm de las tuberías. Pese a todo, la colonización de
la red por dicho microorganismo es sólo parcial y transitoria [16]
Flanagan [6] ha resumido la interpretación de la presencia de E. coli como sigue: "Cuando
los E. coli están presentes en un gran número, la interpretación es que ha tenido lugar una polución
fuerte y/o reciente por desechos animales o humanos. Si el número de E. coli es pequeño indica que la
polución, del mismo tipo, es menos reciente o menos importante. Si se detectan coliformes pero no E.
coli señala que la polución es reciente pero de origen no fecal o de origen fecal pero lejana, de modo
que los coliformes intestinales no han sobrevivido".
Otra característica importante de las E. coli, es que pueden ser vectores de algunas
enfermedades. en este caso se trata de E. coli patógenos, de los cuales existen muchos serotipos
diferentes capaces de causar gastroenteritis en humanos y animales, siendo éstas especialmente serias
en recién nacidos y niños de edad inferior a 5 años. Pese a que se considera que los E. coli patógenos
representan menos del 1% del total de coliformes presentes en el agua contaminada, basta con 100
organismos para causar una enfermedad.
La importancia de este microorganismo queda patente en muchos casos a lo largo de la
historia. Desde que Bray publicó en 1.945 el primer estudio epidemiológico sobre la presencia de cepas
de E. coli en 42 de los 44 recién nacidos con diarrea que estaban ingresados en un hospital londinense,
se han descrito muchos episodios de trastornos debidos a la contaminación producida por esta bacteria.
[17-18]. Una extensa revisión de la importancia de este microorganismo y las características de sus
serotipos puede encontrarse en la referencia [17].
Entre los diversos tipos de E. coli patógenos podemos diferenciar:

E. coli enteropatogénico (EPEC): Son aquellas cepas asociadas a diarreas infantiles,

denominadas a menudo gastroenteritis infantiles (GEI), que se presentaron en forma epidémica en la
década de los 40 en los países industrializados, decreciendo a partir de 1.970.

E. coli enterotoxigénico (ETEC): Son E. coli capaces de producir enterotoxinas LT

(enterotoxina termolábil), bastante parecida a la toxina del cólera y ST (enterotoxina termoestable), que
parece encubrir a un grupo de varias tóxinas parecidas. En la actualidad los E. coli ETEC constituyen
una de las principales causas de diarrea infantil en los países en vías de desarrollo. En los países
industrializados estas epidemias son excepcionales. Son también los agentes más frecuentes de la

5
llamada diarrea del viajero; enfermedad que se produce habitualmente a los 4-6 días de llegada a otro
país, generalmente tropical.

E. coli enteroinvasivas (EIEC): Algunas cepas de E. coli pueden ser responsables de un

cuadro clínico disentérico similar al de Shigella. La enfermedad se caracteriza por signos de toxemia
con malestar, fiebre, intensos dolores intestinales y heces acuosas con sangre, mucus y pus. Estas
cepas de E. coli pertenecen a un número limitado de serotipos y se parecen por sus características
bioquímicas, antigénicas y por su comportamiento en modelos experimentales a las Shigellas aunque se
diferencia de éstas por dar negativo el test de la lisina descarboxilasa. Se denominan enteroinvasivas ya
que tras establecer contacto con el epitelio del intestino grueso, destruyen el borde ciliado y penetran en
las células, dando lugar a ulceraciones e inflamación intestinal.

E coli productora de verotoxina (VTEC): Es causa de diarrea, que tienen graves secuelas:
colitis hemorrágica y posiblemente síndrome urémico hemolítico. Estas bacterias son, a diferencia de las
anteriores clases, sorbitol y MUG (4-metilumbiliferil-β-D-glucorónido) negativos. Algunos autores
incluyen a las bacterias de este grupo entre las ETEC, pero como clásicamente se ha considerado entre
estas últimas a las bacterias capaces de producir LT y ST, se ha diferenciado entre ambas clases.

Importancia de la E. coli en Sanidad medioambiental.

Por citar sólo algunos de los numerosos y más recientes casos en los que la E. coli es la
responsable de muertes y gastroenteritis a lo largo y ancho del planeta se tienen los ejemplos
significativos siguientes: el que se produjo en Japón en el año 1996 con más de 9.500 personas
contaminadas y una decena de muertes en la ciudad de Sakai, de infección de varios cientos de
personas, incluyendo cinco muertos, en Inglaterra debido a su presencia en carne de vacuno y de no
menos de 55 muertos en Estados Unidos y Canadá. Incluso, se puede destacar un caso más cercano,
en la provincia de Lugo, donde según la Sociedad Gallega de Microbiología Clínica, ha afectado a no
menos de ocho personas desde 1.992 y en 1.995 se detectó en un 2% de la carne que llegaba al
matadero. Estos pocos ejemplos indican la importancia de controlar esta bacteria de una forma
escrupulosa.

DETERMINACION DE COLIFORMES

Las bacterias coliformes, de acuerdo con la diversa y numerosa bibliografía existente

[2,3,6,10,17,19-22], se pueden determinar, sin necesidad de grandes inversiones que incluyan la compra

6
de aparatos sofisticados como PCR, medidores basados en el cambio de impedancia de un medio de
cultivo, de diversas formas: métodos basados en el número más probable (NMP), de presencia-ausencia
(P/A), basados en la filtración de membrana (MF) y métodos cromogénicos y/o fluorogénicos basados
en reacciones específicas de estos microorganismos. Actualmente, los métodos NMP están en claro
retroceso frente a las otras opciones. Entre los incluidos en la MF hay variaciones en el medio utilizado:
puede ser Tergitol TTC, Endo gelose, Agar de Chapman, Hektoen Agar, Levine EMB, Agar verde
brillante-bilis, etc. e incluso en la forma de hacerlo: puede ser una filtración directa e incubación sobre
una placa que contenga el medio o bien usar discos de cartón nutriente que se empapan con el medio.
Los medios P/A tienen una desventaja inicial y que su nombre indica: no reflejan la "cantidad de
contaminación" (número de colonias que se desarrollan) del agua analizada. En los medios
cromogénicos y/o fluorogénicos, basados en reacciones con indicadores específicos (tecnología de
sustrato definido), se produce un cambio de coloración o emisión de fluorescencia en caso de estar
presentes organismos coliformes y E. coli respectivamente. Hay autores [17] que diferencian entre
medio cromogénico y fluorogénico según el sustrato utilizado (unos provocan coloración y otros
fluorescencia), pero en este trabajo se consideran indistintamente.
El problema surge en el momento en que se quiere determinar específicamente el número
de E. coli presentes ya que los medios cromogénicos más extendidos solo indican presencia o ausencia
y los otros medios -los usados tradicionalmente en MF y NMP- no son selectivos, solo son presuntivos.
Por las razones expuestas, es por lo que se precisa un método de detección que sea a la vez selectivo y
confirmativo. Hace poco tiempo se han puesto a disposición de los microbiólogos nuevos medios de
incubación, cromogénicos, que intentan evaluar simultáneamente organismos coliformes y E. coli. Se
trata de medios que contienen sustratos cromogénicos enzimáticos.

OBJETIVO DEL ESTUDIO

Es determinar la idoneidad de uno de los medios cromogénicos descritos en el capítulo

anterior para analizar y diferenciar organismos coliformes y E. coli, intentando establecer una
comparación de resultados con métodos ya existentes para confirmar que se trata de un medio válido y
utilizable.

Métodos y materiales

Como medio de referencia se ha escogido un medio Endo-Gelose, de la casa bioMérieux

(Ref. 43 231), que ya ha sido comparado con otros medios [17,23-24] y establecido su crecimiento como
idóneo para análisis de agua. El medio sobre el que se va a realizar el estudio es uno denominado coli
ID, de la misma casa (Ref. 42 017). Para identificar las colonias se utilizan un medio API de la misma

7
casa (Ref. 20 100) y un medio RapID de la misma casa (Ref. 20 700). Estos test se basan en una serie
de reacciones específicas que permiten establecer el tipo de organismo de que se trata con una
fiabilidad muy elevada. Para testar cada medio se usan cepas de material de referencia suministradas
por el BCR (Ref. WR 63 correspondientes a Enterococcus faecium y Ref. WR3 correspondiente a
Enterobacter cloacae) y por Microkit (Ref. ATCC 25992 correspondiente a E. coli y Ref. ATCC 13882
correspondiente a K. pneumoniae). Las referencias de los lotes de medio Endo son: 600846A, 606876A
y 616576A, el de Coli ID 748345A, el del API 20E 656135A y el del RapID 20E 630335A, todos
suministrados con su correspondiente ficha de control técnico. En el estudio se consideran como
organismos coliformes totales todas las colonias que crecen en medio endo tras incubación durante 24
horas a 37º y desarrollan coloración rojo oscuro, están nucleadas con color granate o presentan brillo
metálico verde. Se consideran organismos coliformes fecales todas aquellas colonias de las mismas
características que crecen en medio endo tras incubación durante 24 horas a 44ºC [10,17,19]. Las
placas de medio coli ID se incuban a 37ºC durante 24 horas, considerándose como E. coli las colonias
de color morado o violáceo, como organismos coliformes totales las colonias de color azul además de
las anteriores y como otro tipo de microorganismos las grisáceas y amarillas. Las placas de este medio
contienen dos sustratos cromogénicos, uno que reacciona con la β−glucoronidasa, enzima que es
producido por el 97% de las cepas de E. coli y que hidroliza el enlace o-glucoronosil de los glucorónidos
conjugados, coloreando las colonias de esta bacteria de morado o violeta y otro que reacciona con la β-
galactosidasa, enzima específico producido por los organismos coliformes, coloreando las colonias de
éstos de azul. La combinación de ambos sustratos optimiza la detección de E. coli y coliformes.
Se han usado membranas filtrantes Millipore HAWG 047.

DESARROLLO DEL ESTUDIO

Dado que el medio coli ID se presenta en frascos de 200 ml, siendo necesario licuarlo,
extenderlo sobre placa y dejarlo solidificar cabrían dos posibilidades: proceder como en una filtración de
membrana típica o bien añadir una cantidad fija de agua a la placa y echar el medio sobre ella. Para
mayor seguridad del estudio han seguido los dos caminos. Las muestras de agua que se han analizado
proceden de un río (Río Tambre), un efluente de EDAR (EDAR de Silvouta en Santiago de Compostela)
y las preparadas con las cepas de referencia. De cada muestra se han realizado tres placas por el
procedimiento de MF correspondiendo dos a medio endo, incubadas durante 24 horas a 37º y 44º
respectivamente y otra al medio coli ID incubada durante 24 horas a 37ºC.
Como las muestras iniciales están bastante contaminadas, se han usado diluciones
adecuadas con objeto de evitar placas saturadas de colonias y de imposible lectura. Las diluciones han
sido las mismas en cada caso para cada placa y los resultados que se presentan ya están corregidos al
habitual de bacterias por 100 ml. de muestra. Aquí ha surgido uno de los problemas experimentales más
8
importantes: dado el gran número de inhibidores que contienen las placas rellenas con medio coli ID, ha
sido necesario usar diluciones menores en las filtraciones cuyos filtros se han incubado en el citado
medio.
El último paso del estudio ha consistido en identificar las colonias de las placas realizadas
según el procedimiento de MF con alguno de los métodos ya indicados para verificar que se trata de
organismos coliformes y/o E. coli dependiendo de cada caso.
No se han usado muestras de aguas poco contaminadas o cloradas ya que lo que se intenta
encontrar es una correlación entre el número y el tipo de colonias presentes en medio Endo y el número
de colonias presentes en coli ID.
Tampoco se ha usado la incubación previa de la placa a 35º antes de incubar a 44ºC para
recuperar las posibles bacterias en estado latente.

RESULTADOS

A la hora de presentar los resultados se diferencia entre coliformes totales y coliformes

fecales, cuando lo estrictamente correcto sería diferenciar entre coliformes totales y E. coli. Esto no se
hace debido a que, como ya se ha mencionado, más del 90% de los coliformes fecales y además, como
se demostrará más adelante -concretamente al estudiar las identificaciones- alguna colonia violácea no
corresponde a E. coli. Al hacer esta aproximación se reduce el error.
Los resultados que se han encontrado, tras realizar análisis durante el período comprendido
entre Febrero y Abril de 1.996 y realizar un número representativo de experiencias, ofrecen, para el Río
Tambre los siguientes valores:

Medio Máximo Minimo Media

Coli totales Endo 2670 340 970
Coli totales Coli ID 1100 70 431
Coli fecales Endo 920 150 389
Coli fecales Coli ID 980 50 349

En una aproximación estadística: dividiendo el número de coliformes totales obtenidas al

incubar en medio endo entre el número de coliformes totales obtenidas al incubar en medio coli ID y
procediendo de igual forma para las coliformes fecales y, calculando la desviación estándar, la
correlación y el chi cuadrado para cada uno de los casos, se obtiene:

9
 2
σn Media Correlación χ
Coli totales (Endo)/Coli totales (Coli ID) 0,77 2,31 0,94 5,2
Coli fecales (Endo)/Coli fecales (Coli ID) 0,71 1,78 0,88 6,3

De la anterior tabla es fácil deducir que existe una cierta paridad entre los datos
correspondientes a los organismos coliformes fecales encontrados en cada caso, puesto que la media
de los cocientes entre los números de colonias incubadas en ambos se aproxima a la unidad (que sería
el caso ideal). En cambio, para los organismos coliformes totales la paridad es mala ya que el mismo
cociente se separa bastante de la unidad. Sin embargo, la correlación individual de cada uno de los
datos es mejor en el caso de los coliformes totales, como indica el coeficiente de correlación calculado
en la gráfica resultante de representar los valores obtenidos en cada medio en cada uno de los casos.
De la tabla del chi cuadrado se puede concluir que para P= 0.05 y 5 grados de libertad, (χ2 = 11,1) que
no se puede rechazar la hipótesis de que los resultados sean independientes del medio utilizado.
Si se representan las curvas de dispersión de los valores encontrados en las experiencias
realizadas para ambos medios, se encuentra que los puntos guardan una relación bastante próxima a la
linealidadd –como era de esperar en función del valor de correlación de la anterior tabla-, volviéndose a
encontrar una mejor relación en el caso de coliformes totales que en el de coliformes fecales.

10
 Correlación entre medios. Colif. totales

1400
1200
Medio Coli ID

1000 Serie1
Lineal (Serie1)
800
600 y = 0,4537x + 25,526
400 R 2 = 0,8793
200
0
0 1000 2000 3000
Medio Endo-Gelose

Correlación entre medios. Colif. fecales

1200
1000
Medio Coli ID

800 Serie1
Lineal (Serie1)
600
400
200 y = 0,7559x - 25,371
R2 = 0,7732
0

0 500 1000 1500

Medio Endo-Gelose

Finalmente, si se realiza un análisis de varianza para cada uno de los casos se tiene:
11
 ANOVA para coliformes totales

Fuente de Suma de Grados de Media F

variación cuadrados libertad
Regresión 2035041,667 1 2035041,667 10,373
Residuo 11379256,667 58 196194,080
Total 13414298,333 59

ANOVA para coliformes fecales

Fuente de Suma de Grados de Media F

variación cuadrados libertad
Regresión 244737,067 1 244737,067 3,698
Residuo 3839009,867 58 66189,825
Total 4083746,933 59
En este caso, se observa que F<F0,05 (4,00) sólo en el caso de los coliformes fecales. Es
decir, únicamente en el caso de estos microorganismos se puede concluir que no existen razones para
sospechar que exista falta de ajuste, es decir, que ambos medios representan estimaciones de la misma
varianza y, por tanto, el modelo no parece ser inadecuado.
En el caso de los coliformes totales existe falta de ajuste, de forma que puede concluirse
que el modelo es inadecuado.
De todas formas debe considerarse que los valores están, como ya se ha indicado,
corregidos para una filtración teórica de 100 ml. a partir de diluciones hasta 50 veces menores y al hacer
la corrección se multiplica el error.
En el supuesto de aguas muy contaminadas -caso de un efluente de EDAR- se ha usado
otra técnica de trabajo: la incubación aerobia de un volumen conocido de muestra. En este caso se licúa
el medio, se enfría en baño termostático hasta 45ºC y se echa sobre una placa que contenga la cantidad
prefijada de muestra (de 0.5 a 1 ml). Con este nuevo método de trabajo disminuye el número de
colonias que crecen, pero al tratarse de muestras muy contaminadas podría establecerse una
correlación de resultados, evitando las múltiples diluciones que son necesarias en el supuesto de usar
medio endo. Igualmente podría ser un método adecuado cuando se analicen otros compuestos
diferentes al agua superficial: leche, orina, agua residual, etc. que se suponen más contaminados.
Otra técnica de trabajo que se ha usado es la incubación de las placas de coli ID a 44ºC,
pese a no estar descrita. Los resultados obtenidos en este caso han sido sorprendentes ya que las
12
correspondencias entre los números de colonias han sido mucho mejores que en el caso de la
incubación a 37ºC. Si se procede igual que en el primer caso, las aproximaciones estadísticas que se
obtienen son:

σn Media
Coli totales Endo/Coli totales Coli ID 0,12 0,88
Coli fecales Endo/Coli fecales Coli ID 0,89 1,58

aproximándose el valor de las coliformes totales mucho más a la unidad que en el caso precedente y
manteniéndose prácticamente igual para los coliformes fecales. Sin embargo, se observa un cambio en
la tendencia: mientras en el caso anterior el número de colonias de coliformes totales en el medio endo
es superior al número de colonias de coliformes totales en el medio coli ID en éste es a la inversa. De
todas formas, estos resultados no deben considerarse definitivos debido al escaso número de
experiencias realizadas. Por esta misma razón, escaso número de experiencias, no se ha calculado la
correlación entre las experiencias individuales.
La última experiencia que se ha realizado ha sido la comprobación del crecimiento en el
medio a estudiar de cepas de microorganismos ya conocidos y la identificación de las colonias que han
crecido en los casos anteriores. Para la identificación se han usado los medios ya mencionados -API 20
E y RapID 20- que en la bibliografía [17,19-20,22] se reconocen como idóneos y están basados en una
serie de reacciones específicas que dan una probabilidad de acierto en la identificación superior al
99,5%. Aquí sí que el medio coli ID ha dado unos resultados mucho más ajustados a la definición que el
medio endo. En las identificaciones correspondientes a las experiencias anteriores, mientras en las
placas de medio endo incubadas a 44ºC se han identificado muchos tipos de bacterias en las colonias
que por morfología debieran corresponder a coliformes fecales: E. coli, K. ornithinolytica, K.
pneumoniae, Serratia Odorifera, E. cloacae, Kluyvera spp; en las placas correspondientes a coli ID todas
las colonias moradas o violáceas identificadas han correspondido a E. coli menos dos que han
correspondido a K. pneumoniae.
En el caso de las cepas conocidas, los crecimientos y colores han sido los siguientes:

Medio Coli ID Medio Endo 37º C Medio Endo 44º C

Enterobacter cloacae Azul Rojo/brillo metálico Rojo
Enterococcus faecium No crece No crece No crece
Escherichia coli Violaceo Brillo metálico Brillo metálico
Klebsiella pneumoniae Azul Brillo metálico/granates Brillo metálico/granates

CONCLUSIONES
13
 De los resultados mencionados en el capítulo anterior pueden sacarse algunas conclusiones
importantes:

1. El medio estudiado, coli ID es muy adecuado para la determinación de coliformes fecales y

concretamente para la identificación de E. coli; mucho mejor que el tradicional medio endo. Es
decir, en caso de tener que diferenciar las E. coli del resto de coliformes termotolerantes es un
medio idóneo. El número de falsos positivos, como se deduce de las identificaciones realizadas -
coincidentes por las realizadas por bioMérieux en las especificaciones técnicas-se reduce
significativamente.

2. La relación de resultados entre las colonias que corresponden a coliformes totales en el medio
endo y las colonias que corresponden a coliformes totales en el medio coli ID incubado a 37ºC
durante 24 horas no es bueno, sino que tiende a ser casi el doble en el primer medio. La relación
es incluso inferior que la que se encuentra entre el método NMP y el método MF -usando medio
endo- o entre el propio método MF usando diferentes medios y recogido en múltiple bibliografía
[10,17,19,22,23,25]. Lo mismo puede deducirse del análisis de varianza, que predice que el modelo
sólo es bueno en el caso de coliformes fecales. El que los demás parámetros estadísticos
estudiados indiquen que la correspondencia de resultados en ambos medios es buena, tanto su
correlación (coeficiente próximo a 0,9) como la independencia de los resultados con respecto al
medio (test del chi cuadrado) se debe a que se está trabajando con un ratio (coliformes en un
medio repecto a coliformes en otro medio) y se desvirtúa le resultado comparativo. De todas
formas estos resultados son mejores que en muchos de las experiencias que se mencionan en los
trabajos referenciados. En el caso de colonias incubadas a 44ºC en las placas coli ID incluso se
encuentra una relación aceptable de resultados entre ambos medios, razón por la cual debe
seguirse experimentando a esta temperatura para ver si se mantiene en un número mayor de
experiencias. Otra posibilidad que se llevará a cabo es la incubación de la placa coli ID a 37ºC
durante un período de tiempo mayor (36-48 horas) ya que dadas las características selectivas del
coli ID el crecimiento de colonias es más lento que en el medio endo. Estas dos últimas
consideraciones coinciden, al igual que en el punto anterior, con las expresadas por bioMérieux en
las especificaciones técnicas del medio.

3. El número de falsos positivos en las colonias que debieran corresponder a coliformes

termotolerantes se reduce mucho cuando se usa el medio coli ID siendo, por tanto, un método
mucho más fiable para la enumeración de este tipo de microorganismos. Aquí debe hacerse la

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 siguiente consideración: no se han usado cepas de Shigella ni de Salmonella, que por similitud con
la E. coli -presencia del enzima β−glucoronidasa- podrían dar colonias violáceas.

4. Los volúmenes de agua contaminada -muestra real- que se han empleado con el medio coli ID
son mayores que en el medio endo. Es decir, las diluciones que se han usado son menores con la
ventaja que sobre los resultados finales esto representa.

5. Sería interesante iniciar un estudio sobre la correlación de resultados en aguas poco

contaminadas, por ejemplo las que se ajusten a agua tipo A1 según la Orden de 11 de Mayo de
1.988, para saber si el medio coli ID pudiera aplicarse a este tipo de aguas. Si así fuese, el ahorro
sería considerable, ya que con incubar una única placa podría darse un resultado de análisis
microbiológico, cuando en este momento es necesario incubar dos. En este supuesto, antes
deberían realizarse las experiencias reseñadas en el punto 2 para asegurar la concordancia de
resultados.

6. Como conclusión final del objetivo que se buscaba con este trabajo, se puede decir que el medio
ensayado es mucho más eficaz para la determinación de la E. coli o coliformes fecales, como se
desprende del análisis de varianza y de la desviación estándar entre los medios, que los
tradicionales métodos empleados para su control. Es decir, que ya se dispone de una forma
relativamente rápida y sencilla de detectar a tan peligroso microorganismo.

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