CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION (HPLC)

La cromatografía liquida es muy importante porque la mayoría de los compuestos no son lo suficientemente
volátiles para analizarse por cromatografía de gas. En HPLC se usa alta presión para forzar el solvente a pasar
a través de una columna que contiene unas partículas muy finas que dan alta resolución a las separaciones.
El Sistema HPLC involucra:

1. Un sistema de entrega de solvente.

2. Una válvula de inyección de la muestra.

3. Una columna que resiste alta presión.

4. Un detector.

5. Un computador para el control del sistema. Modernamente se usa un sistema para

el control de la temperatura.

Proceso cromatografico

En cromatografía de gas para incrementar la eficiencia se incrementaría la velocidad de transferencia de

masas entre la fase estacionaria y la fase móvil. Para una columna open tubular esto es adecuado ya que
disminuyendo el espesor de la película de la fase estacionaria y reduciendo el diámetro de la columna las
moléculas pueden difundirse rápidamente. La difusión de los líquidos es 100 veces mas lento que la difusión
de los gases. Por tanto en cromatografía liquida no es generalmente factible usar columnas open tubular,
por que el diámetro de los canales del solvente es demasiado grande para ser atravesado por una molécula
de soluto en corto tiempo. De modo que la cromatografía liquida es llevada a cabo en columnas empacadas.

Efectos del tamaño de las partículas en HPLC

La eficiencia de una columna empacada se incrementa cuando el tamaño de las partículas de la fase
estacionaria decrece ya que disminuye la altura de plato. En condiciones optimas el número de platos
teóricos en una columna de longitud L (cm) es: N =3.500L(cm)/dp(μm) dp = tamaño de las partículas en
micrómetro. Una razón de porque las partículas pequeñas dan mejor resolución es que ellas proveen un
flujo mas uniforme a través de la columna, por tanto reducen el término de múltiples pasos A en la ecuación
de Van Deempter. Una segunda razón es que la distancia a través de la cual el soluto debe difundirse en la
fase móvil entre partículas se debe al tamaño de ´estas. Cuando las partículas son pequeñas, hay menos
distancia entre ellas, para que el soluto se difunda mejor en la fase móvil. Este efecto disminuye el termino C
en la ecuación de Van Deemter, dando un tiempo finito entre equilibrio. El inconveniente del pequeño
tamaño de las partículas es la resistencia al flujo del solvente, es por ello que requiere alta presión ( 70-400
atm).

Columnas

Las columnas en HPLC pueden ser de plástico, vidrio o acero inoxidable con longitudes entre 5 y 30 cms, con
un diámetro interno de 1-5 mm. Las columnas son costosas, Fácilmente degradables debido al polvo o
partículas que se encuentran en la muestra o el solvente, por lo que se requiere de un guarda columna. Un
guarda columna es una columna corta que contiene la misma fase estacionaria que la columna principal. Las
partículas finas e impurezas son retenidas por el guarda columna, la cual es periódicamente reemplazado. Si
se calienta la columna generalmente disminuye la viscosidad del solvente, aumentando su velocidad de flujo
y reduciendo la presión requerida. Igualmente incrementando la temperatura disminuye el tiempo de
retención mejorando la resolución, ya que aumenta la difusión del soluto; no obstante este aumento de
temperatura puede degradar la fase estacionaria disminuyendo la vida ´útil de la columna. Si calentamos la
columna unos pocos grados sobre la temperatura ambiente, mejora , la precisión (reproducibilidad y
repetibilidad) del análisis cuantitativo y el tiempo de retención.

Columnas analíticas

El tamaño de las partículas de relleno en estas columnas son de 3-10 μm. La columna más utilizada es la de
25 cm con tamaño de partículas de 5 μm y diámetro interno de 4.6 mm. Estas columnas alcanzan unas
alturas de platos teóricos de 40.000 a 60.000.

Fase estacionaria

Existen dos tipos básicos de relleno pelicular y de partícula porosa. La mas común son partículas
microporosas esféricas de sılica que son permeables al solvente y tienen un área de superficie bastante
grande. Las esferas son de vidrio o polímeros con diámetro de 30 a 40 μm. En la superficie de estas bolas se
deposita una capa delgada y porosa de sılice, alumina o resina de intercambio iónico .Estas esferas también
se pueden tratar químicamente para obtener una capa superficial orgánica. Los típicos rellenos de partículas
porosas en cromatografía de liquidas están formados por micro partículas porosas con diámetros de 3 a 10
μm.

Proceso de elución

En la cromatografía de adsorción las moléculas de solvente compiten con las moléculas de solutos por los
sitios activos de la fase estacionaria. Las capacidades relativas de los diferentes solventes para eluir un
soluto dado del adsorbente son casi independiente de la naturaleza del soluto. La elución se puede describir
como un desplazamiento de soluto a través la fase estacionaria por el solvente.

Fuerza del eluente 𝜺°

Es una medida de la energía de adsorción del solvente, la cual es cero (0) para el pentano para adsorción
sobre sılica. Entre más polar es el solvente más fuerza de elusión tiene sobre la sılica. Entre mas grande sea
la fuerza del eluente más rápidamente sera eludido de la columna. La cromatografía de adsorción sobre
sılica bare es un ejemplo de cromatografía en fase normal en la cual usamos una fase estacionaria polar y un
solvente menos polar. Un solvente más polar tiene una fuerza de eluente más alta.

Clasificación de la cromatografía liquida

La cromatografía liquida la podemos clasificar como:

Cromatografía en fase reversa

Es la más común donde el solvente es polar y la fase estacionaria es a polar o ligeramente polar. Aquí un
solvente menos polar tiene una fuerza de elución mayor. Generalmente el solvente es un hidrocarburo. En
la cromatografía en fase reversa se eliminan picos con cola (tailing) por que la fase estacionaria tiene pocos
sitios que puedan adsorber fuertemente al soluto como para producir el tailing. La cromatografía en fase
reversa es menos sensible a las impurezas polares (como agua) en el eluente. En esta cromatografía los
componentes mas polares aparecen primero y un aumento en la polaridad de la fase móvil disminuye el
tiempo de elución.

Cromatografía en fase normal

En cromatografía en fase normal la fase estacionaria es polar y la fase móvil es apolar; el soluto menos polar
se eluye primero debido a que es más soluble en la fase móvil y un aumento en la polaridad en la fase móvil
aumenta el tiempo de elución.

Cromatografía lıquido-lıquido o de partición

En esta cromatografía las moléculas de soluto se distribuyen entre dos líquidos, uno de ellos hace la veces
de fase estacionaria y el otro de fase móvil, esta ´ultima se encuentra homogeneamente dispersa en un
soporte sólido. Este tipo de cromatografía presento inconvenientes mayores como el hecho de que:1)se
requería presaturar la fase móvil con la fase estacionaria.2)era necesario disolver la muestra en la fase
móvil presaturada con la fase estacionaria y 3)no se podían llevar a cabo gradientes de elución.

Ejemplos

El siguiente ejemplo muestra el comportamiento de elución de los distintos componentes teniendo en

cuenta su polaridad y la clase de polarografıa utilizada.(Skoog & Holler 1998)

Cromatografía de adsorción

Llamada cromatografía liquido-solido. Las únicas fases que se utilizan en HPLC líquidos-solido son la sılice y
la alúmina, siendo la sılice la que más es utilizada, se usa para casi todas las aplicaciones debido a su mayor
capacidad de carga y mayor diversidad de presentaciones. En cromatografía lıquido-solido la única variable
que se puede utilizar para optimizar K y es la composición de la fase móvil. La cromatografía de adsorción es
más adecuada para compuestos no polares con masas moleculares inferiores a 5000 Esta cromatografía es
más adecuada para muestras que son solubles en disolventes no polares, por lo que tiene una solubilidad
limitada en los disolventes acuosos utilizados en cromatografía de fase inversa. Una característica particular
de la cromatografía de adsorción es su capacidad de diferenciar isómeros.

Elección del solvente

Para elegir el solvente adecuado se varia la relación entre los disolventes y se obtiene así un valor adecuado
de k′ . Se ha encontrado que un aumento de 0,05 unidades en el valor de "o por lo general disminuye 3 o 4
veces el valor de k′ . Con estas combinaciones se pueden encontrar la relación que favorezcan los tiempos
de retención para cualquier mezcla, pero por desgracia la relación de volumen no es lineal con 𝜀°
Cromatografía fase inversa.(Fase móvil de baja polaridad) Polaridad de los componentes: A>B>C

Cromatografía fase normal.(Fase móvil de polaridad media)

Cromatografía en fase normal.(Fase móvil de polaridad media) Polaridad de los componentes: A>B>C

Cromatografía en fase inversa.(Fase móvil de alta polaridad )

Gradiente de elución isocratica

La elución isocratica es llevada a cabo con un solo solvente (o mezcla constante de solvente).Cuando un
solvente no es capaz de dar una elución rápida de todos los componentes, entonces se usa el gradiente de
elución, que no es mas que hacer cambios continuos en la composición del solvente para aumentar su
fuerza. El gradiente de elución en HPLC es análogo a la programación de temperatura en cromatografía de
gas. Aumentando la fuerza del solvente se eluye más rápidamente el soluto retenido.

Selección del modo de separación

Hay varias formas de separar un componente de una mezcla dada. En cualquier caso la primera pregunta
que se debe hacer es si es soluble en agua o en un solvente orgánico. Si el soluto se disuelve en un solvente
no polar o débilmente polar, usaremos la cromatógrafia en fase reversa. Si el peso molecular del soluto es
mayor de 2000 y son solubles en solventes orgánicos con diámetro molecular menor de 30 nm escogemos
cromatografía fase reversa (C18,C8,C4). Si el peso molecular es mayor de 2000 y es soluble en solvente
orgánico y el tamaño molecular está entre 30-400 nm la cromatografía a escoger es la exclusión por tamaño.
Si el peso molecular del soluto es menor de 2000 y es soluble en agua y es iónico la cromatografía a escoger
es la iónica.

Solventes

Se requieren solventes grados HPLC muy puros para evitar la degradación de la columna debido a las
impurezas y minimizar la señal de fondo del detector debido a contaminantes. Para evitar esto se utilizan
filtros para retener las partículas con tamaños de las micra. La muestra y el solvente son pasados a través de
un guarda columna. Aun contando con un guarda columna se recomienda el lavado periódico de la columna
analítica para prolongar su vida ´útil. Antes del uso del solvente estos son purgados con He para remover el
aire disuelto, ya que las burbujas de aire les causan problemas a las bombas, a las columnas y detectores.
Las separaciones en fase normal son muy sensibles al agua en el solvente. Una buena cromatografía con
fases móviles interactivas, requiere un equilibrio adecuado entre las fuerzas intermoleculares entre los tres
participantes activos en el proceso de separación soluto, fase móvil y fase estacionaria. Estas fuerzas
intermoleculares se describen en términos de polaridad relativa de cada uno de los reactivos. Para una
separación cromatografía de reparto la polaridad de la fase estacionaria ha de ser similar a la del analito y
para la elusión se requiere entonces una fase móvil de una polaridad considerablemente distinta. La
polaridad de los grupos funcionales viene dada: HIDROCARBUROS<ETERES <ESTERES
<CETONA<ALDEHIDOS<AMIDAS <AMINAS<ALCOHOLES. En conclusión podemos decir que para que ocurra
una buena separación las polaridades del soluto, fase móvil y la fase estacionaria deben armonizarse,
porque si el soluto tiene mucha más afinidad con la fase móvil, los tiempos de retención serán demasiado
cortos para fines prácticos, y si tiene demasiada afinidad con la fase estacionaria los tiempos de retención se
hacen demasiado largos.

Criterios para una buena separación

El factor de capacidad es una medida del tiempo de retención (tr) en unidades de tiempo. Separaciones
razonables demandan que el factor de capacidad para todos los picos deben estar en el rango 0,5-20. Si el
factor de capacidad es demasiado pequeño el primer pico es distorsionado por el frente del solvente. Si el
factor de capacidad es demasiado grande el tiempo de análisis es muy prolongado. Cuando no se observa
perturbación en la línea base de un cromatograma el tiempo muerto se puede estimar con la ecuación :
𝐿𝑑𝑐
𝑡𝑚 =
2𝑓

Donde L = longitud de la columna

dc= diámetro interno de la columna

F = velocidad de flujo

En cromatografía en fase reversa el tm puede ser medido pasando un soluto no retenido (por ej. uracil
detectado a 260 nm) a través de la columna. Para la cuantificación una resolución mínima entre dos picos
vecinos de 1.5 es deseada. Para mayor robustez una resolución de 2 es mucho mejor. Otro criterio para una
adecuada separación cromatografía es no exceder la presión de operación por encima de 15 MPa (150 atm)
esto prolonga la vida de la bomba, válvulas, sellos y el automuestreador. Todos los picos que necesiten ser
medidos deben ser simétricos con un factor de asimetría A/B en el rango de 0.9-1.5

Atributos de una buena separación

Para que se produzca una buena separación, se deben cumplir las siguientes condiciones:

1.0.5 ≤ 𝑘! ≤ 20

2. Resolución ≥ 2

3. 0.96≤ factor asimetría ≤ 1.5

4. Presión de operación ≤15 MPa ( 150 atm)

Optimización con un solvente

Combinaciones de acetonitrilo, metanol y tetrahidrofurano(THF) con agua (buffer acuoso) son muy
adecuados para separar un gran número de compuestos por cromatografía en fase reversa. La primera
mezcla a probar sería acetonitrilo y agua. El acetonitrilo tiene una viscosidad baja que permite operar a
presiones relativamente bajas, y permite detección UV por debajo de los 190 nm. A esta longitud de onda
un gran número de analitos presentan absorción. El metanol es el segundo solvente escogido por que tiene
una alta viscosidad y un cut-off(longitud de onda a la cual no hay absorción del solvente por parte del
detector) en el UV mas grande. El THF es la tercera mezcla escogida por que tiene un rango menor utilizable
en el UV, es lentamente degradado por oxidación y se equilibra mas lentamente con la fase estacionaria.

Orden de escogencia de un solvente orgánico

1. ACETONITRILO

2. METANOL

3. HF 1

El acetonitrilo es un reactivo peligroso por lo que sus desechos deben ser hidrolizados con acetato desodio y
vertidos al drenaje.

Optimización con dos o tres solventes orgánicos

Cuando se requieren dos o tres solventes orgánicos, se requiere primeramente una optimización, para ello
se deben seguir los siguientes pasos: Paso 1: Se optimiza la separación con acetonitrilo/buffer para generar
un cromatograma A. Paso 2: Se optimiza la separación con metanol/buffer para generar un cromatograma
B. Paso 3: Se optimiza la separación con THF/buffer, para generar un cromatograma C. Paso 4: Se mezclan
los solventes, de los pasos 1,2 y 3 en proporciones 1:1 para generar los cromatogramas D, E y F. Paso 5:
Hacer una mezcla de acetonitrilo, metanol y THF en proporción 1:1:1 para generar un cromatograma G. Paso
6: Si alguno de los resultados mostrados en los cromatogramas de A a G, es adecuado, selecciónelo. Si la
separación no se consigue con ninguno de los pasos anteriores es necesario que usted pruebe una columna
diferente u otra forma de cromatografía.(Harris 1999)

Temperatura como una variable en separaciones isocratica

Cambiando la temperatura de la columna puede afectar la retención relativa de los diferentes compuestos
en una mezcla, la temperatura tiene mucha influencia en compuestos iónicos( cationes amonio, cationes
carboxilatos)y moléculas con múltiples sustituyentes polares. Para elevadas temperaturas de operación, el
pH debe estar por debajo de 6 para retardar la disolución de la fase estacionaria de sılica.

Como se consigue una buena separación? Para hacer una buena separación se debe aumentar la
resolución, para ello usted debe: 1. Disminuir la velocidad del flujo. 2. Incrementar la longitud de la
columna.3. Disminuir el tamaño de las partículas en la columna.

∆𝒕𝒓 ∆𝒕𝒓
𝒓𝒆𝒔𝒐𝒍𝒖𝒄𝒊𝒐𝒏 = =
𝒘𝒂𝒗 𝟏. 𝟕𝟎𝒘𝟏
𝟐

∆tr = Separación entre picos

𝑤𝑎𝑣 =Promedio del ancho de la línea base

𝑤1 =Promedio del ancho de pico a la mitad de la altura

2
CROMATOGRAFIA DE FLUI DOS SUPERCRITICOS

Definiciones

La cromatografía de fluidos supercríticos es una técnicas se separación llamada también estraccion

supercrıtica.La cromatografía de fluidos supercríticos tiene importancia por que permite la separación y la
determinación de un grupo de compuestos que no se pueden analizar adecuadamente ni por cromatografía
de gas ni por cromatografía liquida Los fluidos supercríticos combinan características de gases y líquidos Ej.:
los coeficientes de difusión y viscosidad de los FSC son semejantes a la de los gases de arrastre en
cromatografía de gas, mientras que sus densidades se aproximan a la de los líquidos.Estos compuestos son
los no volátiles o térmicamente lábiles a los que no se pueden aplicar los procedimientos de cromatografía
de gas y aquellos que no contienen grupos funcionales que hagan posible su detección por las técnicas
espectroscópicas o electroquímicas que se utilizan en cromatografía liquida En CFS es posible hacer variar
tres condiciones que son similares a los que se hacen variar en HPLC: Temperatura, composición del
eluyente y la velocidad de la fase móvil

• Fluido supercrítico: Sustancia llevada mediante operaciones mecánicas a unas

Condiciones operativas de presión y temperatura critica.

• Temperatura critica: Temperatura por encima de la cual no puede existir una fase

Liquida independientemente de la presión.

• Presión critica: Es la presión de vapor de una sustancia a temperatura critica.

• Punto crítico: Temperatura y presión superiores próximas a la presión y temperatura

critica.

Características de un fluido supercrítico

• Gran poder disolvente junto con una enorme capacidad de penetración en sólidos, lo que permite el
agotamiento rápido y prácticamente total de los sólidos extraíbles.

• A diferencia en HPLC y GC en los FSC el aumento de presión a una temperatura dada incrementa la
densidad la cual aumenta la solubilidad de la mayoría de los analitos.

Otra característica de los FSC es que un aumento de temperatura a determinada presión produce una
menor densidad del fluido, lo que conduce a una menor solubilidad. Como resultado, incluso cuando la
temperatura y la composición del eluyente son constantes, la caída de presión desde la entrada hasta la
salida de la columna significa que las solubilidades de los analitos disminuyen conforme estos avanzan por la
columna. Para resumir podemos decir que el método es menos sencillo que en GC y HPLC.
Analitos

En la actualidad la CFS no es tan popular como GC o HPLC. Es una técnica casi ideal para realizar
separaciones de algunos surfactantes y polímeros. Se prefiere la CFS para estos compuestos por que no es
necesario la volatilización para obtener un gas, y la transferencia de masas es un orden de magnitud mayor
que en las fases móviles de HPLC. Esto implica una reducción significativa del tiempo de análisis, pues logra
un equilibrio más rápido entre la fase móvil y la estacionaria. También se ha demostrado que CFS es útil para
separar algunos compuestos quiérales. El orden de retención suele ser el mismo que para HPLC quiral, pero
las separaciones son mas rápidas.

Fase Móvil

La fase móvil en CFS se inicia en un cilindro de gas a alta presión, pero el fluido permanece Comprimido y se
calienta por encima de su temperatura critica, para así obtener condiciones supercríticas. El dióxido de
carbono es la fase móvil que se emplea con mayor frecuencia, debido a su bajo costo, no es inflamable ni
toxico. Como no es polar se le agregan modificadores polares para permitir el análisis de compuestos
polares. Los modificadores que se agregan con frecuencia incluyen metanol y etanol, para sustancias
básicas, aminas. Los gradientes en CFS se obtienen cambiando las condiciones que modifican la solubilidad
del analito en la fase móvil supercrítica.

Cosolventes

Sustancia que se le agrega al sistema para aumentar la selectividad y el poder disolvente del fluido, con
características similares a las del soluto. Se agrega en una concentración mayor que la del soluto pero menor
que la del disolvente. Las diferencias de solubilidad de distintas sustancias en Fluidos supercrítico se deben a
las características de los solutos sólidos tales como presión de vapor y a las interacciones particulares que se
establecen entre un soluto dado con el disolvente supercrítico. Como consecuencia de esto moléculas muy
parecidas pueden tener solubilidades muy diferentes ej: La extracción con CO2 supercrítico la cafeína de los
granos del café y de la teobromina de las hojas del té. Para el extracción de la cafeína el proceso es
excelente y no lo es así para la extracción de la teobromina del té a pesar de que la única diferencia entre
ambas moléculas es que donde tiene la teobromina un átomo de hidrogeno, la cafeína tiene un grupo
CH3.La extracción de cafeína es uno de los procesos más exitosos de extracción supercrítica, mientras que la
baja solubilidad de la teobromina en CO2supercr´ıtico impide el uso de este proceso para extraerla. Cerca de
100, 000 toneladas de café son tratadas anualmente con CO2 supercrítico para extraerlo totalmente.

Fluidos usados para extracción supercrítica

Para la extracción en fluidos supercríticos se utilizan las siguientes fases móviles: CO2, H2O, C2H6,
C2H4,C3H8,Xe,N2O El CO2 cuya temperatura critica de 31, 2oC cercana a la ambiente, se convierte en el
disolvente apropiado para manejar sustancias lábiles a pesar de que sus propiedades como disolvente son
mucho más modesta que las del agua. Por ejemplo son insolubles en CO2, incluso a altas densidades, las
sustancias polares y muchas no polares. La solubilidad de una sustancia en un disolvente supercrítico es en
general menor que en los líquidos convencionales., esto se compensa por que cuando se emplean FSC la
separación de soluto y disolvente le logra eficientemente mediante un simple proceso de expansión. Esto
evita tener que aumentar la temperatura para eliminar el disolvente por evaporación, como sucede con los
disolventes adicionales. Los procesos que emplean FSC son, en general, más caros que los convencionales
debido a costo de la etapa de compresión y del confinamiento de los fluidos.
Forma e inyección de la muestra

La introducción del líquido en CFS es similar a la inyección en HPLC. Las muestras en fase gaseosa no son
adecuadas para CFS. Los sólidos se extraen con los FSC y se concentra el extracto. El tipo de muestra que se
emplea en CFS con mayor frecuencia es una solución.

Columnas y fases estacionarias

Las columnas para CFS son prácticamente iguales a las de HPLC y algunas columnas en GC. Son de acero
inoxidable, y se empacan con partículas de 5 μm; los calibres pequeños de 250 y 530μm son los mas
comunes. Las fases estacionarias pueden ser del tipo que se emplean en HPLC normal o fase reversa: sılica
porosa, alúmina y sılica con grupos orgánicos enlazados.

Detectores

Los detectores de gases FID y UV en HPLC deben estar construidos para funcionar con el volumen
relativamente grande de gas que se produce al despresurizar el fluido supercrítico. Los detectores similares
a los que se utilizan en HPLC se modifican para tolerar las presiones necesarias para mantener a los fluidos
supercríticos.

Áreas donde se utilizan los fluidos supercrítico

Un área de reciente interés en la aplicación de los FSC es la de los procesos de descontaminación o

destrucción de residuos tóxicos. Suelos o sedimentos fluviales contaminados con pesticidas, como DDT y
otros contaminantes orgánicos han sido tratados exitosamente con CO2, mientras que fenoles y productos
relacionados han sido extraídos eficientemente de disoluciones acuosas. En lo relativo a los desechos
tóxicos, el agua supercrítica presenta una ventaja respecto a la incineración, ya que esta ´ultima requiere
temperaturas hasta de 1, 200oC, provocando la emisión de sustancias que contaminan el ambiente, entre
ellos las dioxinas producidas por la incineración incompleta especialmente las aromáticas policloradas..
Utilizando agua supercrítica a unos 500oC y en presencia de un oxidante es posible quemar sustancias
orgánicas completamente en una reacción térmicamente autosostenida, produciendo sólo nitrógeno,
dióxido de carbono y otras sustancias inorgánicas. El inconveniente radica en la alta corrosividad del agua
supercrítica sobre los materiales utilizados, lo que obliga a utilizar aleaciones especiales encareciendo el
proceso. Otras ´áreas de utilización de FSC son los métodos analíticos separativos en cromatografía
utilizando fluidos supercrítico, obtención de productos naturales y alimenticios(extracción de aceites
vegetales y grasa de semillas, drogas de plantas, aromas, sabores, perfumes y especias, eliminación de
nicotina del tabaco).separación de hidrocarburos pesados(desasfaltado de las fracciones pesadas del
petróleo, recuperación y purificación de lubricantes, licuefacción del carbón etc.) regeneración(carbón
activado, adsorbentes, filtros y catalizadores)agua potable a partir de agua de mar(oxidación de corrientes
acuosas que contienen productos orgánicos).
ELECTROFORESIS

Introducción

Una separación electroforética se lleva a cabo inyectando una pequeña parte de la muestra a una disolución
tampón que está alojada en un tubo estrecho o en un medio de soporte poroso y plano, como un tubo
estrecho, papel o un gel semisólido. Seguidamente se aplica un elevado potencial de corriente continua a
través del tampón mediante dos electrodos situados en los extremos del tampón. El potencial impulsa los
iones de la muestra a migrar hacia uno u otro extremo de los electrodos. La velocidad de migración de un
especie dada depende de su carga y su tamaño. Las separaciones en consecuencia se basan en las
diferencias en la relación tamaño carga entre los diferentes analitos presentes en la muestra. Cuanto mayor
es esta relaciónmás rápido migra un ion en el seno del campo eléctrico. La separación se lleva a cabo en un
medio tamponado que actúa simultáneamente como conductor de la corriente eléctrica y controlando o
fijando la carga eléctrica de las sustancias a analizar

Electroforesis

El término electroforesis se emplea para describir aquellas técnicas de separación que se basan en la
diferente movilidad que tienen las partículas cargadas en el interior de un campo eléctrico. Es un método de
separación que se basa en la diferente velocidad de migración de las especies cargadas, en el seno de una
disolución amortiguadora, a través de la cual se aplica un campo eléctrico constante. El parámetro más
importante de esta técnica es el campo eléctrico,(E) definido como el voltaje aplicado por unidad de
longitud del medio de separación, de acuerdo a esto podríamos decir que cuanto mayor sea el campo
eléctrico aplicado mayor sería la resolución que se podría obtener, puesto que mayor sería al velocidad de
migración de los diferentes componentes de la muestra no obstante a campo eléctricos elevados, la
corriente eléctrica que circula por el medio de separación va a ser alta y como consecuencia se va a generar
una cantidad de calor. Este calor es un inconveniente por varias razones a la hora de llevar a cabo una
separación por que puede generar gradientes de temperaturas, flujos de convección del tampón que
dificultaría la separación, desnaturalización de proteínas o perdidas de actividades enzimáticas etc. Para
solucionar estos problemas generados por el calor se han utilizado varios procedimientos, entre ellos
trabajar a campos electrices bajos, pero podríamos obtener tiempos de separación muy grandes y mala
resolución. trabajar con medios anticonvectivos, como los geles de poliacrilamida o garosa que de acuerdo a
su naturaleza microporosa son resistentes a la circulación del tampón. trabajar a campos eléctricos altos
pero la separación se da dentro de un capilar relleno de tampón esto ´ultimo dio origen a la electroforesis
capilar

Tipos de electroforesis

Existen dos tipos de electroforesis, electroforesis capilar y la electroforesis convencional.

Electroforesis convencional

Es utilizada para separar especies complejas, de elevado peso molecular, de interés biológico y bioquímico.
En la electroforesis convencional, las separaciones se llevan a cabo sobre una capa delgada y plana o placa
de un gel semisólido y poroso que contiene un tampón acuoso en el interior de sus poros. En estas placas se
pueden separar varias muestras simultáneamente como en cromatografía en capa fina. Las muestras se
disponen como manchas o bandas sobre la placa y se aplica el potencial de corriente continua, a través de la
placa, durante un periodo de tiempo fijo. Cuando creemos que las separaciones se ha completado se
interrumpe el paso de la corriente, y las especies separadas se tiñen para visualizarse. La velocidad de
migración de un ion en centímetros por segundo, en el seno de un campo eléctrico es igual

𝑣 = 𝜇𝑒 𝐸

E(V cm−1)

μe(cm2V −1 S−1)

La μe (movilidad electroforética) es directamente proporcional a la carga del analito e inversamente

proporcional a los factores de retardo por rozamiento. El potencial eléctrico actúa sobre los iones por lo que
se moverán a través del tampón. Las especies neutras no se separan. Para iones del mismo tamaño la fuerza
impulsora será mayor en el de mayor carga, y tendrá una movilidad de migración mas rápida. Para iones que
tengan igual carga la velocidad de migración será más rápida en el ion más pequeño. La relación tamaño-
carga de los iones cambiaran estos efectos.

Electroforesis capilar

La electroforesis convencional es lenta y laboriosa y además no proporciona resultados cuantitativos

precisos. La electroforesis capilar da lugar a separaciones con volúmenes de muestra de 0.1 a 10nL,
contrario a la convencional que usa volumen de uL. Aquí en vez de colorear, para identificar la sustancia se
utilizan detectores cuantitativos como los empleados en HPLC.

Velocidad de migración

La velocidad de migración depende de la intensidad del campo eléctrico aplicado. El campo eléctrico (E) se
determina por la magnitud del potencial aplicado (V en voltios) y la longitud sobre la que se aplica.

𝑉
𝑣 = 𝜇𝑒
𝐿

Factores que determinan la resolución en electroforesis capilar

• Numero de platos:

En cromatografía tanto la difusión longitudinal como la transferencia de masas contribuyen al

ensanchamiento de la banda. Como en electroforesis está implicada una sola fase, solo se considera la
difusión longitudinal. Para electroforesis el número de platos (N) viene dado por la siguiente expresión

𝑉
𝑁 = 𝜇𝑒
2𝐷

D = Coeficiente de difusión del soluto en cm−2S−1

Como la resolución se incrementa al aumentar el número de platos, se debe aplicar un elevado potencial
para obtener mayores separaciones. Obsérvese que aquí el número de plato no se incrementa con la
longitud de la columna. La electroforesis capilar genera normalmente un número de platos comprendido
entre 100.000 y 200.000 comparados con los 5.000 y 20.000 obtenidos en HPLC.

Flujo electroomostico

Cuando se aplica un potencial elevado a través de un capilar que contiene un tampón, se origina un flujo
llamado, flujo electroosmotico, gracias al cual el solvente migra hacia el ánodo o el cátodo. La causa del flujo
electroosmotico es la doble capa eléctrica que se forma en la interfase sılice/disolución. Figura 7.1 A valores
de pH por encima de 3 la pared interna de un capilar de sılice presenta carga negativa debido a la ionización
de los grupos silanoles (Si−OH) de la superficie. Los cationes del tampón se agrupan sobre la superficie
negativa de capilar de sılice para formar la doble capa eléctrica. Los cationes que están en la capa exterior
de la doble capa, son atraídos hacia el cátodo, y dado que los cationes están solvatados arrastran el resto de
la disolución con ellos a lo largo del capilar. La electroósmosis conduce un flujo en la disolución que tiene un
perfil plano, perpendicular al capilar, contrario del perfil parabólico del flujo en cromatografía líquida, cuyo
origen es la presión. Debido a este perfil plano el flujo electrosmotico no contribuye al ensanchamiento de
banda de manera significativa, como sí ocurre con el flujo producido por la presión en HPLC. Figura 7.2.
Aunque los analitos migran según su carga dentro del capilar, la velocidad del flujo electrosmotico es
normalmente suficiente como para arrastrar todos las especies cargadas positivamente, los neutros y los
cargados negativamente hacia el mismo extremo del capilar, de tal forma que todos ellos pueden detectarse
al pasar por un punto común. El electroforegrama es similar a un cromatograma. La velocidad de flujo
electrosmotico viene dada por una ecuación similar a la anteriormente vista, esto es:𝑣 = 𝜇𝑒0 𝐸

En presencia de la electroósmosis la velocidad de un ion es la suma de su velocidad de migración y de la

velocidad del flujo electrosmotico así:

V = (𝜇𝑒0 + 𝜇𝑒 )E

μe = En caso de un anión tendrá signo negativo

Como consecuencia de la electroósmosis, el orden de elución en una separación por electroforesis capilar
típica es:

Figura 7.1: Flujo electroosmotico

 Figura 7.2: Perfil del flujo electroosmotico

Primero los cationes más rápidos, seguido de los más lentos, segundo las especies neutras en una zona y
finalmente los aniones. Figura 7.3 En algunos casos la velocidad de flujo electrosmotico no es lo bastante
grande como para superar la velocidad a la cual se mueven algunos aniones hacia el ánodo, en cuyo caso
estas especies se desplazan hacia el ánodo.

Cambio de sentido del flujo electroosmotico

Se logra agregando un tensoactivo catiónico al tampón. El tensoactivo se adsorbe sobre la pared del capilar
y hace que esta quede cargada positivamente. Ahora los aniones del tampón se agrupan en las
proximidades de la pared y son arrastrados hacia el ´ánodo, electrodo positivo. Esta estratagema se usa a
menudo para acelerar la separación de los aniones. El flujo electroosmotico puede ser eliminado
recubriendo la pared interna del capilar con un reactivo como el trimetilclorsilano para eliminar los grupos
silanoles de la superficie.

Instrumentación

Consta de un capilar de sılice fundida con 10-100 μm de diámetro interno de 40 a 100 cm. de longitud y que
está lleno de un tampón conectado entre si por dos recipientes que contienen el mismo tampón, que
también contienen dos (2) electrodos de platino. La introducción de la muestra se lleva a cabo por uno de
los extremos y la detección por el otro extremo. Figura

Introducción de la muestra

Inyección electrocinética

Un de los recipientes del capilar se retira con su respectivo electrodo. Luego este extremo es sumergido en
el recipiente donde se encuentra la muestra y se le aplica un potencial determinado hasta que la muestra
penetre en el capilar debido a la actuación conjunta de los fenómenos de migración iónico y flujo
electroosmotico. Luego el extremo retirado se coloca nuevamente en la solución tampón original donde se
mantiene durante el proceso de separación. Figura. 7.5
Inyección por presión

Se retira un extremo del capilar y se introduce en el recipiente de la muestra, a la cual se le aplica una
diferencia de presión. Esta diferencia de presión proviene de aplicar vacío en el extremo del detector o de la
aplicación de presión en el recipiente que contiene la muestra, o bien por elevación del extremo que
contiene la muestra. En ambos casos el volumen inyectado se controla por la duración de la inyección. 5-50
nL son los más comunes.

Figura 7.3: Dirección del flujo electroosmotico

Figura 7.4: Componentes básicos de un sistema de electroforesis capilar

 Figura 7.5: Métodos de
introducción de muestra

Sistema de detección

Los detectores son similares en diseño y función a los utilizados en HPLC. La diferencia está en el
comportamiento de ´estos; en electroforesis capilar cada ion migra a una velocidad determinada debido a su
movilidad electroforética. Por tanto las bandas del analito llegan al detector a diferentes velocidades, lo que
hace que las áreas de los picos sean dependientes del tiempo de retención. En cambio en HPLC todas las
especies pasan a través del detector a la misma velocidad de la fase móvil, así que las áreas de los picos son
independientes de los tiempos de retención.

Métodos de absorbancia

El camino óptico para las medidas de absorbancia es muy pequeño, y para mejorar estas medidas se han
propuestos varios métodos.

1. a) Celda tipo Z de 3 mm: Se dobla el extremo del capilar para aumentar el camino óptico

2. b) Celda de tipo burbuja de 150 μm: Se forma una burbuja cerca del capilar

3. c) Celda de reflexiones múltiples: En el extremo del capilar se deposita un recubrimiento de plata

reflectante, y la radiación experimenta numerosas reflexiones antes de salir del capilar. Figura.7.6

Modalidades de la electroforesis capilar

La electroforesis capilar es el nombre genérico para una familia de técnicas relacionadas que tiene su origen
en la electroforesis capilar por zona (CZE) y son: electroforesis capilar por gel(CGE), enfoque isoeléctrico
capilar(CIEF), cromatografía capilar miscelar electrocinética (MECC) y la isotacoforesis capilar(CITP). Aunque
las técnicas difieren signicativamente una de otras, se pueden llevar a cabo con la misma instrumentación
básica.

Electroforesis capilar por zona (CZE)

La composición del tampón es constante en toda la zona de separación. El potencial aplicado hace que los
diferentes componentes iónicos de la mezcla migren cada uno según su propia movilidad y se separen en
zonas.
Electroforesis capilar en gel (CGE)

Se lleva a cabo en una matriz polimérica con estructura de gel poroso, cuyos poros contienen una mezcla
tampón en la que se lleva a cabo la separación.

Isotacoforesis capilar

Las bandas de todos los analitos migran finalmente a la misma velocidad, por eso recibe el nombre de ISO,
igual y TACO velocidad. La razón por la cual todas las bandas se mueven a la misma velocidad es que el
potencial se hace mas reducido para las bandas más móviles, y se hace mas intensa para las bandas mas
lentas, de tal forma que la corriente es la misma en todas las zonas del tamp´on. (A. & F.J 1999)

Figura 7.6: Diseños de celda para mejorar la sensibilidad de detección por medida

de absorbancia aumentando el camino ´óptico