UNIVERSIDAD DEL VALLE NORMA: VERSIÓN:

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

FECHA DE REVISIÓN:
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

METABOLISMO: LA LEVADURA COMO ORGANISMO MODELO DE LA VÍA

ANAERÓBICA.
ELABORADO POR: REVISADO POR: APROBADO POR:
Departamento de Química

1. OBJETIVOS
 En virtud del nivel formativo que el estudiante de química deberá tener en este
semestre, los objetivos deberán ser inferidos por el estudiante a partir de la
lectura de la presente guía.

2. INTRODUCCIÓN

La célula como unidad fundamental de la vida, requiere de energía para mantener sus
diversas funciones. Esta energía se suele obtener mediante una serie de reacciones
químicas mediante las cuales la célula degrada diferentes tipos de moléculas (rutas
metabólicas) de origen orgánico (azúcares, grasas, aminoácidos).

La glucolisis (o glicólisis) es una

½ O2 H2O+ CO2
vía metabólica universal. En ella
se produce piruvato a partir de
glucosa (en relación 2:1) y una
serie de intermediarios.
Omitiendo al ADP/ATP en este
particular, la reacción total
+ +2H+
podría considerarse como la 6

transferencia de dos hidruros de

la glucosa a dos moléculas de
NAD+ (figura 1).

Como tal coenzima se encuentra

sólo en cantidades catalíticas, es 2
2H++
necesario regenerarla Figura 1. Oxidación aeróbica y anaeróbica de
(reoxidarla) para que el proceso la glucosa en la levadura.
no se suspenda, de modo que en
condiciones aeróbicas el NADH formado es reconvertido a NAD+ por oxigeno molecular
a través de la cadena respiratoria. Esto no es posible en condiciones anaeróbicas:
donde la reoxidación se efectúa cuando el piruvato se convierte en acetaldehído, y
luego en alcohol.
Las levaduras, son hongos unicelulares anaeróbicos que regeneran el NAD + mediante la
descarboxilación del ácido pirúvico y la reducción del acetaldehído resultante,
generándose así etanol y CO2, algo que ha sido aprovechado para producir bebidas
alcohólicas espumosas, como sucede con la cerveza o la champaña.

3. MATERIAL Y REACTIVOS
Material Reactivos
Microespátula de acero (1) Levadura fresca.
Cronómetro (1) Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4)
Termostato (1) Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)
Termómetro (1) Glucosa, Fructosa.
Tubos de ensayo PYREX grandes (10) Galactosa
Vasos de precipitados de 25 mL (4) Maltosa
Vasos de 100 mL (2) Sacarosa
Probeta 100 mL (1) Hidróxido de amonio
Goteros (2) Sulfato de amonio
Jeringa (2) Sulfito de sodio
Escobillón (1) Fluoruro de sodio
Frasco lavador (1) Hidróxido de sodio
Vidrio Reloj (1) Hidrocloruro de 2,4-dinitrofenilhidrazina
Pipetas graduadas de 1 mL (4) Ácido clorhídrico
Pipeta graduada de 5 mL (1) Piperidina
Pipeta volumétrica de 0,5 mL (1) Nitroferrocianuro de sodio (nitroprusiato de sodio)
Pipeta graduada de 2 mL (1) Ácido tricloroacético
Gradilla (2)
La concentración y composición de cada una de las soluciones empleadas en esta
práctica se encuentra descrita en el Anexo 2.

4. PROCEDIMIENTO 1. mientras se pide material. otro

compañero pone el baño María a 37
ATENCIÓN: i) Cuando vayan a tomar alícuotas de levadura debe hacerlo mientras
está siendo agitada magnéticamente para asegurar homogeneidad, apague la agitación
una vez termine; ii) Los procedimientos 4.1 y 4.2 deberán realizarse simultáneamente.

4.1 Pruebas de sustrato para levadura.

En diferentes tubos de ensayo adicione 1 mL de solución de azúcar (maltosa,
galactosa, lactosa, glucosa, fructosa o sacarosa) y 1 mL de levadura en agua, mezcle
bien e incube 37 oC durante 1 h. Realice un control sin azúcar. Agite de vez en cuando.
Anote sus observaciones.

4.2 Producción de metabolitos

4.2.1 Formación de acetaldehído a partir de glucosa.
En un tubo de ensayo adicione 5 mL de solución de glucosa y 5 mL de levadura en
agua, mezcle bien. Pese 0,5 g de bisulfito de sodio, adicionelo al tubo de ensayo, agite
vigorosamente e incube 37 oC durante 1 h. Su experimento “control Ac” será como
el anterior SALVO que no llevará bilsulfito. Prosiga en 4.3 Pruebas de identificación.
 4.2.2 Formación de Piruvato a partir de glucosa.
Adicione en un tubo pyrex grande 5 mL de solución de glucosa y adicione 5 mL de
solución de levadura en solución de buffer de fosfato (0,1 M) a pH 8,5. Coloque el tubo
en el termostato a 37oC durante 1h agitando de vez en cuando. Posteriormente añada
2 mL de solución de ácido tricloroacético, mezcle vigorosamente y centrifugue (o
decante) durante 10 min y separe el sobrenadante. Su experimento “control Pi”
será como el anterior SALVO que la levadura deberá estar en agua y no a pH básico.
durante 1 hora de espera se prepara logística de
Prosiga en 4.3.
las sgtes etapas. 4.3.1 y 4.3.2

4.3. Identificación cualitativa de metabolitos.

Realice estos dos procedimientos con los cuatro sobrenadantes (por parte) que obtuvo
de los pasos 4.2.1 y 4.2.2 (incluidos en esos cuatro los controles); haga las prueba
4.3.1 (y después la 4.3.2) simultaneamente para cada uno de los cuatro
sobrenadantes de modo que pueda realizar fácilmente comparaciones.

4.3.1 Determinación de metabolitos con 2,4-dinitrofenilhidrazina.

Agregue 3 gotas de solución saturada de 2,4-dinitrofenilhidrazina a 5 gotas de cada
sobrenadante, mezcle fuertemente (observe). Después coloque dos gotas de la mezcla
resultante en un tubo de ensayo, diluya con 5 gotas de agua y adicione goga a gota
(máximo 3) hidróxido de sodio al 10% (con cada gota registre sus observaciones).

4.3.2 Determinación de metabolitos con el reactivo de Simon

Mezcle 5 gotas de sobrenadante con 2 gotas de solución fresca de nitroprusiato de
sodio (muy tóxico) y 5 gotas de piperidina (muy tóxica) acuosa fresca, agite. Si se
ecnuentra el metabolito que se esperaba acumular se observará una coloración azul
intenso inicial que va cambiando a rojo a café.

4.4. Cuantificación de CO2 en respiración anaeróbica.

Rotule cuatro tubos del 1 al 4. Añada y mezcle bien lo siguiente:

Tubo 1: 2mL de la disolución de azúcar asignada y 1mL de agua.

Tubo 2: 2mL de la disolución de azúcar asignada y 1mL de NaF 0.005M.
Tubo 3: 2mL de la disolución de azúcar asignada y 1mL de NaF 0.05M.
Tubo 4: 2mL de la disolución de azúcar asignada y 1mL de NaF 0.5M.

La fermentación se inicia en el momento en que se añade a cada tubo 2 mL de

suspensión de levadura en agua; solo añada la levadura al siguiente tubo si ya realizó
para el primero el montaje indicado en el anexo 1 y según este procedimiento:

a. Llene una pipeta graduada de 1mL con la solución del tubo YA CON LEVADURA.
b. Tape el extremo con el dedo mientras sella el lado opuesto con cinta aislante, chicle,
parafilm o cinta de teflón.
c. Utilizando una jeringa, continúe llenando la pipeta graduada con la solución hasta
que se desborde.
 d. Invierta la pipeta. Si todo esta bien no debería haber pérdida de líquido por el
extremo no sellado. Si es así colóquela dentro del tubo de ensayo respectivo e
incube todo a a 37oC.

Durante la fermentación, el CO2 se acumulará en el extremo superior de la pipeta.

Anote el volumen de CO2 producido (al menos a la décima de mL) en cada pipeta a los
diferentes tiempos, por ejemplo 2, 5, 10, 15, 30, 45 y 60 minutos, o según su
criterio para tener una cinética representativa.

5. TRATAMIENTO DE DESECHOS

Al final del curso el profesor indicará el protocolo respectivo para llevar a cabo el
tratamiento de cada uno de los desechos generados en la presente práctica. Sin
embargo, esto no exonera al estudiante de hacer la respectiva búsqueda bibliográfica
que deberá ser consignada en sus preinformes

6. CÁLCULOS Y RESULTADOS

A parte de resolver las preguntas, recuerde que el informe debe contener, entre otros:
 Las ecuaciones de las reacciones químicas llevadas a cabo en la práctica.
 Tablas de resultados con las pruebas cualitativas.
 Análisis de cada prueba cualitativa.
 Comparación con los resultados de al menos otros dos grupos.

Además, recuerde registrar el tiempo y el volumen exacto de CO 2 producido durante la

fermentación y con base a ello realice el análisis cinético respectivo.

7. PREGUNTAS

Preguntas a resolver en el preinforme

Como adición al formato del preinforme establecido, usted debe cumplir; las medidas
de seguridad en el laboratorio y responder las siguientes preguntas:

I. El oxígeno no es la única molécula que se emplea como aceptora de electrones en

la cadena respiratoria, existen organismos que emplean diferentes sustancias
inorgánicas como aceptoras de electrones: mencione un ejemplo. En los dos
casos, ¿De dónde provienen esos electrones?
II. ¿Por qué se acumula piruvato cuando las levaduras crecen en condiciones
alcalinas?
III. ¿Por qué se acumula acetaldehído cuando las levaduras crecen en presencia de
bisulfito?
IV. ¿Qué función tiene el ácido tricloroacético al 10%?
 Preguntas a resolver en el informe

I. ¿Se podría emplear el acetaldehído producido para algún fin industrial? ¿Las
levaduras podrían crecer eficientemente en un medio rico en este metabolito?
Explique su respuesta.

II. Las condiciones en las que se trabajó en esta práctica no garantizan que el único
microrganismo que esté presente sea la levadura. ¿Qué cambios a la metodología
permitirían esto? ¿Qué efecto tendría en una fermentación para producir vino que
crecieran un exceso de bacterias así estas no fueran perjudiciales para la salud
del consumidor final?
III. ¿Tiene tiene alguna relación el efecto del bisulfito observado en la práctica, con el
uso que se da a este agente químico (o derivados) en la industria vinicola?

8. BIBLIOGRAFÍA

(1) Restrepo, J. Manual de Practicas de Bioquímica; Facultad de ciencias naturales y

exactas, U. del V., Ed.; Cali, Colombia.

(2) Richards, O. W. V; Haynesi, F. W. Oxygen Consumption and Carbon Dioxide. No.

2335, 139–144.

(3) J, Q. Fluoride Inhibition of Enolase: Crystal Structure and Thermodynamics.

Biochemistry 2006, 45 (3), 793–800.
 ANEXOS

ANEXO 1. MONTAJE EMPLEADO PARA LLEVAR A CABO LA DETERMINACIÓN DE

PRODUCCIÓN DE CO2.

Las pipetas graduadas de 1 mL se sellaron con Parafilm; en la imagen del lado derecho
se puede observar el volumen desplazado por el CO2 en cada una de las pipetas.

ANEXO 2. SOLUCIONES DE TRABAJO.

SOLUCIÓN CONCENTRACIÓN
Clorhidrato de 2,4-dinitrofenilhidrazina Solución saturada en H3PO4
Levadura 10 % en buffer fosfato de sodio 0,1M a pH 8,5
Levadura 10 % (en agua)
Glucosa 12,5 % (en agua)
Sacarosa 12,5 % (en agua)
Fructosa 12,5 % (en agua)
Galactosa 12,5 % (en agua)
Lactosa 12,5 % (en agua)
Maltosa 12,5 % (en agua)
NaOH 10 %
Piperidina 3%
Ácido tricloroacético 10 %
Nitroprusiato de sodio 50 g/L
NaF 0,5 M ; 0,05M y 0,005M
Tampón fosfato de sodio pH 8,5 0,1M