Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional De Ciencias Biológicas

Laboratorio de Métodos de análisis

Verificación del buen funcionamiento de un espectrofotómetro

Alumno: León Valverde Mario Santiago

Grupo: 4IM1

Sección: 2

Maestro: Fernández López Francisco Carmelo

Objetivos:
 Evaluar el rendimiento de un espectrofotómetro a partir de diferentes pruebas
experimentales
 Verificar el rendimiento global del instrumento en cuestión
Resultados:

Tabla 1. Espectro de Transmisión del filtro de Didimio

Longitud de Longitud de
onda (nm) %T onda (nm) %T
400 44 500 52
410 52 510 40
420 55 520 28
430 48 530 31
440 45 540 50
450 46 530 65
460 46 560 57
470 43 570 30
480 48 580 7
490 57 590 6

Grafica 1.

Espectro de Transmisión del filtro de

Didimio
70
60
50
%T

40
30
20 %T
10
0
460
470
400
410
420
430
440
450

480
490
500
510
520
530
540
550
560
570
580
590

λ
Tabla 2. Espectro de Transmisión de la solución de NiSO4*6H2O al 20%
Longitud de Longitud de
onda (nm) %T onda (nm) %T
380 3 490 83
390 3 500 85
400 4 510 85
410 4 520 83
420 7 530 79
430 16 540 76
440 30 530 72
450 42 560 67
460 52 570 61
470 63 580 51
480 71 590 42

Grafica 2.

Espectro de Transmisión de la
solución de NiSO4*6H2O al 20%
100

80

60
%T

40
%T
20

0
380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580
λ

Tabla 3. Proporcionalidad entre A y λ para el NiSO4*6H2O al 20%

Longitud de onda (nm) Absorbancia
530 0.102
540 0.119
550 0.142
560 0.173
570 0.214
Grafica 3.

Proporcionalidad entre A y λ para el NiSO4*6H2O

al 20%

0.25 y = 0.0028x - 1.379

0.2 R² = 0.9716
Absorbancia

0.15
0.1 Absorbancia
0.05 Linear (Absorbancia)
0
520 530 540 550 560 570 580
λ

Tabla 4. Exactitud fotométrica. Método de la solución estándar del NiSO4*6H2O al

20%
Longitud de onda 400 nm 500 nm
Parámetro
Intervalo de absorbancia 1.4 – 1.8 0.03 – 0.05
esperada
Absorbancia medida 1.522 0.06

Tabla 5. Intervalo dinámico lineal de la concentración

Tubo Concentración A400
a a’ de NiSO4*6H2O Serie a Serie b
(M)
1 1’ 0 0.000 0.000
2 2’ 0.0095 0.045 0.040
3 3’ 0.0285 0.136 0.130
4 4’ 0.0665 0.309 0.309
5 5’ 0.1045 0.481 0.468
6 6’ 0.1425 0.619 0.619
7 7’ 0.1520 0.657 0.657
8 8’ 0.1710 0.744 0.744
9 9’ 0.1805 0.823 0.823
10 10’ 0.1900 0.920 0.920
 Grafica 4.

Curva de calibracion
1
y = 4.5381x - 0.002
0.8 R² = 0.9937

0.6
A400

0.4 A400
Linear (A400)
0.2

0
0 0.05 0.1 0.15 0.2
-0.2
NiSO4*6H2O (M)

Tabla 6. Resumen de resultados de evaluación del funcionamiento del

espectrofotómetro.
Parámetro Estudiado Valores de Valores
referencia experimentales
Exactitud de la escala de longitud de onda
1. Filtro de Didimio
Máximos (λ, nm) 420, 490, 550 420, 490, 450
Mínimos (λ, nm) 440, 470, 520, 590 440, 470, 520, 590
2. Solución de NiSO4*6H2O al 20%
Máximos (λ, nm) 500 500,510
Mínimos (λ, nm) 400 380,390
Proporcionalidad Fotométrica
Datos de regresión de 530 570 nm r = 0.97-0.98 r = 0.986
Luz Dispersa
%T a 400 nm (Solución de NiSO4*6H2O al 20%) 4 2
%T a 450 nm 0-1 0
%T a 500 nm 0-1 0
Ancho de Banda
%T a 500 nm 500-510 500-510
Exactitud Fotométrica
1. Método del filtro de vidrio neutro
%T a 500nm 85 85
2. Método de la solución de NiSO4*6H2O al 20%)
A400 1.4 - 1.8 1.522
A500 0.03 - 0.05 0.06

Intervalo Dinámico lineal de concentración

Datos de la regresión lineal intervalo de concentración r = 0.99 r = 0.9926
Discusión:
A) Exactitud de la escala de longitud de onda.
A.1) Método del filtro de tierras raras (Didimio)
¿Coincidieron los máximos y/o mínimos con las longitudes informadas por el fabricante?,
¿En qué longitudes de onda no fue así?
Coincidieron con los valores proporcionados por el fabricante.
A.2) Método de la solución de la solución estándar (NiSO4*6H2O al 20%)
¿Cómo es la exactitud de la escala de la longitud de onda del espectrofotómetro a la
longitud de onda donde se obtiene el mayor valor de %T?
Esta es a 500 nm, y la exactitud es mayor para esta longitud de onda puesto que en este
punto se obtiene una menor desviación en la exactitud fotométrica.
Describa ventajas y desventajas de los métodos empleados en la práctica para estimar la
exactitud de la escala de longitud de onda.
Ventajas:
 La prueba es sencilla de realizar.
 El procedimiento no requiere de mucho tiempo para realizarlo.
 Los resultados obtenidos son confiables.
Desventajas:
 La preparación de la soluciones resulta ser un paso crítico para esta prueba.
 Los materiales utilizados tienen un precio elevado.
 La preparación de las soluciones requiere de una cantidad moderada de
materiales.
 Los errores que cometa el analista tendrán repercusiones considerables en los
resultados.
Con esta prueba se determina la escala de la longitud de onda del equipo al observar
los espectros de transmitancia, se corrobora que efectivamente los espectros
obtenidos coinciden con los proporcionados con los del fabricante.
B) Proporcionalidad Fotométrica
Ecuación obtenida por mínimos cuadrados.
𝑦 = −1.3857 + 2.7933 ∗ 10−3 (𝑥) 𝑟 = 0.986
De acuerdo los resultados obtenidos, podemos decir que la proporcionalidad fotométrica
se cumple debido a que el coeficiente de correlación es muy cercano al proporcionado.
Los resultados obtenidos nos indican que tenemos una respuesta lineal para e intervalo
de longitudes de onda seleccionados.
Con esta prueba se comprueba el funcionamiento general del instrumento en base a los
valores esperados y a los valores calculados, una manera de comprobarlo es a través
coeficiente de correlación, el cual se encuentra en el intervalo aceptado.
C) Luz dispersa.
Los valores obtenidos con los filtros son correctos pues las lecturas son de cero para él
%T, sin embargo la lectura a 400 nm nos arrojó un valor de 2 y no de 4 como el esperado,
lo que nos indica que puede haber luz dispersa, sin embargo en este punto es importante
aclarar que al momento de realizar esta prueba se cometió un error por parte del analista,
se trabajó en el Espectronic 20 de Baush y Lomb, para este equipo es vital que no se
muevan las perillas al momento de realizar las lecturas pues es un equipo de tipo
analógico, era de vital importancia que él %T en cero nunca se moviera, pues si se
comete un error desde el inicio, este error será constante durante toda la práctica y no
afectara los resultados.
La parte del equipo que se pone a prueba es el dispersor, parte del sistema
monocromador, en caso de encontrar luz dispersa puede ser debido a que el dispersor se
encuentra desalineado y no entrega las longitudes de onda deseadas.
D) Ancho de Banda.
¿Qué se puede concluir respecto al ancho de banda del instrumento?
Que es correcto pues el intervalo para el ancho de banda proporcionado coincide con el
observado que es de los 500 a los 510 nm.
Si el porcentaje de %T se incrementó, ¿Qué ocurrió con el ancho de banda? ¿Qué ocurre
si el disminuye?
El ancho de banda aumenta si él %T aumenta y por el contario; el ancho de banda
disminuye si él %T disminuye.
La parte del equipo que se prueba es la ranura de salida del sistema monocromador, pues
el ancho de banda se refiere a conjunto de ondas que llegan a la muestra, estas
longitudes de onda son proporcionadas por este sistema del equipo.
E) Exactitud Fotométrica.
Si se tiene como permisible una variación máxima del 5%T en el valor obtenido, respecto
al de referencia, ¿Qué se puede concluir sobre la exactitud fotométrica del instrumento?
La exactitud del instrumento es relativamente baja pues hay un intervalo del 5% de
variación en la lectura, lo cual nos indica que no es un equipo tan exacto.
¿Qué puede ocurrir con la exactitud fotométrica si la escala de longitud de onda está mal
calibrada?
Por consecuencia la exactitud fotométrica tendrá resultados deficientes debido a que la
exactitud fotométrica depende de la escala de la longitud de onda.
El espectrofotómetro tiene exactitud fotométrica, al menos eso se puede comprobar con
uno de los filtros, a l realizar la lectura a 400 nm, la lectura queda dentro del intervalo
aceptado, sin embargo a 500 nm la lectura se desvía del intervalo aceptado, esto también
puede deberse al error que se cometió con el equipo como se mencionó en el apartado de
“luz dispersa”.
En esta prueba se pone de manifiesto el funcionamiento del detector, al comparar las
respuestas registradas con los valores esperados.
F) Intervalo Dinámico Lineal De Concentración
Ecuación obtenida a partir de regresión lineal
𝑦 = 4.6 ∗ 10−4 + 4.5206(𝑥) 𝑟 = 0.9926
El intervalo dinámico lineal de concentraciones es aquel en el que observa una respuesta
lineal entra la absorbancia y la concentración, lo cual se puede corroborar con el
coeficiente de correlación el cual se encuentra en los valores esperados.
El intervalo nos da un panorama acerca de la forma en que trabaja el equipo, si este se
encuentra por debajo del valor esperado, es probable que el equipo en general tenga
fallas en su funcionamiento, aunque no se podría saber únicamente con esta prueba
donde está fallando el equipo.
Conclusiones:
El equipo utilizado:
Tiene exactitud en la escala de longitud de onda.
Presenta proporcionalidad fotométrica.
Parece presentar luz dispersa.
Tiene un ancho de banda correcto.
Tiene exactitud fotométrica
Se encuentra en condiciones óptimas de trabajo, la prueba que lo demuestra es el
intervalo dinámico lineal de concentraciones.
Preguntas:
1.- Señale dos causas que originen:
a. Luz extraña
Pequeña imperfección o ruptura en la entrada de los cables del aparato
Imperfecciones en la superficie de la celda
b. Cambio en el ancho de banda.
Presencia de ruido (señal extraña) durante el procedimiento.
Problemas en el sistema de iluminación.
c. Alteración de la respuesta relativa o rendimiento instrumental
Problemas de ajuste del monocromador
Flujo de electricidad inestable.
Bibliografía:
 Clare J.L. (2005) Calibration of UV-vis spectrophotometers for chemical analysis.
Accreditation and Quality Assurance 10: 283-288.
 Blázquez, J. (2005) Calibración de espectrofotómetros para la medida directa de
absorbancias, Gestión de Calidad en Laboratorios.
http://www.iberolab.org/opencms/opencms/congreso/IberolabIII2005/ind ex.html
 Duymovich, C., Acheme, R; Sesini, S; Mazziotta, D. (2005) Espectrofotómetros y
fotocolorímetros: Guía práctica de actualización. Acta Bioquímica Clínica
Latinoamericana 39: 529-539