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MICROBIOLOGÍA
TEXTO GUÍA PARA EL ALUMNO
Carrera de Medicina
MEDI 4032
ÍNDICE DE CONTENIDOS
Tema Página
UNIDAD 1: BIOSEGURIDAD
Definiciones 3
Simbología 3-4
Categorías del Riesgo 5
Gestión de Riesgos 5
Normas de Bioseguridad 6
Bioseguridad en la Práctica Médica 7
Origen de las Amenazas en Bioseguridad Médica 8
Disminución de Riesgos en Bioseguridad 9
Precauciones Universales 9
Medidas de Contención 10
Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología 11
Niveles de Bioseguridad 11-12
Accidentes de Bioseguridad en Microbiología 13
Ejercicios de aplicación de contenidos (bioseguridad) 13-14
Actividad de laboratorio n° 1 y 2 (bioseguridad) 15-16
Desinfección y antisepsia 17-18
El efecto de los agentes químicos sobre los microrganismos 19-20
Efecto de factores físicos sobre los microrganismos: calor 21-24
Efecto de las radiaciones, Luz Ultravioleta 24-27
Efecto de las radiaciones, Radiación Gamma 27
Esterilización 28-32
Ejercicios de aplicación de contenidos (antisepsia, desinfección y esterilización) 33
Actividad de Laboratorio n°3 al 5 (aislamiento de bacterias) 34-37
Actividad de Laboratorio n°6: observación macroscópica de cultivos 38-39
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UNIDAD 1
BIOSEGURIDAD
Definiciones y simbologías
El riesgo de accidentes con cualquier agente (químico, físico o biológico) está siempre
presente, pero se hace cuantitativamente menor o mayor dependiendo del grado de control de las
circunstancias que determinan la ocurrencia del accidente. Para dar una dimensión objetiva al
riesgo, podemos darle una categoría de valor bajo, medio o alto.
La existencia de estos distintos agentes, o los acontecimientos que los liberan o desencadenan son
llamados AMENAZAS.
El grado de daño que una determinada Amenaza es capaz de infligir sobre lo protegido
puede ser categorizado (como magnitud) y medido (como probabilidad). A la asociación de estas
categorías de magnitud y probabilidad la llamaremos PELIGRO.
Ejemplos:
Cianuro de Potasio.
Acetato de Talio (veneno rodenticida)
Fluoruro de Sodio (anticoagulante usado para la toma de muestras para medición de
niveles de glucosa).
Oxido de Etileno (agente esterilizante).
Formaldehído (agente conservador de tejidos y esterilizante).
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Categorías de Riesgo:
Una forma práctica de objetivar el nivel de riesgo y a la vez establecer un criterio común
de valor entre las personas que ven expuestas a diversas amenazas es asignar categorías de riesgo.
Como ahora tenemos asignados valores a las amenazas y sus correspondientes daños,
podemos asociarlos mediante una matriz de numérica, que representa una relación matemática
entre el nivel de la amenaza y su daño resultante (peligrosidad)
Categoría de Riesgo:
MAGNITUD DEL DAÑO X PROBABILIDAD DE AMENAZA
Una vez establecidas estas categorías es posible efectuar MANEJO O GESTION DE RIESGO a
nivel institucional.
Gestión de Riesgos:
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como resultado el conjunto de NORMAS DE BIOSEGURIDAD, que cada institución adopta para la
seguridad de sus profesionales (equipo médico) y trabajadores, de las personas beneficiarias de la
organización (pacientes), y del medio en el que está inserta (ambiente y sociedad).
Normas de Bioseguridad
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Como en cualquier proceso infeccioso, ocurre una alteración del equilibrio de la Tríada
Ecológica en la que se relaciona AMBIENTE – AGENTE – HOSPEDERO.
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Las fuentes de amenazas en los ambientes médicos están vinculadas a acciones del público
que recibe atención, sus acompañantes, servicios de apoyo interno o externo, servicios informales,
acciones del equipo de salud y personal administrativo. La alta concurrencia al servicio hospitalario
y la gran variedad de acciones que allí se verifican especialmente cuando existe desorganización y
falta de medidas de control facilitan la ocurrencia de amenazas a la bioseguridad.
De esta forma, los pacientes con estados infecciosos y la disposición de residuos biológicos
representan una importante fuente de amenazas a la bioseguridad.
La forma adecuada de mantener estas amenazas bajo control es una adecuada Gestión de Riesgos.
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www.ssvaldivia.cl/hospital/acredita/...iih/04%20NORMA%206.doc
Medidas de Contención
Podemos clasificar las Medidas de Contención en dos grandes grupos dependiendo del
objetivo de aplicación:
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Las vías de infección en este tipo de accidentes son por inhalación, ingestión o percutánea.
Acciones como el trabajar sin guantes al manipular muestras o cultivos, pipeterar directamente
con la boca, olfatear cultivos, no usar mechero para generar un área protegida, pasarse los
guantes usados por la piel, el pelo o la ropa, comer en el laboratorio, no lavarse las manos al
terminar la actividad, constituyen un riesgo de contaminación y eventualmente de infección con
agentes biológicos, tanto para el alumno como para la comunidad.
En el caso de ocurrir cualquiera de estos accidentes que implique contacto con agentes
biológicos, el alumno DEBE AVISAR DE INMEDIATO AL PROFESOR. NO ACTUAR POR INICIATIVA
PROPIA.
1.- Un sujeto liberó el contenido de un frasco con caldo de cultivo de Vibrio cholerae en un
canal de regadío de hortalizas. Responde lo siguiente:
Señala dos amenazas evidentes en este hecho:
-
-
¿Qué clases de amenazas son, de acuerdo a los hechos?
2.- La cepa de Vibrio cholerae resultó no poseer el gen que codifica la enterotoxina. De
acuerdo a los hechos y antecedentes, asigna un valor objetivo y una categoría al riesgo (alto,
medio, bajo). Da dos fundamentos para tu respuesta:
-
-
3.- El profesor le entregó a los alumnos del ramo de microbiología unas placas de cultivo
con Escherichia coli, Streptococcus pyogenes y Neisseria meningitidis.
Averigua respecto del potencial patógeno de estos agentes y ordénalos según peligro de la
amenaza, de menor a mayor.
-
-
-
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4.- Aparte de los microrganismos, hay otras amenazas latentes en el enunciado, discútelas
con otros alumnos y responde cuáles son.
5.- ¿Cuál es la categoría de riesgo que asignarías a un grupo de escolares que tiene a un
compañero de curso con meningitis meningocócica, el que ha sido diagnosticado como caso
índice?
Anota tus fundamentos.
6.- La cepa de Neisseria meningitidis del caso anterior ha sido aislada y referida al Instituto
de Salud Pública (ISP) mediante protocolo de notificación obligatoria. ¿Cuál será la categoría de
riesgo para el microbiólogo del ISP que trabaja con esta cepa, si está en un laboratorio de Nivel III?
Dale valor numérico al riesgo y fundamenta.
7.- Averigua un poco antes de responder, luego propone un nivel de bioseguridad para
trabajar con los siguientes agentes o muestras:
- Determinación de anticuerpos anti VIH
- Urocultivo
- Micobacterium avium
- Vibrio cholerae biotipo El Tor
- Virus EBOLA
- Bacillus pumilus
- Variola virus
- Alternaria solani
8.- Hoy recibiste el honor de ser nombrado Jefe del Comité de Infección Intrahospitalaria.
La Enfermera Jefe del establecimiento te ha solicitado una medida urgente para evitar los
desplazamientos innecesarios del público dentro del establecimiento por el riesgo de introducción
de agentes infecciosos. ¿Qué medida propones, cómo la implementas? Seguramente ya estuviste
en algún hospital y viste la aplicación, trata de acordarte.
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Ejercicios de Laboratorio
Material y Método:
36 Placas Petri con Agar Sangre en Base Columbia, mascarillas, jabón y agua.
Trabajar en tres grupos de cinco personas.
El método de trabajo es por simple exposición de material estéril o mediante contacto
con material estéril.
Grupo 1: Exponer una placa de agar al ambiente, sobre el mesón, durante diez
minutos. Colocar los dedos suavemente sobre el agar durante 30 segundos. Cerrar y
rotular.
Grupo 2: Dos alumnos deben realizar lo siguiente: manipular objetos durante tres
minutos, luego colocar suavemente los dedos sobre el agar.
En seguida, el mismo deberá lavarse las manos con el jabón disponible durante tres
minutos, luego debe dejar secar al aire. Colocar suavemente los dedos sobre el agar.
Cerrar y rotular.
Grupo 3: Un alumno deberá leer un texto en voz alta frente a una placa abierta,
durante dos minutos. Otro repetirá lo mismo utilizando mascarilla.
Cerrar y rotular.
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Material y Método:
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Desinfección y Antisepsia
Queda claro entonces, que la acción de agentes físicos y químicos es útil en la contención
de las enfermedades infecciosas. De esta afirmación se desprenden los conceptos de
DESINFECCION Y ANTISEPSIA.
De acuerdo a los efectos observados, podemos clasificar a estos agentes químicos como de ALTO
NIVEL, NIVEL INTERMEDIO O BAJO NIVEL.
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Los microrganismos presentan distintos grados de resistencia a estos agentes, siendo los
más resistentes Priones y los más susceptibles Virus con manto o envoltura.
El efecto de cualquier
antiséptico o desinfectante puede
verse alterado por la presencia de
suciedad o restos orgánicos. Es
imprescindible retirar todo exceso
de suciedad antes de la aplicación.
La persistencia de tierra,
restos de alimentos, sangre, pus,
secreciones puede implicar el
aumento de la concentración o del
tiempo de exposición al agente
químico.
La elección del desinfectante a usar tiene relación con el objeto que nos interesa
tratar. Existe una categorización de los objetos de uso clínico de acuerdo al riesgo de transmitir
una infección mediante su uso.
El efecto desinfectante
deberá ser mayor cuando se aplique a
objetos críticos, al punto de lograr la
esterilización.
GLUTARALDEHIDO AL 2%
GAS OXIDO DE ETILENO
PEROXIDO DE HIDROGENO
ACIDO PER ACETICO AL 2%
El uso de los materiales tratados con estos agentes químicos no puede ser
inmediato debido a su elevada toxicidad, por lo que el proceso de preparación considera un
tiempo de disipación.
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Los agentes químicos empleados con fines de desinfección y antisepsia, como también los
empleados con fines terapéuticos (antimicrobianos), actúan sobre los micro organismos con la
finalidad de producir una disminución de la carga bacteriana mediante la eliminación de las formas
vegetativas (bactericidas), impidiendo la multiplicación bacteriana (bacteriostáticos) o
definitivamente eliminando toda tipo de forma de vida microbiana (esterilizantes).
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• Temperatura de aplicación
o En general, los efectos sobre una población microbiana aumenta con la
temperatura
• pH de la solución
o El pH adecuado dependerá de la naturaleza aniónica o catiónica del
agente químico. En general, el efecto del pH se relaciona con la capacidad
de ionización tanto del agente químico como de las envolturas celulares
de los micro organismos, por facilitación del transporte de iones en
solución acuosa a través de las estructuras de envoltura.
• Presencia de sustancias interferentes:
o Los desinfectantes pueden perder su eficacia por contacto con materia
orgánica contaminante: sangre, secreciones, deposiciones, restos de
alimentos, óxidos.
o Los antisépticos también pierden eficacia si se aplican sobre la piel sucia.
Los efectos de estos agentes químicos se verifican sobre las estructuras de las proteínas
funcionales y estructurales de los microrganismos, y sobre los ácidos nucleicos. Lo anterior implica
alteraciones en la función metabólica, en la estructura y permeabilidad de la membrana celular, y
en la replicación del material genético.
De acuerdo a su eficacia,
podemos categorizar a estos
agentes químicos en tres niveles de
acción.
Los agentes de nivel intermedio tienen mejor efecto, pero no logran la eliminación de
esporas. Se encuentran en este grupo a los alcoholes, los derivados fenólicos, los halogenantes
como el cloro y yodo, y el peróxido de hidrógeno en baja concentración.
Los agentes químicos de alto nivel son muy tóxicos, por lo que no se usan como
antisépticos sino como desinfectantes o esterilizantes dependiendo de su concentración o
toxicidad. En este grupo podemos citar al glutaraldehido, ácido peracético, óxido de etileno,
plasma de peróxido de hidrógeno.
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La actividad biológica también puede verse alterada por efecto de factores de orden físico.
La simple acción mecánica de arrastre, la abrasión, la desecación y el efecto de la luz solar actúan
en forma natural sobre los microrganismos.
Los factores de orden físico tienen los siguientes efectos sobre los microrganismos:
El frío por lo general tiene efecto bacteriostático, por lo que muchas bacterias pueden
recuperar su actividad si se les regresa a su temperatura vital óptima. En muchas de las especies
bacterianas se observa alguna capacidad de tolerar el congelamiento, resistiendo a la formación
de cristales de hielo en el citoplasma. Esta capacidad de resistencia aumenta cuando estos
organismos se encuentran en un medio rico en proteínas o carbohidratos.
Por el contrario, los efectos del calor pueden ser bactericidas ya que se verifican sobre las
proteínas estructurales o funcionales de los microrganismos. En la medida que aumentamos la
exposición al calor por sobre los rangos de tolerancia vital de una especie bacteriana, comienza a
ocurrir alteración irreversible de la arquitectura proteica, lo que implica un colapso estructural y
funcional. En las bacterias de importancia médica las formas vegetativas, es decir, las que son
aptas para el metabolismo y reproducción resultan destruidas con la exposición a temperaturas
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cercanas al punto de ebullición del agua, condición que solo pueden resistir las esporas
bacterianas.
A través de la evolución las bacterias han desarrollado adaptaciones para la vida a diversas
temperaturas, por lo que podemos clasificarlas como:
• Bacterias mésófilas, si su actividad vital se desarrolla a temperaturas entre 25° y
45°C, lo que incluye a las patógenas para el ser humano.
• Bacterias psicrófilas, si mantienen actividad entre los 0° y 20°C. En este grupo se
encuentran microrganismos capaces de descomponer alimentos durante la
refrigeración. Algunos patógenos mesófilos pueden tolerar este rango de
temperatura (Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes). Un subgrupo
capaz de tolerar temperaturas algo mas altas son denominadas psicrotrofas.
• Bacterias termófilas, si viven entre 50° y 70°C. Un subgrupo denominado
hipertermófilas es capaz de sobrevivir a temperaturas tan altas como 70° a 110°C.
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El tiempo en el que se verifica el efecto letal del calor sobre una población bacteriana
tiene relación inversa con la cantidad de calor aplicada. En otras palabras, para un efecto más
rápido se requiere mayor temperatura.
A este valor de tiempo se le llama TIEMPO DE
REDUCCIÓN DECIMAL (D), y corresponde al tiempo
necesario para dejar solo el 10% de sobrevivientes de
una especie bacteriana al aplicarle un tratamiento
bactericida físico o químico.
En este gráfico, para una especie bacteriana “x”,
se logra dejar el 10% viable en 12 minutos a 60°C. Si se
continúa a la misma temperatura, el 0,1% sobrevive a
los 40 minutos.
Con estos tres conceptos se definen las condiciones ideales para la esterilización mediante
calor, o del tratamiento de alimentos para la máxima reducción de la carga bacteriana sin
alteración de sus propiedades.
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Con una longitud de onda un poco más corta que la luz visible, se sitúa en este espectro a
la luz ultravioleta (UV). Todos hemos sentido los efectos de la luz UV de onda larga UVA cuando
nuestra piel se expone a la luz solar y se broncea; con algo más de energía la luz UVB la exposición
prolongada es capaz de causarnos daño en la piel, y eventualmente alteraciones celulares.
Afortunadamente la atmósfera con su capa de ozono nos protege de los mortales rayos de la luz
UVC que proviene del sol, ya que estos poseen una mayor capacidad de penetración y de daño por
ionización.
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(283 a 200 nm) es coincidente con el máximo de absorción de la molécula de ADN y ARN (260 nm)
y con los máximos de absorción de las proteínas (280 y 230 nm).
Los fotones de alta energía emitidos por una
fuente de luz UVC son capaces de romper enlaces de
las bases nitrogenadas pirimídicas (Citosina C, y Timina
T) del ADN bacteriano, generando FOTOPRODUCTOS
químicos que imposibilitan la correcta replicación o
transcripción de la información genética, por ejemplo,
dímeros anómalos de T-T o C-C.
De esta forma, la energía de los fotones UVC causa efectos mutagénicos secundarios o
efectos letales por inactivación del material genético. A pesar de esto, existen bacterias con la
capacidad de reparar los efectos de la luz UVC mediante mecanismos enzimáticos inducibles.
La luz UVC tiene aplicaciones bactericidas eficaces en la esterilización del aire, agua y
superficies, siempre y cuando la dosis de energía que reciben las bacterias sea la adecuada.
Debemos recordar que la cantidad de energía disminuye con respecto al cuadrado de la distancia
de la fuente de emisión, y que la cantidad de energía emitida depende de la potencia de la fuente.
Una lámpara UVC de Hg de 40 W de potencia es eficaz a un metro de distancia, en tiempos de
exposición de segundos, inactivando cerca del 99% de las formas vegetativas bacterianas.
Dosis de energía de Luz UVC para efecto letal en algunos agentes infecciosos
Podemos instalar una fuente de emisión de luz UVC asociada a sistemas de purificación de
agua, o de purificación de aire filtrado o acondicionado, como medida de barrera para mejorar la
calidad sanitaria del ambiente. Ejemplo de esto es la aplicación de luz UVC para la inactivación de
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La Radiación Gamma:
La radiación gamma realiza su acción mediante el choque de los fotones de alta energía
con los átomos del material que los recibe.
Los efectos serán mayores dependiendo del aumento de la dosis de radiación. La radiación
absorbida se mide en unidades RADS o Gigaray (Gy). La capacidad de las bacterias para soportar la
radiación puede ser muy variable, pero bastante mayor que la del ser humano. La dosis letal de
radiación para un humano adulto es cercana a los 10 Gy, en tanto que para las bacterias varía
entre 200 Gy y 3000 Gy. Existen especies bacterianas capaces de soportar niveles de radiación de
5000 o más Gy (5000 Gy es 5 kGy).
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Esterilización:
Como ya hemos visto, existen varios procesos que pueden afectar la viabilidad de los
microrganismos. Podemos distinguir aquellos destinados a disminuir la carga microbiana como lo
son la desinfección o antisepsia si es por métodos químicos, y la pasteurización si es por métodos
físicos mediante tratamiento térmico. La esterilización en cambio tiene efectos letales sobre toda
forma de vida.
Cualquiera sea el proceso que elijamos para tratar nuestros materiales, debe tener como
requisito la eliminación de las formas más resistentes de vida (ver pgs. 18-23-27), sin alterar la
estructura o las propiedades de los materiales. Por lo tanto, la esterilización es el RESULTADO
FINAL DEL PROCESO, y no la mera exposición a los agentes químicos o físicos. En este proceso se
cuentan además una serie de etapas previas tendientes a asegurar el éxito, tales como
descontaminación, inspección, preparación y empaque de materiales, exposición al proceso,
almacenaje y despacho de estos.
Consisten en la aplicación de agentes químicos como gas Oxido de etileno (ETO), vapores
de formaldehido, o gas-plasma de peróxido de hidrógeno asociados a bajas temperaturas (50°a
60°C) en una cámara de tratamiento de control automático. Los objetos a tratar son plásticos con
capacidad de resistir algo de temperatura, látex, gomas o polímeros, o instrumentos sensibles a
altas temperaturas y humedad. Ejemplos de materiales a tratar son: sondas, endoscopios diversos.
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La esterilización mediante vapor a alta presión es un proceso seguro y rápido, que además
implica menor consumo de energía.
Los materiales que pueden esterilizarse mediante calor seco son polvos (talco), aceites,
petrolato, vaselina, los que no son aptos para tratamiento en autoclave. Este tipo de tratamiento
daña el templado del acero quirúrgico y puede provocar carbonización en textiles.
Desde el punto de vista de la bioseguridad, los procesos de esterilización deben ser sujetos
de certificación. Esta condición implica poder auditar y trazar toda la aplicación del proceso, desde
la recepción de los materiales hasta el usuario final, de modo de poder garantizar la inocuidad de
los materiales sometidos a esterilización.
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Como hemos visto, existe una gran variedad de procesos posibles para lograr la
esterilización, la elección del más adecuado dependerá del tipo de materiales a tratar, de la
toxicidad residual, de la eficacia del proceso y de la economía de su aplicación. A modo de guía
comparativa puedes observar la siguiente tabla (se excluye la radiación ionizante):
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1.- Si para el lavado de manos usas un jabón germicida con amonio cuaternario, ¿Qué nivel
de acción germicida tiene?
2.- Dado el uso médico del objeto y su riesgo de transmitir agentes infecciosos, ¿Cómo
clasificas a un termómetro?, ¿Cómo lo desinfectas?
3.- ¿Qué agente químico utilizarías para desinfectar un endoscopio?, ¿Qué nivel de
desinfección debe obtenerse?
4.- Un trabajador agrícola debe someterse a hidratación parenteral urgente. ¿Cuál sería la
secuencia de acciones más correcta al instalar el tratamiento? Nombra los agentes químicos a
usar.
5.- ¿Qué precauciones deben tomarse antes de usar objetos esterilizados con óxido de
etileno?
8.- Describe por qué razón el tratamiento standard de esterilización por vapor bajo presión
considera una exposición de materiales durante 15 minutos a 121°C y 15 lb de presión.
9.- Explica como la acción de los rayos gamma sobre las moléculas de agua afecta
indirectamente a las bacterias.
10.- Explica cuál sería tu método de elección para la esterilización de ropa quirúrgica de
algodón.
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Ejercicios de Laboratorio
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Ejercicios de Laboratorio
Siembra: Tome otra muestra nasal y siembre una placa de Agar sangre
Columbia de acuerdo a lo descrito en la actividad n°3. Identifique
con el nombre del paciente y luego incube por 24 horas a 35 –
37°C
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Ejercicios de Laboratorio
Toma de muestras: Use guantes. Tome una muestra de deposiciones con tórula estéril
y luego introdúzcala en un medio de transporte Cary – Blair.
Siembra: Siembre con la tórula un punto periférico sobre Agar MacConkey o
Agar XLD. Vuelva la tórula a su envase.
Prepare una lámina para el examen directo, según lo descrito en la
actividad 3. Cuide de no contaminar.
Esterilice un asa de siembra por incineración. Espere a que se
enfríe y luego realice la siembra SUAVEMENTE de acuerdo a la
figura de la actividad 3.
Identifique con el nombre del paciente e incube 24 horas a 35-
37°C. Después observe el desarrollo de colonias y comente.
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Existen muchas fórmulas de medios de cultivo selectivos, la mayoría tiene por objeto
facilitar la recuperación de agentes patógenos por inhibición de la flora acompañante, por lo que
pueden usarse para la siembra primaria, es decir directamente de la muestra.
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Ejercicios de Laboratorio
Actividad n°6: Observación macroscópica de un cultivo y aislamiento de cepas.
Objetivos: Observar la morfología colonial.
Observar los efectos del desarrollo bacteriano sobre el medio de cultivo
(bioquímica, acción de hemolisinas).
Apreciar la diversidad de la microbiota y sus diferencias.
Practicar el aislamiento a partir de un cultivo de fase sólida, mediante asa.
Materiales y método: Use sus cultivos de la actividad n°5.
Placas de Agar sangre (cualquier fórmula base)
Asas de siembra.
Bioseguridad: Trabaja con bacterias no identificadas aisladas de humanos, no está
descartada la presencia de patógenos en los cultivos.
No olfatear los cultivos.
Use guantes, mechero encendido.
No exponga los cultivos innecesariamente.
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