Grupo laboratorio de Microbiología, Programa de Ingeniería Agroindustrial, Escuela

de ingeniería en ciencias agrícolas, Facultad de ciencias agropecuarias y recursos

naturales, Universidad de los Llanos. Vereda Barcelona. Villavicencio, Colombia.

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

Y ANALISIS MICROBIANO DEL AIRE
Laura Katherin BG 117003907; Sebastian Steven BJ 117003905; Gabriela Maite CM 117003913; Yeison BR
117003906.
Facultad de ciencias agropecuarias y recursos naturales.
Ingeniería agroindustrial

RESUMEN
En la práctica se conocieron los principios generales de la preparación, técnicas de esterilización de los
materiales y los medios de cultivo, y se aplicaron las técnicas para realizar un análisis microbiológico de aire
en un área determinada. Los medios de cultivos sintéticos (agar nutritivo y agar PDA) utilizados
permiten que la especie que se quiera cultivar crezca dependiendo de su grupo microbiano, su estado físico, su
complejidad química y su aplicación. Estos medios de cultivo deben tener unas características específicas
básicas para satisfacer el crecimiento del microorganismo a cultivar. Mediante la técnica del análisis
microbiológico de aire se pudo verificar los microorganismos presentes en diferentes ambientes como lo son:
la sala de esterilización y dentro y fuera del laboratorio.

Palabras clave: análisis microbiológico de aire, medios de cultivo, agar nutritivo, agar PDA.

ABSTRACT
In the practice there were known the general beginning of the preparation, technologies of sterilization of the
materials and the means of culture, and the technologies were applied to realize a microbiological analysis of
air in a certain area. The means of synthetic cultures (agar nourishing and agar PDA) used allow that the species
that wants to be cultivated should grow depending on his microbial group, his physical condition, his chemical
complexity and his application. These means of culture must have a few specific basic characteristics to satisfy
the growth of the microorganism to cultivating. By means of the technology of the microbiological analysis of
air it was possible to check the present microorganisms in different environments like it they are: the room of
sterilization and inside and out of the laboratory.

Key words: microbiological analysis of air, means of culture, agar nourishing, agar PDA.

1. INTRODUCCIÓN. TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, Son aquellos que permiten el crecimiento de una gran
factores de crecimiento y otros componentes que variedad de microorganismos.
crean las condiciones necesarias para el desarrollo
de los microorganismos. La diversidad metabólica MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO. Son
de estos es tan grande que la variedad de medios de aquellos que favorecen el crecimiento de u
cultivo es enorme, no existiendo un medio de determinado tipo de microorganismo sin llegar a
cultivo universal adecuado para todos ellos, ni inhibir totalmente el crecimiento de los demás.
siquiera refiriéndonos a las bacterias con
MEDIOS SELECTIVOS. Son aquellos que
exclusividad.
permiten el crecimiento de un tipo de
microorganismos determinado, inhibiendo el
desarrollo de los demás.
MEDIOS DIFERENCIALES. Son aquellos en los
que se pone de manifiesto propiedades que un
determinado tipo de microorganismos posee.
CONSTITUYENES HABITUALES DE LOS
MEDIOS DE CULTIVO
A continuación, se da una idea general sobre algunos
de los constituyentes habituales de los medios de
cultivo.
AGAR. Se utiliza como agente gelificante para dar
solidez a los medios de cultivo. En el agar
bacteriológico el componente dominante es un
polisacárido que se obtiene de ciertas algas marinas y
que presenta la indudable ventaja de que, a excepción
de algunos microorganismos marinos, no es utilizado
como nutriente.
EXTRACTOS. Su preparación consiste en que
ciertos órganos o tejidos animales o vegetales (p.a.
carne, hígado, cerebro, semillas, etc.) son extraídos
con agua y calor y posteriormente concentrados hasta
la forma final de pasta o polvo. Estos preparados
deshidratados son a menudo empleados en la
elaboración de los medios de cultivo. Los más
utilizados son el extracto de carne, de levadura y el de
malta.
PEPTONAS. Son mezclas complejas de compuestos
orgánicos, nitrogenados y sales minerales, que se
obtienen por digestión enzimática o química de
proteínas animales o vegetales (soja caseína carne,
etc.). Las peptonas son muy ricas en pépticos y
aminoácidos, pero pueden ser deficientes en
determinadas vitaminas y sales minerales.
FLUIDOS CORPORALES. Con frecuencia es
necesario añadir a los medios de cultivo de algunas
patógenas sustancias como sangre completa, sangre
desfibrinada, plasma o suero sanguíneo, sobre todo
para conseguir el primer aislamiento a partir del
hospedador. presente en las células sanguíneas
destruye el peróxido de hidrógeno que algunas
bacterias que no poseen este enzima acumulan como
producto del metabolismo del oxígeno.
SISTEMAS AMORTIGUADORES. Para mantener
el pH dentro del rango optimo del crecimiento
bacteriano a veces, es necesario añadir algunos
componentes al medio de cultivo. Debido a que la
mayoría de las bacterias son neutrófilos, se suelen
emplear sales del tipo de los fosfatos visaditos ò
bipotásicos u otras sustancias como las peptonas para
prevenir la desviación del pH.
INDICADORES DE PH. Con el objeto de poder
detectar variaciones en el pH debido a fermentaciones
u otros procesos, se hace necesario a veces añadir
indicadores acido-base que nos lo indiquen.
AGENTES REDUCTORES. Con el objetivo de
crear en los medios de cultivo condiciones que
permitan el desarrollo de los gérmenes microaerofilos
ò anaerobios se añaden estos agentes reductores
siendo, los más empleados la cisteína y el tioglicolato
entre otros.
AGENTES SELECTIVOS. La adición de
determinadas sustancias a un medio de cultivo puede
convertirlo en selectivo. Así, por ejemplo, la adición
de cristal violeta, sales biliares, acida sódica, telurito
potasico, antibióticos, etc., a la concentración
adecuada hará que actúen como agentes selectivos
frene a determinados microorganismos.
ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL AIRE
La determinación de los microorganismos en el aire
interior se vuelve importante cuando se analiza la
incidencia en la salud de las personas que ocupan las
edificaciones, ya que el aire es un medio de dispersión
de muchos microorganismos patógenos, entre ellos
las bacterias. Estas bacterias transportadas en el aire
tienen un efecto en la calidad del aire interno de
viviendas y oficinas, hospitales, industrias de
manufactura y farmacéuticas, laboratorios, salones de
clase, archivos documentales, museos, bibliotecas y
librerías.
Esencialmente, el tipo de microorganismos
encontrados en el aire, tienen relación con el tipo de
muestras que se trabajan, y adicionalmente con las
bacterias que llegan con el viento a las edificaciones
y pueden permanecer en ellas por largos periodos de
tiempo influenciadas por factores ambientales como
hora, temperatura, humedad, polvo y viento. Así
mismo, la presencia de las bacterias depende de los
propios ocupantes, los materiales inadecuados y el
trabajo que se realiza en el interior. Las bacterias
Gram positivas predominan en los ambientes internos
sobre las bacterias Gram negativas, debido a que son
más resistentes y que sobreviven por más tiempo,
aunque 105 algunas investigaciones han reportado
mayor predominancia de bacterias Gram negativas

2. RESULTADOS

Figura No. 3. Medio del Cultivo Expuesto al Área

de Esterilización del Laboratorio.

Figura No. 1. Medio de Cultivo Expuesto al

Exterior

Figura No. 4 Medio de Cultivo Expuesto a una

Mano Contaminada con Dinero.

Figura No.2. Medio de Cultivo Expuesta al

Ambiente del Laboratorio

Figura No. 5 resultados del Cultivo de bacterias

por método de agotamiento
 docentes que pueden esparcir agentes bacterianos
con la entrada y salida del laboratorio, como se
puede observar Figura No.2. Medio de Cultivo
Expuesta al Ambiente del Laboratorio, a pesar de
las altas normas de desinfección y esterilización de
este medio se pudieron presentar agentes
bacterianos en el laboratorio de microbiología,
como se mencionó antes, se pudo haber presentado
gracias a una contaminación por parte de los
integrantes (estudiantes y/o docentes), que tienen
prácticas en este sitio.

Los medios de cultivo son muy útiles porque

permanecen solido incluso a relativamente altas
temperaturas, además, el crecimiento bacteriano en
este agar lo hace en la superficie, por lo que se
distinguen mejor las colonias pequeñas, en un
Figura No. 6 resultados del cultivo de hongos por caldo de nutrientes, la bacteria crece en el líquido,
el método de punción y aparece como una sustancia espesa, con colonias
difícilmente observables. El agar nutritivo contiene
3. ANALISIS DE RESULTADOS normalmente (p/v):0,5% de peptona;0,3% de
extracto de carne/extracto de levadura; 1,5% de
Lo medios de cultivo utilizados intervienen en el
agar;0,5% de cloruro de sodio; agua destilada; pH
éxito o fracaso de un proceso industrial. La
casi neutro (6,8) a 25 °C. Krikorian, A. D. (2010).,
selección del medio de cultivo depende,
este cultivo se dejó por 24 horas en incubación,
principalmente, del tipo de microrganismo
también se sembró 4 cajas con agar PDA, El agar
empleado, y el proceso que se quiere obtener.
de papa y dextrosa son medios comunes de cultivo
Krikorian, A. D. (2010). por lo tanto, en la práctica
microbiológico que se preparan a partir de infusión
número uno y dos, se sembraron medios de cultivos
de patata y dextrosa.
de agar nutriente, ya que es un medio de cultivo
usado normalmente para todo tipo de bacterias,
El agar de patata y dextrosa es el medio más
esto se puede ver en los cultivos expuestos a
utilizado para el crecimiento de hongos y levaduras
ambientes altamente compuestos por bacterias y
que atacan a las plantas vivas o materia vegetal
hongos, como el exterior del laboratorio de
muerta en descomposición. El agar de patata y
microbiología, Figura No. 1. Medio de Cultivo
dextrosa puede ser suplementado con antibióticos
Expuesto al Exterior, donde se puede observar un
o ácidos para inhibir el crecimiento bacteriano.
gran número de colonias (más de 15 UFC)
Este medio es recomendado para realizar el
formadas después de un determinado tiempo de
recuento colonial. También puede ser utilizado
exposición aproximadamente de 15 minutos, con
para promover el crecimiento de hongos y
esto se puede analizar que el contenido microbiano
levaduras como se puede observar en Figura No. 6
del aire es sumamente alto, ya que por este medio
resultados del cultivo de hongos por el método de
las bacterias y hongos se pueden esparcir o
punción, donde se utilizó este método para sembrar
reproducir en una mayor proporción.
una sepa de 5 UFC de estos microorganismos,
donde se analizó el alto y muy fácil crecimiento
En una pequeña proporción se pudieron observar
expansivo de estos organismos heterótrofos
que los medios de cultivos expuestos al medio del
multicelular y unicelulares.
laboratorio de microbiología tuvieron presencia de
microorganismos (bacterias), esto se debe a una
contaminación por causa de los estudiantes o
La base del medio es altamente nutritiva y permite afirmar que en todo lo que nos rodea podemos
la esporulación y la producción de pigmentos en encontrar microorganismos, estos pueden ser
algunos dermatofitos. Algunos procedimientos tan pequeños que simplemente no son visibles al
señalan bajar el pH del medio a 3.5 ± 0.1 con ácido ojo humano, hay que resaltar que éstos hacen
tartárico al 10 %, para inhibir el crecimiento posible que se cumplen diversas funciones
bacteriano. La infusión de patata promueve un esenciales permitiendo que se desarrolle la vida
crecimiento abundante de los hongos y levaduras y en el planeta
el agar es adicionado como agente solidificaste de
ayuda a la proliferación de bacterias es donde se
pudieron ver varios factores en los cuales no se 5. BIBLIOGRAFIA
pudieron extraer una cepa de alto rendimiento, esto  Citado el dia 15 de septiembre de 2018,
se puede observar en la Figura No. 5 resultados del https://www.probiotek.com/productos/reactivo
Cultivo de bacterias por método de agotamiento y s/medios-de-cultivo-reactivos/agar-de-
esto se pudo haber debido a una mala esterilización dextrosa-y-papa/
de los instrumentos utilizados para el agotamiento  Citado el dia 16 de septimebre de 2018,
bacterial, la utilización de mucho inoculo para el https://www.probiotek.com/productos/reactivo
procedimiento y además se recomienda mejorar la s/medios-de-cultivo-reactivos/agar-nutritivo/
siembra de cepas, para un futuro llevar una  Krikorian, A. D. (2010). Medios de cultivo:
extracción de más calidad. Krikorian, A. D. (2010). generalidades, composición y preparación.
Cultivo de tejidos en la agricultura:
4. CONCLUSIONES fundamentos y aplicaciones. Cali.
 Para empezar a trabajar en cualquier laboratorio  Srinivasan, D., Nathan, S., Suresh, T., &
de Microbiología se requiere disponer de una Perumalsamy, P. L. (2001). Antimicrobial
serie de medios de cultivo estériles. Para esto, activity of certain Indian medicinal plants used
resulta necesario conocer los métodos de in folkloric medicine. Journal of
preparación y esterilización utilizados Ethnopharmacology, 74(3), 217-220.
habitualmente en el laboratorio.
 Aunque existan diferentes medios de cultivo,
podemos agruparlos según su estado físico, en
sólidos, líquidos y semisólidos, pero también
según su utilización. En la práctica se emplearon
medios de cultivo sólidos (agar nutritivo y agar
PDA), cabe resaltar que, para hacer siembras en
el laboratorio, es necesario que los cultivos sean
ricos en nutrientes o que al menos satisfagan los
básicos necesarios por el microorganismo que se
va a sembrar.
 Para la siembra del cultivo de hongos se empleó
agar PDA, el cual se caracteriza porque permite
el crecimiento de hongos y esporas debido a que
poseen cloranfenicol, un pH neutro y altas
concentraciones de glucosa.
 Se comprobó la presencia de microorganismos en
diversos ambientes, tales como la sala de
esterilización, el laboratorio por dentro y por
fuera. En todos estos, los resultados fueron
contundentes, ya que se encontraron unidades
formadoras de colonias. De lo anterior, se pudo
6. CUESTIONARIO
 ¿Qué es el agar y cuál es su origen?
El agar, también conocido como agar, es
una sustancia gelatinosa formada
por polisacáridos procedentes de la pared celular
de algas marinas. Se considera una de las
herramientas más necesarias en la rama de
biología.
Desde muchos siglos atrás ha sido utilizada en
la cocina de los países de extremo oriente, aunque
no fue hasta la mitad del siglo XIX cuando su uso
se extendió por Europa, con usos como el espesado
y el aclarado de alimentos tan variados como los
helados y la cerveza, respectivamente.
Sin embargo, lo que no se suele conocer es que tuvo
origen en la cocina de un humilde matrimonio
alemán.
Desde entonces, su uso está más que extendido
en laboratorios; desde los de microbiología, en los
que se utiliza como medio selectivo para el cultivo
de ciertos tipos de microorganismos, hasta los
de biología molecular, en los que se utiliza su
porosidad para la separación por tamaño de algunas
partículas.
En 1881, un joven médico, llamado Walter Hesse,
decidió llevar su trabajo más allá del simple
tratamiento de pacientes de un pueblo rural, en el
que estaba destinado, centrando su atención
también en la bacteriología y cómo la
contaminación ambiental y la falta de
higiene podían dar lugar a la propagación de
enfermedades.
Para ello, recogió varias muestras de aire y agua,
con el fin de cultivar las bacterias presentes en
ellas, pero se topó con un gran problema al
comprobar que la gelatina que había utilizado para
ello se fundía con las temperaturas cálidas del
verano, haciéndose totalmente líquida y
estropeando todo el experimento.
Apesadumbrado por el problema y sin saber cómo
solucionarlo, un día decidió compartir su pesar con
su mujer, Angelina Fanny Eilshemius, que
rápidamente extrapoló la situación a los postres que
ella elaboraba en su cocina, ya que podía cocinar
pasteles y gelatinas sin que el resultado se derritiera
con el calor.
Para ello, la joven utilizaba agar, un material
basado en algas que había sido utilizado por su
familia desde muchos años atrás. Utilizarlo no
parecía nada descabellado, por lo que Walter
decidió tomar una muestra del preciado
ingrediente, para probar a sembrar sobre él las
muestras que había recogido para sus
investigaciones.
Y cuál fue su sorpresa al comprobar que,
efectivamente, el agar era un medio de
siembra magnífico, pues aportaba los
nutrientes necesarios, a la vez que se mantenía
estable, sin deteriorarse a causa de las altas
temperaturas o las enzimas secretadas por las
propias bacterias. Además, como resultado, podía
esterilizarse sin problemas, a la vez que ofrecía
múltiples posibilidades para los cultivos de todo
tipo de bacterias, incluidas las de crecimiento lento.
Hoy en día existen un sinfín de opciones dentro del
agar, pues se les añaden otros recursos, como
ciertos antibióticos o colorantes selectivos, que
permiten discernir si en el medio está creciendo
un tipo concreto de bacterias.
 Cuál es la composición de los medios de
cultivo Agar PDA y Agar nutritivo.
Agar PDA: Tiene la infusión de papa como fuente
de almidones y la dextrosa son la base para el
crecimiento de hongos y levaduras. El bajo pH
(3.5) evita el crecimiento de las bacterias. Cuando
se va a usar para el recuento de hongos y levaduras,
agregar al medio de cultivo una vez esterilizado y
enfriado aproximadamente a 45ºC, 14 ml de una
solución estéril de ácido tartárico al 10% para
obtener un pH aproximado de 3.5. Sembrar el
medio de cultivo por estría en la superficie o
adicionar la muestra para la técnica de vaciado en
placa. Incubar hasta 7 días a temperatura ambiente.
PREPARACION AGAR DE DEXTROSA Y
PAPA: Rehidratar 39 g del medio en un litro de
agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar
agitando frecuentemente hasta el punto de
ebullición durante 1 minuto para disolverlo por
completo. Esterilizar en autoclave a 121ºC (15 lb utiliza para la detección fluorogénica
de presión) durante 15 minutos. Enfriar de Escherichia coli. Cumple con los métodos
aproximadamente a 45ºC. Vaciar de acuerdo a la estándar de la APHA y la Asociación de Químicos
Analíticos Oficiales (AOAC). El agar nutritivo se
técnica a seguir en cajas de Petri estériles. Cuando
especifica en muchos métodos estándar para
se requiera el medio inclinado en tubo, distribuirlo pruebas de alimentos, agua y otros materiales.
antes de esterilizar. Si se acidifica el medio, no
sobrecalentar y fundir solo una vez, para evitar la
hidrólisis del agar.  Realice un cuadro comparativo donde
mencione los equipos y procedimiento de las
Agar nutritivo: El medio contiene extracto de siguientes técnicas para determinar la calidad
carne, peptona y agar, siendo una formulación microbiológica del aire: Sedimentación en placa
suficiente para el desarrollo de los de Petri Placas de contacto RODAC Hisopo.
microorganismos. El extracto de carne proporciona
Sedimentación Placas de contacto Hisopo.
al medio fuente de carbohidratos, de nitrógeno y
en placa de Petri RODAC
vitaminas. El empleo de este medio es de acuerdo Control activo del Se coloca la placa Comprobar el
al tipo de estudio por realizar. PREPARACION: aire: requiere uso sobre la superficie estado higiénico
Rehidratar 23 g del medio en un litro de agua de un muestreado a muestrear de una del lugar de
destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar microbiológico del forma directa, trabajo.
agitando frecuentemente hasta el punto de aire que extraiga manteniéndola Delimitar la
ebullición durante 1 minuto para disolverlo por físicamente un inmóvil y superficie con
cierto volumen presionando una plantilla de
completo.
predeterminado del durante unos aluminio estéril,
aire que lo pase segundos. Incubar humedecer el
 Identifique la función de cada sobre el agar. La en una estufa de hisopo estéril en
componente placa se retira cultivo a la tubo de solución
entonces del temperatura y salina con 4.5 ml
Agar PDA: utilizado para el cultivo de hongos.
muestreado del aire tiempo requerido estéril y
Este producto está conforme a los Requerimientos y se incuba en cada caso. restregar varias
Armonizados de las Farmacopeas USP/EP/JP. Es directamente, Finalmente contar veces en
un medio de propósito general para levaduras y permitiendo la las colonias que superficie.
mohos que puede ser suplementado con ácidos o aparición de han crecido y Regresar el
antibióticos para inhibir el crecimiento bacteriano. colonias visibles y expresar el hisopo a la
Es recomendado para uso con métodos de conteo su recuento resultado en solución salina y
posterior. El UFC/placa o dejar por 15
en placa para alimentos, productos lácteos y
número de colonias UFC/cm2. minutos, luego
pruebas realizadas en cosméticos. El Agar Papa visibles sembrar 0.1ml
Dextrosa (PDA) puede ser usado para el cultivo de proporciona el del líquido
levaduras y mohos clínicamente significativos. La UFC. (TSA). Incubar a
base (infusión de papa) nutricionalmente rica, Control pasivo del 37°C durante
estimula la esporulación de los mohos y la aire: las placas se 24-48 h y
producción de pigmentos en algunos dermatofitos. exponen al aire realizar recuento
durante un tiempo expresado en
Agar nutritivo: se utiliza para el cultivo de una determinado y luego UFC.
variedad de microorganismos en un entorno de se incuban para
laboratorio. El agar nutritivo no está destinado a ser permitir la aparición
utilizado en el diagnóstico de enfermedades u otras y recuentos de
condiciones en humanos. El agar nutritivo sigue colonias visibles. Se
siendo un medio de uso general ampliamente usa para análisis
utilizado para el cultivo de microorganismos no cualitativo de
fastidiosos. Si es necesario, se pueden agregar microorganismos
enriquecimientos a este medio. El agar nutritivo, aéreos.
modificado mediante la incorporación de 4-
metilumbeliferil-β-D-glucurónido (MUG), se
 ¿en qué consisten los métodos activos para
determinar la calidad microbiológica del aire?
Se trata de muestreado res de un solo nivel en los
que la entrada de aire está constituida por múltiples
orificios circulares. La mayoría puede colocarse en
posición horizontal o en vertical y operan a un
caudal elevado que permite el análisis de ambientes
con bajo nivel de contaminación, o de aquellos
donde se requiera el muestreo de grandes
volúmenes de aire durante cortos periodos de
tiempo. Además, suelen ser portátiles.
4) ¿cómo se verifica que un medio de cultivo
esterilizado en autoclave queda limpio de
microorganismos?
especie de microorganismos que se utiliza para
esterilización por vapor es Stearothermóphilus.
La presentación utilizada son ampollas que
contienen el medio de cultivo incorporado, que se
pone en contacto con estos microorganismos en
el momento posterior al ciclo de esterilización. Si
el cultivo del control biológico resultase positivo,
todo el material esterilizado en ese equipo desde
el último control biológico negativo será
considerado como no estéril. Este material deberá
ser recuperado, si es posible y vuelto a esterilizar.
Los controles de calidad se deben pasar al menos
una vez a la semana tanto al ciclo de
esterilización como a los almacenes y las fechas
de caducidad de los productos.

 Controles físicos: Los realiza la autoclave

automáticamente. Controlan el funcionamiento
del esterilizador. Se incluyen dentro de este grupo
los termoelementos, controles de presión,
controles de tiempo y sistemas de registro
gráficos. Son insuficientes por sí solos para
validar el proceso.
 Controles químicos: Son sustancias químicas
coloreadas con propiedades indicadoras que se
sitúan en soportes de papel. No se consideran
verdaderos controles de esterilidad, al informar
sobre los parámetros del ciclo, hacen suponer la
destrucción de toda forma de vida (debe
confirmarse con controles biológicos).
 Controles biológicos: son los verdaderos
controles de esterilidad al informar sobre la
eficacia letal de un determinado ciclo de
esterilización. Su frecuencia se determinará en
función de la utilización de la autoclave. La
Grupo laboratorio de Microbiología, Programa de Ingeniería Agroindustrial, Escuela
de ingeniería en ciencias agrícolas, Facultad de ciencias agropecuarias y recursos
naturales, Universidad de los Llanos. Vereda Barcelona. Villavicencio, Colombia.

 ¿en la industria farmacéutica como es la clasificación de las zonas según el aire?