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Frottis sanguin coloré au MGG

I. Définition : Il s'agit d'une observation au microscope optique du sang, après avoir


effectué une coloration sur une lame permettant de différencier les différents types
cellulaires, selon la méthode May-Grünwald Giemsa

II. Principe : Il repose sur l’action complémentaire de deux colorants neutres et sur
l’affinité des éléments cellulaires pour des colorants acides ou basiques.
Le May-Grünwald fixe le frottis par son méthanol et il colore les éléments acidophiles et les
granulations différenciés, spécifiques des leucocytes.
Le Giemsa sur-colore les noyaux et colore les granulations azurophiles.
III. Technique :
1. Matériel :
• Une lame dégraissée.
• Une lame à bords rodées ou étaleur.
• Pipettes pasteur
• Microscope optique
• Porte lames
• Une paire de gants
• Réactifs May Grunwald et Giemsa
• Un prélèvement de sang recueilli sur anticoagulant ou sang capillaire.

2. Réalisation du frottis :
1. Déposer une goutte de sang sur la lame dégraissée, à environ 1 cm du bord.
2. Placer la lame rodée (ou l’étaleur) contre la lame dégraissée et la goutte de sang.
3. Attendre que la goutte de sang s’étale sur la largeur de la lame rodée (ou de l’étaleur).
4. D’un mouvement régulier, glisser la lame rodée (ou l’étaleur) vers l’extrémité de la lame
dégraisser.
5. Faire sécher le frottis puis procéder à la coloration de ce frottis.
3. Coloration de la lame :
• Placer la lame sur un support horizontal situé au-dessus d’un bac de coloration.
• Mettre le colorant May-Grünwald pur de façon à recouvrir complètement le frottis.
• Laisser agir 3 minutes.
• Couvrir H₂O neutre pendant 1 mn
• Rincer la lame à l’eau de robinet sur un mince filet d’eau.
• Diluer le Giemsa au 20 ème
• Laisser agir 20 minutes.
• Rincer la lame à l’eau.
• Essuyer le fond de la lame avec de la gaze ;
• Laisser sécher la lame à l’air en position inclinée.
• Examiner le frottis à l’objectif 40
• Observer le frottis coloré à l’objectif 100.
A travers le frottis coloré au MGG, de nombreuses anomalies peuvent être décelés, pour les
globules rouges se sont les anomalies de forme de taille et de couleur, pour les plaquettes
c’est la forme et leur répartition sur le frottis , pour les globules blancs c’est la différenciation
entre les différentes catégories de leucocytes et le diagnostic des leucémies.

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Numération des globules rouges

I. Définition : C’est la détermination du nombre de globules rouges contenu dans un


volume de sang donné
II. Principe : la numération des globules rouges consiste à diluer le sang à un taux
convenable (habituellement 1/200 éme ) dans un liquide isotonique et à compter les
cellules dans une chambre quadrillée et de volume connu . le chiffre et ensuite ramené au
litre de sang .
III. Matériel et réactifs :
1. Matériel :
- Pipettes de dilution de Potain ou de Thomas
- Hématimètre de Malassez
- Lamelles
2. Réactifs ( liquides de dilution)
- Liquide de HAYEM
- Liquide de MARCANO
- Liquide de GOWERS
- Solution isotonique de NaCl 0.9%°

IV Mode Opératoire :
1. Prélèvement :
- Il se fait à jeun et au repos, pour éviter les modifications apportées par la présence de lipides en
phase de digestion et par l’exercice musculaire violent (polyglobulie et hyperleucocytose dans les
2 heures.
- sang capillaire ou sang veineux
Aspirer le sang jusqu'à la division 2 de la pipette de Potain et compléter au trait 101 avec le
liquide de dilution
Agiter doucement la pipette pendant 30 secondes à une minute
Laisser reposer pendant 15 mn

2. Remplissage de l’hématimètre :
Fixer la lamelle sur l’hématimètre préalablement nettoyé
Vérifier l’homogénéité de la suspension
Rejeter les 4 ou 5 premières gouttes pour éliminer le liquide de dilution qui remplit le tube
capillaire
Remplir ensuite a chambre de l’hématimètre par capillarité en évitant les bulles d’air
Laisser sédimenter les G R pendant 5 à 10 mn en maintenant l’hématimètre bien horizontalement
et loin des vibrations.

3. Comptage :
Le dénombrement se fait au microscope à l’objectif 40x
Après mise au point parfaite sur le quadrillage, compter les hématies dans au moins 4
rectangles quadrillés en variant les zones d’observation
V . Calcul :

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N est le nombre total de GR trouvés dans 4 rectangles
1/200 éme est la dilution effectuée
Donc le nombre de GR est N/4 x200 x100
Le résultat est exprimé en nombre absolu par mm³ ou en Téra par litre.

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CALCUL DES CONSTANTES ÉRYTHROCYTAIRES

Principe :
Il s’agit de calculer les constantes érythrocytaires après avoir pratiqué une numération des
érythrocytes, un dosage de l'hémoglobine et mesuré l'hématocrite.
But
Les indices érythrocytaires permettent une classification des anémies. Ce sont des
éléments indispensables dans l’orientation diagnostic les pathologies érythrocytaires et des
anémies.
Matériel :
Calculatrice
Données nécessaires
Constantes érythrocytaires en fonction des unités le plus souvent exprimées
Hte = Hématocrite en %
Hb = Hémoglobine en g/100ml
numération des globules rouges ou Hématies en Téra/Litre
Le Volume Globulaire moyen
C’est le volume moyen occupé par une hématie exprimé en femtolitre (fl) ou microns
cube.

Calcul du VGM :

Hte
VGM = ------- X 10
GR

Normale : de 80 à 100 μ3 ou fl
Microcytose < à 80 μ3
Macrocytose > à 100μ3
Teneur corpusculaire moyenne en hémoglobine (TCMH)
(ou teneur globulaire moyenne en hémoglobine (TGMH)).
C’est la quantité moyenne d’hémoglobine par hématie exprimée en picogrammes (pg)
Hb
TCMH OU TGMH = -------------- X 10
GR
Normale chez l’adulte : 28 à 32 picogrammes. Elle varie avec l’âge : elle est plus élevée
chez le nouveau-né, elle diminue par la suite.
Concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine (CCMH)
C’est le pourcentage de saturation des hématies en hémoglobine exprimé en %

Hb
CCMHB = -------------- X 100
Hte
Normochromie : 32 à 36 %.
Hypochromie < 32 %.
Les hématies étant normalement saturées en hémoglobine, la CCMHB ne peut être,
pathologiquement, supérieure à la normale.

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Numération des globules blancs

I. Définition : c’est la détermination du nombre de leucocytes dans un volume de


sang donné.

II. Principe :
Le sang est dilué à l’aide du bleu acétique (lazarus), un diluant leucocytaire qui lyse les
globules rouges et laisse intacts les globules blancs. On compte alors les leucocytes, au
microscope, sur une cellule de comptage et on calcule le nombre de leucocytes par mm3 de
sang.

III. Matériel et réactifs :


- Pipette de Potain pour les globules blancs,
- Hématimètre de Malassez,
- Lamelles,
- Réactif: Lazarus
- acide acétique………………………………………… 5 ml
- eau distillée…………………………………… QSP 100 ml
- bleu de méthylène poudre………………………... 1 cristal

IV. Mode opératoire :


1. prélèvement : Le prélèvement doit se faire à jeun et au repos.
- sur un tube contenant un anticoagulant (EDTA).
- Sang capillaire.

2. Technique :
- Pipeter le sang jusqu'à la graduation 2 de la pipette de Potain,
- Essuyer l’extérieur de la pipette, en faisant bien attention de ne pas absorber le volume
sanguin à l’intérieur de la pipette ;
- Compléter à la graduation 11 avec le liquide de dilution. On obtient ainsi une dilution au
1/20 ;
- Bien agiter par retournement pendant 1 minute ;
- Laisser reposer dans la pipette pendant 15 minutes ;

Montage de l’hématimètre :
- Adhérer soigneusement la lamelle sur l’hématimètre;.
- Homogénéiser le prélèvement ;
- Rejeter les premières gouttes ;
- Amener l'extrémité de la pipette inclinée au niveau de l'espace situé entre la plate-forme et
la lamelle planée : l'hématimètre se remplit immédiatement par capillarité ;
- Il ne doit pas exister de bulle d'air ;
- Laisser sédimenter horizontalement pendant 10 minutes sur un plan bien horizontal, puis
compter les éléments ;
- Avant de compter, il est nécessaire de vérifier l'homogénéité de répartition des éléments ;
- Au moindre doute, le prélèvement sera agité et monté sur une nouvelle cellule
hématimètre.

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Numération :

- On compte le nombre de globules blancs dans 5 bandes .


- Le résultat final est donc :
N est le nombre de leucocytes comptés dans 5 bandes
Le résultat est le suivaant :
N/5 x l’inverse de la dilution x10 leucocytes/mm3

Valeurs de référence :
- Adulte: 4 000 à 10 000/mm3
- Enfants: 4 500 à 13 000/mm3

Variations pathologiques :
- Hyperleucocytose due à l’augmentation d’une variété leucocytaire ou à une augmentation
générale. Dans infections bactériennes, syndromes inflammatoires, certaines parasitoses,
nécroses tissulaires, cancers, syndromes myéloprolifératifs, certaines leucémies, réactions
allergiques médicamenteuses
- Leucopénie due à la baisse d’une variété leucocytaire (à rechercher par l’établissement de
la formule leucocytaire) ou à une baisse globale.
Certaines infections virales ou parasitaires, insuffisance médullaire, certaines anémies,
troubles de répartition, origine toxique ou médicamenteuse, certains cancers.

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Numération des plaquettes

I. Définition :
C’est la détermination du nombre de plaquettes dans un volume donné de sang.

II. Principe :
La technique directe consiste à diluer le sang au 1/100 éme à avec un liquide de dilution qui a
la propriété de lyser les globules blancs et les globules rouges et d’empêcher l’agglutination
des plaquettes sanguines (liquide de Piette) et à faire la numération dans une cellule de
Malassez.

III. Prélèvement :
Le prélèvement doit se faire à jeun et au repos.
- sur un tube contenant un anticoagulant (EDTA).
- Sang capillaire.

III. Réactifs et matériel :


1. Réactif :

Liquide de Piette
Chlorhydrate de procaïne ………………………………..2.43gr
Nacl pur ………………………………………………….0.20gr
H2O distillée…………………………………………..qsp 100ml

2. Matériel :
- Pipette Potin
- Cellule de Malassez
- Lamelles
- Microscope à contraste de phases

IV. Mode opératoire :


- Diluer le sang avec le liquide de dilution au 1/100 éme
- Remuer la pipette de potin entre les doigts
- Placer sur agitateur pour pipettes de potin et laisser remuer pendant 20à 30mn
- Laisser au repos horizontalement pendant 30mn, en remuant de temps en temps pour
compléter l’hémolyse.
1. Montage de la cellule :
- Bien agiter avant de monter la cellule de Malassez
- Jeter les premiéres gouttes
- Faire couler dans la cellule quelques gouttes
- Laisser reposer pendant 15mn
2. Numération au microscope :
- Régler l’éclairage du microscope de façon à obtenir un fond gris,
- De préférence un microscope à contraste de phase
- Lire à l’objectif 40
- Les plaquettes apparaissent comme des corps réfringents

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3. Calcul :

- Soit N le nombre de plaquettes comptés dans une bande.


- Le nombre de plaquettes par mm3 de sang est N X10X100

3.1. Valeurs normales: 140 000 à 400 000/mm3

3.2. Variations pathologiques :

Principales causes d'augmentation du taux des plaquettes :

- Néoplasies.
- Syndromes inflammatoires.
- Syndromes myéloprolifératifs :
- Stimulations de la moelle (après une hémorragie par exemple).
- Splénectomie.

Principales causes de diminution du taux des plaquettes :

1 – Pseudo thrombopénies : fausses hypoplaquettoses liées à la formation d'agrégats


plaquettaires lors du prélèvement.
2 – Thrombopénies secondaires : Atteinte médullaire (toxiques, médicaments, alcool,
cancer), hypersplénisme (cirrhose, leucémie, lymphome, maladies généralisées…),
présence d'anticorps anti plaquettes (processus auto-immuns)(drogues, certains
médicaments dont anti-inflammatoires et antibiotiques…), désordres immunologiques
(infections virales et bactériennes), purpura thrombopénique idiopathique, purpura
thrombotique thrombocytopénique, coagulation intravasculaire disséminée.

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Numération des réticulocytes

I. Définition :
C’est la numération du nombre de réticulocytes par rapport au nombre de globules
rouges matures dans un volume de sang bien précis.

II. Principe :
Le réticulocyte représente la fin de maturation de la lignée érythrocytaire. Elaboré dans la
moelle osseuse, il est libéré dans le sang. Il se différencie d’une hématie adulte par un
diamètre légèrement plus grand et surtout par la présence dans son cytoplasme d’un reste
d’ARN. Pour le distinguer parfaitement d’une hématie mature, on utilise une coloration supra-
vitale : le bleu de crésyl brillant. Ce colorant précipite et colore l’ARN résiduel en un réseau
de petites granulations ou filaments constituant la substance granulo-filamenteuse.

III. Prélèvement :
Le prélèvement doit se faire à jeun et au repos.
- sur un tube contenant un anticoagulant (EDTA).
- Sang capillaire.

Matériel:
- Lames porte objet
- Tubes à hémolyse
Réactif :
- Bleu de Crésyl brillant

IV. Mode opératoire :


Dans un tube à hémolyse, introduire quelques gouttes de solution colorante
-Ajouter le même volume de sang
-Mélanger, boucher et laisser en contact 30 min à température ambiante ou
15 min à 37°C
-Homogénéiser la suspension et réaliser quelques frottis réguliers et minces

Comptage au microscope :
-Les hématies sont colorées en bleu verdâtre et les réticulocytes plus gros comportent une
substance granulo-filamenteuse colorée en bleu foncé, violet.
-Compter à l’objectif à immersion 1000 hématies sur différents champs et
noter le nombre de réticulocytes rencontrés.

Calcul :
Compter tous les globules rouges (hématies matures et réticulocytes) présents dans un champ
- Identifier et dénombrer les réticulocytes présents parmi eux
- Poursuivre le dénombrement jusqu’à avoir identifié un nombre suffisant de réticulocytes
(environ 50)
Soit « N » est le nombre d’hématies + réticulocytes
Et « n » est le nombre de réticulocytes comptés.
Donc le nombre de réticulocytes en % = n x100/N
Pour le calcul en valeur absolue :

Soit « T » est le taux d’hématies du patient

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Et « t » » le taux en pourcentage de réticulocytes

Le taux de réticulocytes en valeur absolue est :


« t » X T/100

Valeurs normales :

Adulte : 0,5-2% soit 20 000 à 120 000/mm

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La résistance globulaire

I. Définition :
C’est un examen biologique qui consiste à déterminer la résistance des globules rouges aux
variations osmotiques.

II. Principe :
La résistance globulaire osmotique consiste à déterminer le seuil de résistance des hématies à
l’hémolyse dans des solutions salines de concentrations décroissantes.

III. Matériel :
- Tubes à hémolyse propres et secs
- Portoirs de 24 tubes à hémolyse
- Pipettes compte gouttes calibrées ou pipettes Pasteur
- Tubes à vis

Réactifs :
- Eau fraichement distillée
- Solution anticoagulante isotonique
- Solution de NaCl à 0.9 %°
- Solution de NaCl à 0.7 %°

IV. Prélèvement :

Prélever 5 ml de sang veineux et les introduire dans un tube contenant 5 ml de solution


anticoagulante isotonique. boucher le tube et mélanger par plusieurs retournements successifs
lents
En cas d’anémie importante, prélever un volume de sang plus grand (10 ou 20ml)

V. Mode opératoire :
1. Lavage des hématies :
- Centrifuger le sang pendant 10 mn à 3000 tours par minute, vérifier l’absence d’hémolyse
dans le surnageant et l’aspirer avec une pipette Pasteur effilée ou une pipette automatique
- Remplir le tube jusqu’au ¾ de solution de NaCl à 0.9% . boucher le tube , remettre les
globules en suspension par retournements successifs et lents ;
- Centrifuger à nouveau pendant 5 minutes à 3000 tours /mn. vérifier encore l’absence
d’hémolyse et absorber le surnageant ;
- Recommencer une fois encore ce lavage globulaire , centrifuger et décanter le surnageant .
2. Réaction :
- Disposer sur un portoir 24 tubes à hémolyse numérotés de 1 à 24 ;
- A l’aide de la pipette compte gouttes ou d’une pipette Pasteur à laquelle on donne la
meme inclinaison , distribuer les réactifs en gouttes comme indiqué dans le tableau ci-
dessous , en mélangeant bien par agitation des tubes après chaque addition . la pipette doit
être soigneusement rincée à l’eau physiologique à 0.9% entre chaque addition de réactifs

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N° des tubes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 23 24

H2O distillée 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 23 24

nNaCl à 0.7 34 33 32 31 30 29 28 27 26 25 12 11
%

Globules 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
rouges lavées
Teneur en 6.8 6. 6.4 6.2 6. 5.8 5.6 5.4 5.2 5. 2.4 2.2
NaCl en g/l 6

- Laisser reposer les tubes pendant 2 heures à la température du laboratoire ;


- Centrifuger les tubes pendant 5 mn à 1000 tours /mn, puis replacer doucement les tubes
sur leur portoir et dans le même ordre

VI. Lecture des résultats :


En allant de gauche vers la droite , noter le premier tube ou le liquide surnageant , au lieu
d’etre incolore , est teinté en jaune rosé très pale : c’est l’hémolyse initiale (HI) noter
également le premier tube ou le culot globulaire disparait a(seul reste les stroma) et ou le
surnageant atteint une coloration qui ne variera plus :c’est l’hémolyse totale (HT).
Les résultats s’expriment en concentration de NaCl des tubes « HI et HT »
Cette concentration s’obtient en multipliant simplement par 0.2 le nombre de gouttes de
solution de NaCl à 0.7 % utilisé dans ces tubes ou les deux hémoyses ( HI et HT) sont
observées.
La concentration de NaCl de chaque tube peut être calculée aussi de la facon suivante

NaCl en g%° = nbre de gttes d’NaCl à 0.7% utilisé X7/nbre total de gttes dans le tube

VII. Interprétation des résultats :

1. Valeurs normales
H. I ……………………4.8 à 4.4
H.T ……………………3.2 à 3.4

2. Variation pathologiques :
la résistance globulaire est augmentée dans :
- Les ictéres d’origine hépatiques
- Certains ictéres par obstruction
La résistance globulaire est diminuée :
- Tous les ictéres hémolytiques acquis ou congénitaux
- Les anémies graves

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Dosage de l’hémoglobine

I. Définition : consiste à mesurer le taux de l’hémoglobine par rapport à un volume


connu de sang total.

II. Principe : On transforme toutes les formes d'hémoglobine en


cyanméthémoglobine sous l'action de Cyanures, l'intensité de la coloration est
directement proportionnelle à la concentration en hémoglobine.

III. Prélèvement :
Réaliser un prélèvement de sang veineux recueilli sur EDTA.
De préférence un prélèvement à jeun, les sérums hyperlipémiques pouvant fausser
le dosage en augmentant la concentration

IV. Matériel :
- Tubes en verre de 10 ml,
- Réactif (solution de DRABKIN)
- Etalon ( 15 g/dl d’hémoglobine)
- Photomètre

V. Technique :
Longueur d’onde : 540nm
Cuvette : 1cm d’épaisseur
Température : 15 – 25°c
Blanc : contre l’eau distillée

Tube Blanc Etalon à 15g/dl Echantillon


Sang ou étalon 20 20
(micro litre )
Eau distillée (ml) 2
Solution de 5 5
DRABKIN(ml)

Mélanger et incuber 3mn à température ambiante (15 – 25°c )

VI. Lecture :

 Lire les absorbances des échantillons et des étalons contre le blanc.

Calcul = (A)échantillon X 15 = g/dl d’hémoglobine (A)standard

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On peut également calculer le taux d’hémoglobine avec un facteur qui est indiqué sur la
fiche technique qui accompagne le réactif.

Le calcul se fait comme suit : (A)échantillon X facteur = taux d’hémoglobine en g/dl

VII. Valeurs de référence :

- Hommes : 14 – 18g/dl
- Femmes : 12 - 16g/dl

Linéarité : la méthode est linéaire pour les taux d’hémoglobine variant entre 0.1g/l et
20g/dl .
Pour les valeurs supérieures à 20 g/dl, diluer l’échantillon avec de l’eau physiologique
au ½ et multiplier par 2 le résultat obtenu.

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L’hématocrite

Principe
L’hématocrite représente le volume occupé par les hématies dans un volume de sang total
connu. La détermination se fait en séparant les hématies du plasma par centrifugation du sang
dans des conditions standardisées de durée et de
vitesse.

Prélèvement sanguin : sang capillaire ou sang veineux prélevé sur EDTA

Matériel
-Tube hématocrite : tube capillaire de 75 mm de long et de 1mm de diamètre ouvert aux deux
extrémités
-Centrifugeuse : présente un plateau spécial et peut tourner à 10 000
tours/min

Technique
-Plonger une extrémité du tube dans le sang veineux homogénéisé (ou dans goutte du sang
capillaire)
-Laisser le sang monter par capillarité, arrêter le remplissage à environ 1cm de l’autre
extrémité
-Essuyer l’extérieur du tube avec de la gaze
-fermer l’extrémité libre avec la pâte à sceller
-Placer le tube sur le plateau de la centrifugeuse à hématocrite, l’extrémité scellée vers la
périphérie
-Centrifuger 3min à 10 000 tours/min

Lecture :
Lire sur un abaque permettant de ramener la hauteur totale du sang à 100%

Normes :
- Homme : 40 à 54 %

- Femme : 37 à 47 %

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L’équilibre leucocytaire

Le principe :

Il repose sur l’action complémentaire de deux colorants neutres et sur l’affinité des éléments
cellulaires pour des colorants acides ou basiques.

Le May-Grünwald fixe le frottis par son méthanol et il colore les éléments acidophiles et les
granulations différenciés, spécifiques des leucocytes. Le Giemsa sur-colore les noyaux et
colore les granulations azurophiles.

Prélèvement:

- Sang prélevé sur EDTA


- Sang périphérique recueilli sur la pulpe du doigt
- Sang recueilli au niveau du talon pour le bébé

Matériel et réactifs :

- Lames porte objet


- Tubes à hémolyse
- Pipettes pasteur
- Pipettes automatique réglable.
- Microscope optique
- Porte lames
- Huile d’immersion
- Eau distillée
- Réactifs May Grunwald et Giemsa
Technique :

1. Confection du frottis :
• Déposer une goutte de sang sur la lame dégraissée, à environ 1 cm du bord.
• Placer la lame rodée contre la lame dégraissée et la goutte de sang.
• Attendre que la goutte de sang s’étale sur la largeur de la lame rodée.
• D’un mouvement régulier, glisser la lame rodée vers l’extrémité de la lame
dégraissée.
• Faire sécher le frottis puis procéder à la coloration de ce frottis.

2. fixation
 Placer la lame sur un support horizontal au dessus d’un bac de coloration.
 A l’aide d’une pipette Pasteur ou d’un compte gouttes recouvrir le frottis avec le
May-Grunwald pur
 Laisser agir pendant 3 minutes.

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 Couvrir H2Odistillée pendant 1 mn
 Rincer sur un mince filet d’eau de robinet

3. Coloration:
Voir technique de coloration MGG

I. Valeurs normales et interprétation :

Globules blancs : 4000 à 10 000/mm3

• Poly neutrophiles : 45 à 70 % 1.5 0 à 7x109 G/l

• Poly éosinophiles : 1 à 3 % 0.05 à 0.5

• Poly basophiles : 0 à 0.5 % 0.01 à 0.05

• Lymphocytes : 20 à 40 % 1.5 à 4

• Monocytes : 3 à 7 % 0.1 à 1

Modification du taux des polynucléaires neutrophiles


P.N. augmentés > 8 x 109/l : polynucléose (infections à germes pyogènes)
P.N. diminués entre 0,5 et 1,5 x 109/l : neutropénie }l'une et l'autre pouvant être
P.N. fortement diminués < 0,5 x 109/l : agranulocytose d'origine périphérique ou
centrale
- Modification du taux des polynucléaires éosinophiles
P.E. augmentés > 0,7 x 109/l : Hyperéosinophilie ou éosinophilie sanguine
(parasitoses,allergies)
- Modification du taux des lymphocytes
Lymphocytes diminués < 1 x 109/l : lymphopénie (impliquant toujours un déficit
en lymphocytes T
Puisqu’ils prédominent largement par rapport aux lymphocytes B dans le sang
périphérique.)
Lymphocytes augmentés > 4 x 109/l : hyperlymphocytose ou lymphocytose
sanguine
- Modification du taux des monocytes
Monocytes augmentés > 1 x 109/l : monocytose sanguine, en général
réactionnelle.
Il est important d'interpréter les taux leucocytaires uniquement en valeur absolue
ce qui évitera les
contresens d'interprétation.
* Par exemple ne pas parler de lymphocytose devant :
PN 30 %, L 65 %, avec G.B = 3 x 109/l
Il s'agit en fait d'une neutropénie (PN = 0,9 x 109/l, L = 1,9 x 109/l)
* Ne pas parler de neutropénie devant :
PN 3 %, L 97 %, avec G.B = 100 x 109/l
C'est une hyperlymphocytose avec polynucléaires neutrophiles normaux (3 x 10
9/l)
* A noter qu’on n’objective pas de baisse des éosinophiles, ni des basophiles, ni
des monocytes, qui sont tous à l’état normal en faible proportion.
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Vitesse de sédimentation globulaire

Principe :
la vitesse de sédimentation globulaire est la vitesse avec laquelle se déposent les hématies
d’un sang rendu incoagulable dans un tube de calibre donné et à une température déterminée.
On apprécie la vitesse de sédimentation des hématies par la hauteur de la colonne de plasma
surnageant après un temps convenu (1 heure, 2heures, 24 heures) « c’est la méthode de
Westergreen ».

Prélèvements :
Le prélèvement se fait chez le malade à jeun sur citrate de sodium à 3.8% à raison de 1
volume de citrate pour 4 volumes de sang en évitant une stase veineuse prolongée (proscrire si
possible l’utilisation du garrot)
La vitesse de sédimentation doit être mise en route aussitôt après le prélévement

Mode opératoire :

1. Matériel :

- Tubes de Wintergreen : Ce sont des tubes en verre ouverts aux deux


extrémités, de 30 cm de longueur sur 2.5 mm de diamètre intérieur et gradués
de 0 à 200 mm.
- Portoirs de tubes : Le portoir de tubes de Westergreen est un support spécial
assurant l’obtention de l’extrémité inferieur des tubes

2. Montage :

- Remettre les cellules en suspension par plusieurs retournements successifs du


tube contenant le prélévement en s’assurant de l’absence de caillot
- Aspirer le sang dans le tube de Westerngreen en ayant soin d’essuyer la partie
inferieure du tube avec un tampon de coton ou de gaze hydrophile .
- Ajuster le niveau de sang exactement à zéro.
- Tout en maintenant le tube bouché, appliquer son extremité inferieure sur le
disque en caoutchouc du support, puis appilquer alors sur l’extrémité
supérieure du tube , la lame de ressort
- Laisser le portoir en position verticale à l’abri des vibrations , puis noter
l’heure.

3. lecture :

Lecture 1 heure et 2 heures après la mise en route et éventuellement après 24


heures.

On lit la hauteur de la colonne de plasma surnageant, les hématies qui ont


sédimentés. Cette hauteur de plasma s’exprime en « mm »

18
Résultats et interprétation :

1. valeurs normales :

Les valeurs normales de la méthode de Westergreen sont résumées dans le


tableau ci-dessous

Temps Homme Femme


1 heure 3 à 7 mm 4 à 8 mm
2 heures 8 à 12 mm 10 à 14 mm
24 heures 50 à 60 mm 50 à 65 mm

2. variations :

- variations physiologiques :

En dehors de tout état pathologique, la vitesse de sédimentation globulaire peut


etre franchemnt accélérée dans les cas suivants :

• chez le nourrisson
• chez le vieillard
• au cours des menstruations
• après un repas copieux
• après un bain chaud
• après injection de certains medicaments en IV
• au cours de la grossesse( à partir du 3éme mois)

- variations pathologiques :

La vitesse de sédimentation globulaire est accélérée dans

• le rhumatisme articulaire aigu (R.A.A)


• les arthrites chroniques inflammatoires
• la tuberculose

N.B : la vitesse de sédimentation globulaire est aussi accélérée dans les


anémies et diminuée dans les polyglobulies.

19
Numération automatique
Généralités
Les compteurs d’hématologie ou automates d’hématologie sont des appareils plus ou moins
complexes utilisés pour la réalisation de
l’hémogramme.
L’hémogramme est l'étude cytologique quantitative et qualitative de sang circulant. Il
comprend :
- la détermination des nombres absolus de globules rouges, de globules blancs et des
plaquettes ;
- Le dosage de l’hémoglobine ;
- la mesure de l’hématocrite ;
- le calcul des constantes érythrocytaires : VGM, TCMH et CCMH ;
- l’établissement pour les globules blancs de la formule leucocytaire donnant les pourcentages
des différents types de leucocytes : polynucléaires neutrophiles, polynucléaires, éosinophiles,
basophiles, lymphocytes.
Il faut noter que la plupart des automates calcule l'hématocrite à partir de la numération des
globules rouges et du volume globulaire moyen.

Principes de comptage et de mesure des compteurs d’hématologie


Il existe essentiellement deux principes de comptage utilisés par les automates d'hématologie
utilisés par les laboratoires.

1‐ La variation d’impédance
Appelé encore, principe Coulter du nom de son inventeur: Elle est la méthode de référence.
L'appareil utilise les variations d’une résistance électrique afin de déterminer la taille des
cellules sanguines.
Les cellules en passant à travers une ouverture déplacent un volume égal de fluide
conducteur. De plus un courant électrique est appliqué au niveau de cette ouverture. Chaque
passage d'une cellule à travers l'ouverture provoque alors une augmentation de la résistance
électrique. Cette augmentation est traduite en impulsions électriques dont la hauteur est
directement proportionnelle au volume cellulaire. La détermination de la taille de la cellule est
donc basée sur le déplacement du liquide et on obtient par conséquent la mesure du volume
cellulaire (c'est‐à‐dire le VGM) directement.
• Le nombre de globules rouges est déterminé par le total d’impulsions enregistrées.
Le taux d’hématocrite est alors déduit selon la formule :
Hématocrite = GRxVGM/10.

20
2 : La mesure optique
Elle associe la cytométrie en flux et la diffraction lumineuse. La source de lumière peut
être un laser ou une lampe au tungstène La cytométrie en flux consiste globalement à faire
défiler une à une des cellules devant un faisceau laser. Plus précisément, on utilise d'abord
un système d'hydrofocalisation qui va permettre de canaliser les cellules et de les faire
passer en file indienne. Lors de leur passage à travers le laser, elles émettent des signaux
lumineux qui sont analysés par l'ordinateur associé au cytomètre. Ces signaux peuvent
être de plusieurs natures comme par exemple une diffraction de la lumière par la cellule
qui est alors liée à sa taille ou un signal de fluorescence émis spontanément par la cellule
ou parce qu'elle a été marquée par un antigène, une coloration.

Les bonnes pratiques d’utilisation des compteurs d’hématologie


•Utiliser toujours un onduleur avec prise de terre pour l’alimenter
•Permettre une bonne circulation d’air autour de l’appareil (50 cm du mur)
•Allumer l’appareil et attendre environ 10 minutes avant son emploi
•Vérifier qu’il n’y a pas de bulles d’air dans les tuyauteries de réactifs
•Vérifier toujours les fuites de réactifs dans le circuit hydraulique
•Vérifier toujours les fuites d’air ou de vide dans le circuit
•Eviter les allumages et extinctions intempestives
21
•Eviter la pollution des réactifs par la poussière
•Ne pas tirer sur le bec d’aspiration après aspiration
•Mélangez soigneusement l’échantillon avant emploi
•Passer de temps à autre le sang de contrôle
•Observer toujours la procédure d’arrêt de l’appareil

IV‐ Procédures d’entretien d’un compteur d’hématologie


Se conformer toujours aux recommandations du fabricant

• 1‐ Entretien journalier
• Nettoyer régulièrement le corps de l’appareil
• Nettoyer l’appareil avant et après l’analyse avec de l’eau distillée
• Nettoyer l’appareil avec la solution de nettoyage préconisée
• Essuyer toute trace de sang

• 2‐ Entretien hebdomadaire
• Effectuer un rinçage avec une solution détergente ou fongicide
• Nettoyage et rinçage des bacs de mesure

• 3 ‐ Entretien semestriel
• Remplacer les cordons des pompes de l’appareil

• 4 ‐ Entretien annuel
• Remplacer les tuyauteries hydrauliques
• Remplacer les cordons des pompes
• Remplacer les joints des seringues

22
Electrophorèse des hémoglobines sur acétate de cellulose
Définition
L'électrophorèse est une technique biochimique de séparation fondée sur le fait que des
molécules portant des charges électriques différentes migrent à des vitesses différentes
lorsqu'elles sont placées dans un champ électrique.

But
Permet de détecter et de différencier les hémoglobines (Hb) anormales.

Principe
Les acides aminés de la globine situés à l'extérieur de la molécule sont hydrophiles et ont
une charge électrique. Cette charge, modifiée selon le pH environnant, est responsable de
différences de migration des molécules d'Hb dans un champ électrique et dans des
conditions bien déterminées (pH du tampon de migration, support utilisé)

Prélèvement
Le sang veineux est prélevé sur anticoagulant, principalement EDTA qui permet
d'effectuer sur le même tube la NFS.

Matériel
Cuves de migration
Générateur de courant
Bandes d’acétate de cellulose
Papier absorbant
Bacs pour coloration
Applicateur
Applicateur
Réactifs

Tampon tris-véronal
Tris (hydroxyméthyl) aminométhane : 7,2 g
Acide diéthylbarbiturique : 1,82 g
Diéthylbarbiturate de sodium : 10,2 g
Eau distillée : 1 L

Solution de coloration : rouge ponceau


Rouge ponceau : 2g
Acide trichloracétique : 30g
Eau distillée : 1 L

Solution de décoloration
Acide acétique à 5 %
Préparation de l’hémolysât
Les globules rouges sont lavés avec une solution de NaCl à 0,9 % (5 volumes NaCl pour 1
volume de sang total bien homogénéisé). Le mélange est homogénéisé par retournements
successifs, centrifugé à environ 3 000 tours/min (10 minutes) à + 4 °C et le surnageant est
éliminé en veillant à aspirer la couche cellulaire supérieure pour éliminer les globules
blancs. La préparation des hémolysats doit se faire juste avant la migration

23
électrophorétique. Une fraction du culot globulaire est ajoutée à la solution hémolysante
contenant un détergent.

Technique
1. Trempage:
Mettre à tremper les bandes d'acétate de cellulose dans le tampon d'électrophorèse
(tampon trisvéronal) pendant 10 à 20 minutes
2. Essorage:
Essorer l'excès de tampon en plaçant les bandes entre deux feuilles de papier absorbant
(essuie-tout
3. Mise en place de la bande sur le support
Placer la bande sur le portoir en veillant à disposer la face absorbante vers le haut. La
bande doit être tendue et ses extrémités doivent dépasser suffisamment pour tremper dans
le tampon une fois le support placé dans la cuve.
Bandes en place dans la cuve
4. Remplir les deux compartiments de la cuve avec un même volume de tampon
d'électrophorèse.
5. Mettre en place le(s) support(s) dans la cuve.
Prélèvements et dépôt
6. Prélever un échantillon et le déposer sur la bande, déjà en place sur son support, au tiers
de l'extrémité, côté cathode (borne noire) en prenant garde que la bande soit bien
horizontale et que l'échantillon ne coule pas.
Cuve et générateur pendant la migration
7. Recommencer pour chaque échantillon en laissant un espace suffisant pour ne pas
risquer la fusion des échantillons qui diffusent légèrement lors du dépôt. Utiliser un
applicateur différent pour chaque échantillon ou sinon, bien nettoyer l'applicateur entre
chaque dépôt.
8. Fermer la cuve et mettre sous tension (environ 1 h de migration à 150 V).
Coloration
9. Après migration, placer les bandes dans la solution de rouge ponceau pendant 10
minutes.
Bains de décoloration
10. Décolorer le fond dans des bains successifs d’acide acétique à 5 %. Agiter le cas
échéant pour accélérer la décoloration.
Résultats
L'hémoglobine S moins chargée que l'hémoglobine A en raison de la substitution d'un
acide glutamique par une valine en position 6 de la chaîne de la bêta globine migre moins
loin et peut ainsi être distinguée sur la bande d'acétate de cellulose.

24
Coloration de Perls
PRINCIPE
En milieu acide, le fer inorganique, forme avec le ferrocyanure de potassium un complexe
fortement coloré en bleu vert (bleu de Prusse).

REACTIFS
- Méthanol absolu (conservé au frigo)
- Solution acide de ferrocyanure de potassium, à préparer extemporanément, en
mélangeant pour 1 ou 2 frottis:
Ferrocyanure de potassium ………………………………………………200 mg
Eau distillée…………………………………………………………………19 ml
Acide chlorhydrique (2 N)……………………………………………………1 ml
- Solution d’hématoxylline

TECHNIQUE sur moelle


Fixer les frottis pendant 10 minutes dans le méthanol et les sécher à l'air
Immerger pendant 30 minutes, à température ambiante, dans la solution acide de
ferrocyanure.
Rincer à l'eau distillée.
Contre-colorer pendant 5 minutes, avec la solution d'hématoxyline, filtrée sur les frottis.
Rincer à l'eau distillée.
Sécher à l'air.

REMARQUES:
L'hémosidérine est ainsi mise en évidence dans les érythrocytes et les erythroblastes. Un
erythrocyte contenant du fer sous cette forme est appelé sidérocyte, un erythroblaste
contenant des granules d'hémosidérine mis en évidence par cette technique est appelé
sidéroblaste.
Selon MOLLIN et DACIE, les sidéroblastes sont classés en trois types :
Sidéroblaste de type 1 : 1 à 5 grains épars.
Sidéroblaste de type 2 : plusieurs grains éparpillés dans le cytoplasme.
Sidéroblaste de type 3 : disposition en couronne autour du noyau, appelés
Ringsidéroblastes.

RESULTATS :
Faire le décompte , sur 100 erythroblastes acidophiles des cellules selon :
Type I = < 5 grains
Type II = 5 à 15 grains
Type III = >15 grains et/ou Ring.
Noter éventuellement la présence de sidérocytes (hématies renfermant des grains de fer) et
celle de fer hémosidérinique dans les cellules réticulaires.

INTERPRETATION :
Le diagnostic d'Anémie Sidéroblastique nécessite la présence d'au moins 10 à 15 % de
Ring.
En réalité la preuve formelle serait de pouvoir démontrer qu'il existe une surcharge en fer
dans les mitochondries. Ceci nécessiterait d'avoir recours à la microscopie électronique, ce
qui n'est pas envisageable.

25
Temps de saignement
I. Principe :
Le temps de saignement consiste à provoquer une petite hémorragie locale et à noter le temps
nécessaire à son arrêt spontané.
II. Matériel :
- Tensiomètre
- Chronomètre
- Vaccinostyle ou hémotype stérile
- Papier buvard
- Coton hydrophile
- Alcool à 95°

III. Mode opératoire :


A. Méthode de Duke :
1. Technique :
- Désinfecter le lobe de l’oreille à l’aide d’un tampon de coton imbibé d’alcool à 95° et
laisser sécher ;
- Sans comprimer les tissus, pratiquer une incision franche de 5 mm de longueur sur 2 mm de
profondeur ;
- Attendre l’apparition de la 1ére goutte de sang puis déclencher le chronométre ;
- Recueillir toutes les 30’’ les gouttes de sang sur le papier buvard sans toucher la plaie pour
ne pas désorganiser le caillot qui se forme ;
- Noter le temps d’arrêt de l’écoulement de sang.
2. Résultats : L’intervalle de temps écoulé entre l’apparition de la 1ére goutte et le
prélèvement de la dernière goutte, constitue le temps de saignement.
3. Valeurs normales : un temps de saignement normal est entre 3 et 4 minutes.
B. Méthode d’Ivy :
1. Technique :
- placer un tensiomètre sur le bras du patient et exercer une pression de 40 mm de Hg
- désinfecter l’avant bras à l’aide d’un tampon de coton alcoolisé et laisser sécher,
- Pratiquer une incision de 5 mm de longueur sur 2 mm de de profondeur à l’aide d’un
vaccinostyle stérile,
- attendre l’apparition de la 1ére goutte de sang et déclencher le chronométre ,
Recueillir les gouttes de sang sur le papier buvard toutes les 30 secondes comme dans la
méthode de Duke.
2. Résultats :
L’intervalle de temps écoulé entre l’apparition de la 1ére goutte et le recueil de la dernière
goutte de sang constitue le temps de saignement.
3. Valeurs normales :
Pour cette méthode, un temps de saignement normal est de 4 à 8mn
IV. Interprétation des résultats :
A. Le temps de saignement est allongé dans :
- Les thrombopénies et thrombopathies ;
- Déficit en facteur Willebrand ;
- Afibrinogénémie
- Déficit en facteurs X, XI et IX

26
Temps de coagulation sanguine

I. Principe :
Le temps de coagulation sanguine est un test global qui consiste à prélever du sang total et à
mesurer le temps nécessaire à sa coagulation.
II. Matériel :
- Bain Marie réglable à 37°c
- Chronomètre
- Tubes à hémolyse propres de 1 cm de diamètre
- nécessaire pour prélèvement veineux

Méthode de HAYEM
Cette technique donne des résultats reproductibles et permet d’étudier la rétraction du caillot
1. Mode opératoire :
- Dans 2 tubes à hémolyse propre de 1 cm de diamètre, introduire 2,5 ml de sang
prélevé par ponction veineuse franche et déclencher immédiatement le chronomètre.
toute ponction infructueuse doit être faite sur un autre site veineux.
- Boucher les tubes et les placer au bain Marie à 37°C
- A partir de la 5 éme minute, commencer à incliner d’un angle de 45 ° le tube N° 1
toutes les 30 secondes et noter le moment ou apparait la coagulation du sang (C1)
- Incliner ensuite le tube N° 2 toutes les 30’’ et toujours à 45° et noter également le
moment ou apparait la coagulation (CT

2. Résultats :
- Le temps de coagulation sanguine est donné par la formule
TC tube 1+T C tube 2
Temps de coagulation en minutes = 2
3. Résultats et interprétation :
- Valeurs normales : les valeurs normales de cette méthode oscillent entre 8 et 10
minutes

- variations pathologiques :
Le temps de coagulation est augmenté dans :
- Les hémophilies sévères
- Les hémorragies liées à un déficit en plaquettes
- L’afibrinogénémie
- Présence d’anticoagulants circulants
- Le traitement à l’héparine

Le temps de coagulation est diminué dans :


- Les affections aigues RAA
- Les intoxications
- Les phlébites

4. Etude de la rétraction du caillot :


Il consiste à observer les échantillons de sang qui ont servi à la détermination du temps de
coagulation sanguine

27
Après coagulation complète du sang, les tubes sont gardés au bain Marie à 37°C et examinés
toutes les 15 minutes pendant 3 heures sans les agiter
- Valeurs normales :
Normalement entre 1 h et 3 h, le caillot se détache de la paroi du tube et une quantité
et une quantité de sérum s’exsude.
- Variations pathologiques :

L’hyper rétractibilité se rencontre dans :


- Les anémies
- Les états préthrombosiques

L’irrétractibilité totale après 24 h se rencontre :


- Les thrombopénies
- Les thrombopathies

La rétraction partielle se rencontre dans les mêmes pathologies que précédemment, mais
moins sévères.

28
Temps de coagulation plasmatique
Temps de Howell

Principe :
Le temps de Howell consiste à déterminer le temps de recalcification d’un plasma citraté
riche en plaquettes en présence de CaCl2. Sa mesure constitue un test d’exploration globale
de la coagulation sans spécificité.
Prélèvement :
Le prélèvement est réalisé par ponction veineuse franche. Il se fait sur citrate à 3,8 % en
respectant le rapport anti coagulant sang (9 volumes de sang pour 1 volume d’anti coagulant)
Pour obtenir un plasma riche en plaquettes, on doit laisser sédimenter l’échantillon ou
centrifuger à faible vitesse (1000 à 1500 tours pendant 5 mn).
Le test doit être réalisé dans le 4 heures qui suivent le prélèvement.
Matériel et réactif :
Matériel
- Bain marie thermostaté à 37° ;
- Tubes à hémolyse très propres ;
- Chronomètre ;
- Pipettes automatiques de 200µ.

Réactifs :
- Solution de Ca Cl2 à 0.025M

Mode opératoire :
Incuber la solution de CaCl2 au bain Marie à 37°C 5 mn avant les tests
Dans des tubes à hémolyse mettre au bain Marie à 37°
Plasma du malade ou temoin 200µl
Incuber pendant 2 mn
CaCl 2 à 0,025 M 200µl
Déclencher le chronométre après addition de la solution de CaCl 2, et incliner le tube toutes
les 15 secondes et noter le temps de coagulation.
Le calcul du temps de Howell se fait sur la moyenne de trois essais.
Résultats et interprétations :
Valeurs normales 1 mn 30’’ à 2 mn 30’’
Variations pathologiques :
En absence de la numération des plaquettes le TH est difficile à interpréter
On dit qu’un TH est allongé lorsque il y’a un écart d’au moins 1 mn par rapport au témoin
Allongé : hémophilie, Thrombopénies thérapie aux anticoagulants.

29
Détermination du temps de Quick (TQ)

Intérêt clinique :
Le temps de Quick permet l’exploration de la voie extrinsèque de la coagulation. Le TQ,
converti permet d’évaluer l’activité des facteurs du complexe prothrombinique en référence à
un plasma normal à 100%.
Principe :
Cette technique est basée sur les travaux de QUICK et AL.
Elle consiste à mesurer le temps de coagulation d’un plasma à 37° en présence de la
thromboplastine tissulaire et de calcium. Le résultat ainsi obtenu est converti en taux de
prothrombine(TP) et en INR.
Prélèvement et préparation du test :
- Prélever par ponction veineuse franche du sang recueilli sur citrate trisodique à 0.109 M
(0,5 ml d’anticoagulant + 4,5ml de sang). Eviter le prélèvement à la seringue qui
favorise la formation de microcaillots.
- Centrifuger à 2500t/mn pendant 3 à 5 mn
- Réaliser le test dans les 4 heures qui suivent le prélèvement en gardant le plasma à
température ambiante.
- La conservation prolongée entre 2 et 8° peut conduire à des temps de quick raccourcis
(activation du facteur VII par le froid)

Matériel et réactifs :
1. matériel :
- Bain marie thermostaté à 37°
- Tubes à hémolyse très propres
- Chronomètre
- Pipettes automatiques de 100µl et 200µl

2. réactifs
- R1 : thromboplastine lyophilisée (tissu cérébral de lapin)
- R2 : tampon de reconstitution
- Tampon d’Owren : à utiliser pour l’établissement de la droite de Thivolle

Préparation des réactifs :


- Reconstituer la thromboplastine lyophilisée R1 + tampon R2, en tenant compte du
volume indiqué sur le flacon R1, mélanger doucement et vérifier la dissolution complète
avant utilisation ( environ 30 mn). la thromboplastine reconstituée est stable : 8 heures à
température ambiante et 5 jours entre 2 et 8°

Mode opératoire :
- Mettre dans un tube à hémolyse une quantité de thromboplastine nécessaire aux tests,
placer au moins 15 à 20mn au bain Marie à 37°C avant la réalisation des tests
Technique :
Homogénéiser les réactifs avant pipetage :
Mettre dans un bain Marie :

30
Plasma 0.1ml
Incuber 2 mn à 37°
Thromboplastine incubée 0.2ml
Déclencher le chronomètre simultanément et noter le temps de
coagulation

Résultats : le temps de Quick s’exprime :


- Soit en secondes par rapport à un témoin normal TQ
- Soit en pourcentage d’activité : Taux de prothrombine TP
- Soit en INR « international Normalized Ratio » pour permettre une meilleur définition
des zones thérapeutiques.

𝑡𝑒𝑚𝑝𝑠 𝑑𝑢 𝑝𝑎𝑡𝑖𝑒𝑛𝑡
- INR = ( (𝑡𝑒𝑚𝑝𝑠 𝑑𝑢 𝑡é𝑚𝑜𝑖𝑛)isi

ISI: indice de sensibilité international de la thromboplastine


La conversion du TQ en TP ou en INR se fait à l’aide d’un tableau de conversion qui
accompagne le réactif en référence au témoin.
On peut également construire une droite à partir d’un pool de plasmas frais normaux à diluer
à 25% dans le tampon d’Owren
100% 25%
Plasma 1ml 0.25ml
Tampon d’Owren - 0.75ml
Et réaliser les tests dans les mêmes conditions. Puis tracer la droite de Thivolle.
Valeurs normales :
- Les temps de Quick varient entre 11 et 15’’

Prolongé de 2 à 3 chez le nouveau né


Prolongé de 3 à 5 chez le prématuré
- Taux de prothrombines normaux
- Entre 70 et 100 %
- Des taux superieurs à 100% n’ont pas de signification particuliere

Traitements anticoagulants oraux (AVK)


Indications zone thérapeutique en INR TP en %
Cible limites acceptables
Prophylaxie des thromboses veineuses 2.5 2.0 – 3.0 35%
Phlébite évolutive, embolie pulmonaire 2.0 1.5 – 2.5 40%
Prophylaxie artérielle et valves cardiaques 3.5 3.0 – 4.5 25%
Variati°ons pathologiques :
- déficit congénital en facteurs du complexe prothrombinique
- Déficit important en fibrinogène
- Déficit en facteurs II, V, VII et X par défaut de synthèse hépatique

31
Le temps de céphaline activée

Intérêt clinique :
Le TCA est un test de coagulation qui explore l’ensemble des facteurs de coagulation de la
voie intrinsèque (facteurs XII, XI, IX, VIII, X, V, II et I) à l’exception des plaquettes.
Il est aussi utilisé pour déceler les anomalies congénitales ou acquise en facteurs cités ci-
dessus et la surveillance des malades traités à l’héparine.

Principe :
C’est le temps de coagulation d’un plasma recalcifié à 37° en présence d’une quantité
standardisée de céphaline (substitut des plaquettes) et d’un activateur du facteur XII (le
Kaolin).
Prélèvement :
Prélever le sang sur citrate de sodium à 3,8 % : 9 volumes de sang pour 1 volume
d’anticoagulant, centrifuger à 4000 tours/minute pendant 20 mn au moins.
Le test devra être effectué dans un délai n’excédant pas 4 heures après le prélèvement. On
prélèvera, également dans le même temps, deux tubes de sang témoins qui seront traités
comme celui du malade

Matériel et réactifs :
Matériel:
- Bain marie thermostaté à 37° ;
- Tubes à hémolyse très propres ;
- Chronomètre ;
- Pipettes automatiques de 100µl.

Réactifs :
1. Céphaline Kaolin:
Reprendre le flacon lyophilisé avec la quantité d’eau distillée indiquée sur l’étiquette ;
- Agiter vigoureusement jusqu’a dissolution totale ;
- Laisser 15 minutes à la température ambiante (20-25°C) ;
- Agiter fréquemment avant toute utilisation.
Conservation: reconstituée la céphaline Kaolin peut être conservée
- 2 semaines entre 2° et 8°
- 8 heures entre 20° et 25°
- 2 mois à – 20°

2. Chlorure de Calcium 0,025 M

32
Mode opératoire :
Toute détermination doit être faite en double

Incuber au bain Marie la solution de CaCl2 à 37°


Dans un tube placé au bain marie à 37°C mettre successivement.
Plasma du malade ou plasma témoin 0,1 ml
Céphaline-Kaolin 0,1 ml
Après incubation de 3 mn, ajouter en déclenchant simultanément le chronomètre.
Ca Cl2 0.025 M pré-incubé à 37°C 0,1 ml
Noter le temps de coagulation.
Résultats et interprétation :
Noter les temps de coagulation du témoin et des plasmas testés.
Le temps normal est compris entre 30 et 40 secondes. Une augmentation supérieure à 8
secondes par rapport aux témoins doit inciter à procéder à une exploration approfondie.

La zone thérapeutique du temps de Céphaline-Kaolin sous héparine se situe généralement


entre 1,5 et 2 fois le temps du témoin.

Variations pathologiques :
Un TCA supérieur à 1,2 fois le temps du témoin doit être considéré comme pathogène.
Lorsqu’un TCA allongé est associé à un temps de quick normal, on est en présence d’un
déficit en facteurs de la voie endogène. On recherche dans ce cas un déficit en facteurs
antihémophilique A ou B en réalisant le dosage spécifique de ces deux facteurs.

A titre indicatif, les résultats du TCA dans l’hémophilie sont :

Type d’hémophilie TCA en secondes TCA malade/ témoin


Hémophilie A Majeure >100 >3.0
// Mineure > 50 >1.5
Hémophilie B Majeure >90 >2.7
// Mineure >45 >1.4

33
Dosage du fibrinogène

Principe :
En présence d’un excès de thrombine, le temps de coagulation d’un plasma
préalablement dilué est inversement proportionnel à la concentration en fibrinogène dans le
plasma.
Prélèvement :
- Prélever par ponction veineuse franche du sang recueilli sur citrate trisodique à 0.109 M
(0,5 ml d’anticoagulant + 4,5ml de sang). Eviter le prélèvement à la seringue qui
favorise la formation de micro caillots.
- Centrifuger à 4000t/mn pendant 10 mn
- Réaliser le test dans les 4 heures qui suivent le prélèvement.

Réactifs et matériel:
1. Matériel :
- Bain marie thermostaté à 37°
- Tubes à hémolyse très propres
- Chronomètre
- Pipettes automatiques de 200µl et 20µl
- Crochet

2. Réactifs :
- Réactif 1 : Thrombine calcique d’origine animale.
Ce réactif contient le kaolin qui permet d’améliorer la détection optique.
A reconstituer avec le volume d’eau distillée indiquée sur l’étiquette
Conservation : 24 h à température ambiante
7 jours entre 2°C et 8°C et 30jours à – 20°C

- Réactif 2 : Tampon de dilution pour plasma (Prêt à l’emploi)

Mode opératoire :
Diluer le plasma au 1/10 dans le tampon de dilution (Réactif 2), pour les plasmas
normaux cette dilution correspond à un taux de fibrinogène dans le plasma entre 2 et 4
g/l.

Technique au crochet :
Placer la thrombine au bain marie à 37°C avant la réalisation des tests.
Distribuer dans les tubes à hémolyse, agiter avant l’utilisation :
Plasma dilué au 1/10 20 µl
Incuber 2 mn à 37°C
Thrombine 200 µl
Déclencher le chronomètre simultanément, ploger le crochet à intervalles réguliers et
noter le temps de coagulation.

Calcul :
La concentration en fibrinogène dans le plasma :
Se référer au tableau joint au coffret
Ou

34
A une droite de calibration réalisée au laboratoire avec des dilutions sur un plasma
normal d’une concentration connue en fibrinogène.
Fxd
Fibrinogène en g/l = a
F = concentration en fibrinogène du plasma de rérérence
d = inverse de dilution du plasma testé
a = valeurs trouvée en abscisses
Limites de linéarités : plasma dilué au 1/10 : la réaction est linéaire entre 2 et 4g/l
C’est adire les temps compris entre 8’’ et 25’’ en dehors de cette fourchette adapter les
dilutions comme suit :
Si le temps de coagulation obtenu est inférieur à 8 secondes, refaire le test avec une
dilution au 1/20. Le résultat sera multiplié par 2.
Si le temps de coagulation est supérieur à 25 secondes, refaire le test sur une dilution au
1/5. Le résultat obtenu sera divisé par 2.

Valeurs normales:
Adulte : 2 à 4 g/l
Nouveau né : 1.25 à 3g/l

Variations pathologiques :
La concentration en fibrinogène dans le plasma est :
- Augmentée dans les cas inflammation, de nécroses tissulaires,
- Diminuée dans les anomalies du métabolisme hépatique (cirrhose, ictère) ou des cas
de fibrinolyse et de CIVD.

35
Recherche et dosage semi-quantitatif du D-Dimère par agglutination aux particules de
latex

Intérêt clinique :

Les D-Dimères sont le produit issu de la dégradation de la fibrine. L'élévation de son taux
témoigne d'une fibrinolyse excessive, secondaire à une coagulation.

C’est un test de dépistage de la maladie thrombo-embolique veineuse.

Principe :
En présence de l’antigène correspondant, les particules de latex sensibilisées par l’anticorps
monoclonal forment des agglutinats macroscopiques lorsque la concentration en D-Dimère est
au moins égale à 0.5 µg (équivalent en fibrinogène initial)
Réactifs :
- Réactif 1 : flacon de 1.3 ml de suspension de particules d latex sensibilisées par un
anticorps monoclonal de souris anti-d-dimère humain
- Réactif 2 : flacon de 20 ml de tampon glycine
- Réactif 3 : plasma humain dépourvu de D-Dimère
- Réactif 4 : plasma humain contenant du D-dimère
- Plaques à usage unique
- Agitateurs à usage unique

Prélèvement et traitement de l’échantillon :


Prélèvement est réalisé sur citrate à 0.109 M : 1 volume de citrate pour 9 volumes de sang.
Conservation des réactifs :
Conservés à 2-8°C sous leur état d’origine, les réactifs sont stables jusqu'à la date de
péremption indiquée sur le coffret.
- Réactif 1 :
Avant emploi, laisser le réactif 1 à température ambiante (18- 25°C) pendant 30 mn.
Agiter le flacon avant chaque utilisation, afin d’homogénéiser le milieu.
- Réactif 2 : *
Avant utilisation, laisser le réactif 2 à température ambiante (18-25°C) pendant 30 mn.
- Réactifs 3 et 4 :
Reconstituer chaque réactif avec de l’eau distillée. Laisser les réactifs se stabiliser
30mn à température ambiante (18- 25°C°) puis agiter doucement .
Stabilité, après reconstitution :
 2 mois à 2- 8°C
 4 mois à – 20°C

Mode opératoire :
1. Test de dépistage :
Le test de dépistage est effectué sur plasma pur.
S’assurer que tous les réactifs sont à température de laboratoire.
Dans un anneau d’une plaque déposer 20µl des réactifs 3 et 4. Ajouter 20µl de
Réactif 1
(Homogénéisé au préalable) dans chacun des anneaux.
Mélanger à l’aide d’agitateurs différent le contenu de chaque anneau. Agiter
délicatement la plaque par rotation pendant 2 à 3 mn.
36
Observer l’apparition éventuelle d’agglutinats macroscopiques dans le test du malade,
comparer aux contrôles négatif et positif.
Résultats : le seuil de détection de la méthode étant de 0.5 µg/ml en équivalent
fibrinogène initial. Deux cas résumés dans le tableau ci-dessous peuvent se présenter :

Plasma pur Présence d’une Taux de D- dimére (µg/ml)


agglutination
Cas 1 non < 0.5
Cas 2 oui ≥ 0.5

Vérifier que les résultats trouvés pour les réactifs 3 et 4 sont respectivement négatif et
positif. Sinon s’assurer du bon fonctionnement de la méthode.
Et si besoin, recommencer le test.

2. Dosage semi quantitatif :


Mode opératoire :
Pour chaque plasma testé pur donnant une agglutination, réaliser des dilutions en
cascade de rythme 2 (1/2, 1/4, 1/8….) en réactif 2.
Tester chaque dilution comme indiqué pour le test de dépistage.
S’arrêter à la dilution donnant l’aspect du témoin négatif.

Résultats :
Le taux de D-dimère contenu dans le plasma est égal à la valeur du seuil multiplié par
l’inverse du facteur de la dilution(d) de la plus haute dilution donnant une
agglutination :
Taux de D-dimère en (µg/ml) = 0.5 x d

Remarque :
Les taux de D- dimère sont exprimés en équivalent fibrinogène initial. La quantité de
D- dimère obtenue à partir d’un caillot lysé représente environ 50% du taux de
fibrinogène initialement présent.
Ainsi le seuil de détection de 0.5 µg/ml correspond environ à 0.25 de D- dimère.

Limites de la méthode :
La présence d’un taux élevé de facteur rhumatoïde peut provoquer une agglutination.
En cas d’augmentation inexpliqué du D-dimère, rechercher le facteur rhumatoide
Prélèvement difficile : toute amorce de coagulation du prélèvement peut donner de
fausses agglutinations.

Valeurs usuelles :
Le taux de D- dimère dans le plasma est normalement inferieur à 0.5µg/l . le résultat
doit être interprété en fonction de l’état biologique et clinique du patient.
Une augmentation du D- dimère est observée avec l’âge et lors de la grossesse.

Variations pathologiques :
Les taux de D-dimère augmentent dans les états d’activation de la coagulation
puisque ceux-ci induisent la formation de thrombine, puis de fibrine et donc une
fibrinolyse, le plus souvent réactionnelle.
Ainsi on peut constater une augmentation du taux de D-dimère dans les cas suivants.

37
- Thromboses veineuses profondes
- Embolies
- CIVD
- Hémorragies
- Chirurgie
- Cancers
- cirrhoses

38
Test de solubilité au sang total
Test d’ITANO
Principe
L’hémoglobine S réduite par action de l’hydrosulfite de sodium précipite dans une
solution tampon à 2.24M.

Matériel
Tubes à hémolyse
Pipettes automatiques
Portoirs pour tubes à hémolyse
Centrifugeuse

Réactifs
Hydrosulfite de sodium ( NaS₂O₄);
Solution Tampon 2,8M en phosphate pH 6,8
- K₂HPO₄ (1,62M) anhydre ……28,2g
- KH₂PO₄ (1,18M) anhydre …….16g
Conservation à température ambiante
Solution A
- Hydrosulfite de sodium………25g
- Solution tampon 2.8M …….2ml
Bien agiter
Eau physiologique pour lavage d’hématies

Prélèvement
Prélèvement de sang veineux recueilli sur EDTA.
Technique
Le test est réalisé à température ambiante
Préparer l’hémolysât pour l’échantillon à tester, à partir du culot globulaire lavé en eau
physiologique.
Culot globulaire……….. 100µl
H₂O distillée ………………600µl
Bien agiter les tubes et les laisser à + 4°C pendant 15 mn
Centrifuger 10mn

Technique
Tube témoin
Solution tampon 2,8M ………800µl
Hémolysât …………………………200µl
Tube test
Solution A ……………800µl
Hémolysat ……………200µl
Procéder en déposant les hémolysants à la surface du tampon puis en agitant
simultanément tous les tubes.
Si l’on est en présence de d’hémoglobine S, il se produit immédiatement un trouble net
dans le tube contenant la solution A, le tube témoin reste limpide.

39
Mise en évidence de l’hémoglobine S par le test de falciformation des hématies
Test d’Emmel

I. PRINCIPE :
Lorsque la pression partielle de l’oxygène baisse au dessous d’un certain niveau ou en
présence d’un réducteur, les hématies contenant l’hémoglobine S prennent des aspects en
faucille.
II. Matériel
Lames de verre porte objet
Lamelles
Aiguille stérile
Fer à luter
Pipettes pasteur effilées
III. REACTIFS :
1. Solution de métabisulfiteà 2% (solution réductrice)
Préparer extemporanément en dissolvant dans une petite fiole :
Métabisulfite de sodium ou de potassium (S2O3Na2)…………..0.10grammes
Eau distillée …………….. 5 ml
2. vaseline, huile de paraffine, paraffine solide ou vernis à ongles (au choix)
IV. prélèvement :
Sang prélevé sur EDTA ou du sang capillaire au niveau de la pulpe du doigt.
V. mode opératoire :
Enduire les quatre bord de la lamelle avec le produit choisi ;
Déposer une goutte de sang et deux gouttes de solution réductrice au milieu de la lame ;
Mélanger avec la pointe de la pipette pasteur
Recouvrir avec les lamelles sans emprisonner de bulles d’air
Luter la lamelle par pression avec le doigt ou en chauffant les bords avec le fer à luter
Laisser reposer pendant 20 mn à la température du laboratoire si elle est supérieur à 18 °C
ou à l’étuve à 37°C
Observer la préparation au microscope avec un objectif à sec à fort grossissement.
Technique au vernis à ongles
Sans réactif, avec vernis à ongle (ou paraffine) : mettre une très petite goutte de sang
(environ 5 µl) sur une lame, juste à côté ou dessus, mettre une goutte environ 4 fois plus
grosse (environ 20 µl) de sérum physiologique (eau avec 9 g/l de sel). Mélanger
rapidement mais soigneusement.
Aspirer environ la moitié du liquide.
Couvrir rapidement d’une lamelle sans faire aucune bulle d’air. Recouvrir les 4 bords de
la lamelle de vernis à ongles pour que l’oxygène ne puisse absolument pas pénétrer.
Observer au microscope objectif 40 à 1 heure puis à 2, 6 et 24 heures si on n’a pas vu
d’hématies falciformes.
VI. résultats :
Quand les hématies contiennent de l’hémoglobine S, presque toutes les hématies (90 à
100%) vont se déformer ( sauf s’il existe un taux important d’hémoglobine F associée)
Chez les homozygotes S/S, forme effilée en faucille ou en fuseau avec fin prolongements.
Chez les hétérozygotes A/S , forme trapue en feuille de houx.

40
• Le test de Kleihauer
• Définition
• Le test de Kleihauer est un examen de laboratoire qui permet de mettre en évidence
la présence d'hématies fœtales parmi des hématies adultes maternelles. Il permet
également de s’assurer de la disparition des hématies fœtales quelques heures après
l’injection d’antiglobuline anti D.
• Il fut décrit en 1957 par les allemands Enno Kleihauer et Klaus Betke.

• Principe
• Les globules rouges sont dilués dans de l'eau physiologique au tiers. Ils sont ensuite
étalés sur une lame (frottis). Ce frottis est ensuite fixé par de l'alcool à 80%, puis, une
solution acide d'hématoxyline est appliquée au frottis afin d'éluer l'hémoglobine A.
L'hémoglobine du foetus (HbF) résistera donc à ce traitement et sera ensuite colorée
avec de l'éosine à 0,5%. L'observation de l'hémoglobine F, colorée en rose, est réalisée
au microscope optique. Cela permet de déterminer la proportion de globules rouges
présents dans le sang de la mère et donc le risque d'immunisation.
• Technique


• Ce test donne des informations sur la nécessité d'injecter une gamma globuline anti-
RH1 chez la mère RH:-1, mais sans savoir si le futur bébé sera RH1 positif ou négatif.
Si le fœtus est RH:-1, l'injection d'une gamma globuline anti-RH1 n'est pas nécessaire.
Le test de Kleihauer ne permet donc pas d'éviter l'injection inutile de gamma.

41
Détermination des groupes ABO

I. L’épreuve de Beth-Vincent (épreuve globulaire) :


1. Principe : c’est la mise en évidence des antigènes globulaires au moyen des sérums- tests
anti A, anti et anti A+B.
2. prélèvement : sang veineux, peut être effectué. Soit sur tube sec ou sur anti coagulant
(citrate ou EDTA).
Pour toutes les manipulations, il est préférable d’utiliser des globules rouges lavés
préalablement 3x en soluté salé isotonique.
Il faut donc centrifuger 3 minutes à 4000 t/mn l’échantillion à examiner. décanter le
surnageant ( sérum ou plasma )dans un tube soigneusement identifié. Dans un autre tube bien
identifié également placer quelques gouttes de culot globulaire et le laver 3 x en soluté
isotonique. Le remettre en suspension à 5% pour les réactions en tube et 10% pour les
réactions sur plaque.
3. réactifs :
- sérum anti A
- sérum anti B
- sérum anti A+B
4. technique :
a. Technique sur plaque d’opaline :
Déposer sur la plaque d’opaline :
- 1 goutte de serum test anti A
- 1 goutte de serum test anti B
- 1 goutte de serum test anti A+B

Déposer, à coté de chacune de ces gouttes, 1 goutte de globules rouges à tester en suspension
à 10% en soluté isotonique.
Mélanger soigneusement, à l’aide d’une baguette de verre rodée ou du fond d’un tube les
globules pour obtenir un rond de 2 cm environ de diamètre. L’agitateur doit être essuyé aprés
chaque mélange.
Appliquer, les mouvements d’oscillation circulaire à la plaque pendant 30 secondes et voir
les agglutinations.
b. Technique en tubes:
il faut utiliser des tubes en verre à usage unique.
Disposer et repérer au marqueur 3 tubes ; déposer :
- Dans le 1er tube, une goutte de sérum test anti-A
- Dans le second tube, une goutte de sérum-test anti B
- Dans le troisième tube, une goutte de sérum-test anti A+B

Dans chacun de ses 3 tubes, déposer une goutte de GR échantillons en suspension à 5 %,


mélanger en agitant légèrement, puis centrifuger 1 minute à 1000t/mn.
La lecture se fait en secouant légèrement les tubes et en observant simultanément les globules
rouges ; s’ils remettent aisement en suspension , il y’a absence d’agglutination ; s’ils se
présentent sous forme d’un culot se décollant difficilement en un ou plusieurs blocs , il y’a
présence d’agglutinations.

42
II. Méthode de Simmonin( épreuve sérique) :
1. Principe :
recherche des agglutinines anti- A et anti B à partir d’hématies tests de groupes connus A et
B. les résultats de cette méthode viennent confirmer la méthode globulaire.
2. Réactifs :
- hématies tests : les globules rouges A1,A2,B, et 0 doivent être préparés quotidiennement. Ils
sont également lavés 3x en soluté salé isotonique et remises en suspension à 5%.
a. Méthode sur plaque :
Déposer sur la plaque d’opaline , trois gouttes de sérum ou de plasma échantillon .
A coté de chacune de ces gouttes , déposer respectivement :
- 1 goutte d’hématies tests A1
- 1 goutte d’hématies tests A2
- 1 goutte d’hématies tests B

- Mélanger à l’aide d’une baguette de verre rodé ou du fond d’un tube


- Essuyer après chaque mélange
- Et voir les agglutinations de la même manière que pour la méthode globulaire.

b. Méthode en tube
Disposer et repérer au marqueur 3 tubes,
- Déposer dans chaque tube 1 goutte de sérum ou de plasma échantillon
- Ajouter au 1er tube 1 gtte de suspension d’hématies A1
- // 2eme tube // // A2
- // 3eme tube// // B

Mélanger en agitant légèrement puis centrifuger 1 mn à 1000t/mn, lire comme précédement.

III. Témoins
On utilise de manière systématique, pour toute détermination du groupe sanguin ABO, trois
témoins :
- Témoin « auto » : sérum ou plasma d’échantillon +globules rouges échantillons ; ce
témoin permet le contrôle des agglutinations observés dans des 2 épreuves.
- Témoin « ALLO » : sérum ou plasma échantillon + globules rouges tests de groupe O
et de constitution antigénique connue : ce temoin contrôle l’épreuve de simmonin ;
- Témoin « AB » : sérum ou plasma test provenant d’un individu de groupe AB+
globules rouges échantillons ; ce temoin contrôle la méthode de Beth Vincent .

Détermination du groupe ABO : interprétation des résultats


Epreuve Beth Vincent Simmonin T’auto T’allo T’AB
Sang à examiner Globules Sérum Sérum sujet Sérum sujet GR sujet
Réactifs Anti A/ B /A+B A1/ A2 / B GR sujet GR O Sérum AB
Groupe A + - + - + - - - -
Groupe B - + + + - - - - -
Groupe O - - - + + + - - -
Groupe AB + + + - - - - - -

43
IV. Détermination des sous groupes A et B
1. Les sous groupes A
L’antigéne A peut exister sous 2 variantes principales :
A1 et A2. Le sous groupe A1 possède l’ag A et l’antigène A1, le sous groupe A2 ne possède
que l’antigène A. La différenciation des sous-groupes A1 et A2 ne présente en pratique aucun
intérêt.
- Technique de sélection des hématies A1 et A2
- Réactifs : Sérum Anti A1

Sérum Anti H
Laver 3 x les hématies échantillons, les mettre en suspension à 2% , la détermination peut
s’effectuer sur plaque d’opaline ou en tubes . dans les 2 cas en met en présence une goutte de
chaque sérum test (anti –A1 et anti-H ) avec une goutte de chaque suspension de GR . On note
les agglutinations.

Sous groupe Anti A1 Anti H fréquence


A1 +++ à + - à+ 80%
A2 - +++ 20%

- Les sous groupes faibles A

Il existe des échantillons agglutinés faiblement par les sérums anti A , celle-ci peut même être
absente . Ils ne sont dépistés que par la discordance entre la méthode de Simmonin et celle de
Beth Vincent.
Sous – groupes sérums tests globules tests salive
faibles de A sécréteurs ABH
Anti A anti A+B A1 A2 A H
A3 ++ ++ +/- - ++ ++
- -
Ax +/- ++ ++/- +/- - ++

A end + + +/- - - ++
- -
Am -/+ -/+ - - ++ ++
Ay - - - - + ++
Ael - - ++ + - ++

44
2. Sous groupes de B
Il n’existe pas pour l’antigène B des sous groupes comparables a ceux de l’ag A (A1 et A2).
Par contre on retrouve pour l’ag B des sous groupes faibles.

Sous groupes faibles B sérums tests globules tests


Anti B anti A+B A1 A2 B
B3 ++ ++ ++ ++ -
- -
Bx + + ++ ++ -
Bw + + ++ ++ -
Bel - - ++ ++ -

V. Causes d’erreurs dans le groupage ABO


1. Causes d’erreurs non sérologiques :
- Erreur d’étiquetage des échantillons
- Erreurs de transcription, de confusion de noms ou d’homonymes.
2. Causes d’erreurs sérologiques :
Toute réaction discordante entre l’épreuve globulaire et l’épreuve sérique, de même que toute
positivité d’une ou plusieurs des réactions témoin, doivent amener à reprendre l’examen et à
faire poursuivre éventuellement les investigations complémentaires dans un laboratoire
spécialisé.
- Agglutinations faibles ou incomplètes :

Une agglutination faible ou incomplète dans l’épreuve de Beth Vincent peut être imputable à
un groupe faible. Il peut s’agir aussi de d’antigènes affaiblis lors d’états pathologiques.
- Double population d’hématies : une double population se caractérise par la présence
en quantité variable de GR non agglutinés au milieu d’agglutinats. on distingue 2 cas
principaux : les transfusions non iso groupes et/ ou incompatibles.

- Altération des GR : la contamination in vitro du prélèvement, on observe une


panagglutination, c’est à dire une agglutination de tous les tests y compris les
témoins.

- Présence d’auto anticorps : les auto- anticorps non agglutinants en milieux salins
(igG) ne sont pas en général, la source de problèmes dans le système ABO.
La présence d’auto- agglutinines froides est par contre fréquemment rencontrée. Elles
seront facilement soupçonnées devant la positivité du témoin auto.
Pour s’en débarrasser, effectuer 3 lavages avec une eau physiologique à 37°C pour
éluer les anticorps fixés sur les GR et les AC circulants.

Pour réussir l’épreuve sérique il faut absorber les autos anticorps froids à basse
température 4°C sur les propres globules rouges du sujet plusieurs fois.

- Hémolyse : La présence d’anticorps anti A ayant une activité hémolytique in vitro


peut être responsable d’une hémolyse lors de l’épreuve de Simmonin.
Lorsque une hémolyse est constatée , décomplémenter le sérum et refaire le test.

45
- Discordance entre l’épreuve sérique et globulaire :
Il peut s’agir d’un sujet présentant un génotype d’expression antigénique faible, il peut
aussi s’agir d’une hypogammaglobulinémie, avec diminution des anticorps anti A et
anti B.
3. Groupage sanguin chez le nouveau né :
Si le sang provient d’une ponction veineuse : aucune précaution à prendre
Si le sang provient du cordon, il faut impérativement laver 6 x l’échantillon pour
éliminer les substances macromoléculaires donnant l’aspect de fausses agglutinations.
L’épreuve de Simmonin est souvent perturbée. D’une par les allo anticorps de l’enfant ne
sont pas encore détectable. D’autre part certains allo anticorps peuvent se retrouver dans la
circulation de l’enfant.

46
Détermination du facteur Rhésus standard

Contrairement à ce que l’on observe dans le système ABO, ou il existe une possibilité
d’une contre épreuve grâce à la présence des agglutinines naturelles, une telle réaction
complémentaire fait défaut dans la détermination des antigènes du système rhésus. Il est donc
nécessaire d’éliminer les risques de réactions faussement positives ou faussement négatives
par les précautions suivantes :
1. Outre les réactions sut tube et sur plaque, il est impératif de pratiquer, chez les rhésus
négatif, une épreuve supplémentaire : le test de Coombs indirect ou des techniques les plus
sensibles surtout quand il s’agit de femmes enceinte ou de donneurs.
2. Pour chaque réaction, il faut disposer de témoins globulaires positif et négatif
3. D’un témoin auto.
I. Principe :
En présence de l’antigène D, les hématies sont agglutinées directement en contact avec le
sérum test anti D. Les hématies ayant une activité faible avec ce réactif sont révélées par la
réaction indirecte à l’antiglobuline.
II. Réactifs :
Sérums- tests anti RH : anti corps anti RH immuns d’origine humaine enrichie artificiellement
en milieux macro-moléculaires.
Conditions expérimentales :
La mise en évidence de l’antigène D est réalisée dans des conditions suivantes :
- La réaction doit être effectuée entre 37°C et 40°C
- La réaction doit être réalisée en milieu sérique
- La concentration globulaire utilisée doit être forte lorsque on utilise la technique sur
plaque.

III. Technique :
1. Détermination sur plaque chauffante :
Les hématies à tester sont utilisées non lavées, remises en suspension à 40% dans leur propre
sérum par agitation du tube initial
Amener la plaque à 40 °C environ
Disposer cote à cote
Sérum test anti D : 1 goutte
Sérum ou plasma échantillon ou d’un sérum témoin
Dans chacune de ces gouttes, faire tomber rapidement une goutte de suspension globulaire à
40% des hématies à examiner.
Adjoindre à chaque série de groupages un témoin positif et un témoin négatif (hématies RH +
et hématies RH – préparées dans les mêmes conditions que les échantillons) à mettre en
contact avec le sérum test anti D
Etaler les gouttes sur la plaque en les mélangeant sur une surface ronde de 2 cm de diamètre.
Imprimer à la plaque des mouvements d’oscillation
Et voir l’agglutination dans les 2 minutes
Résultats :
- Présence d’agglutination RH + positif
- Absence d’agglutination RH – négatif

2. Détermination en tubes ou microplaque


- Placer 1 goutte de sérum – test anti D dans un tube en verre

47
- Ajouter une goutte de globules rouges à tester en suspension sérique à 5 % (cette suspension
peut être effectuée dans son propre sérum ou plasma, ou après lavage dans le sérum AB)
- Adjoindre à chaque échantillon un témoin auto (une goutte de suspension d’hématies sans
anti –D)
- A chaque série de réactions un témoin RH + et un témoin RH- laisser le mélange
Laisser le mélange 1 à 2 heures à 37°C
Lire après centrifugation 1 mn à 1000t/mn
Toute réaction anormalement positive pour les témoins doit obligatoirement amener à
recommencer l’examen.
Toute réaction faible par rapport au témoin positif doit obligatoirement faire reprendre
l’examen avec une technique plus sensible.

Recherche du Dᵁ
L’antigène Dᵁ est une variante antigénique faible de l’antigène D. cet antigène fixe les
anticorps anti D incomplets sans provoquer directement l’agglutination des hématies qui le
portent. Pour le mettre en évidence il est donc nécessaire d’utiliser l’épreuve de Coombs à
l’antiglobuline.
Technique :
Déposer dans un tube à hémolyse une goutte de sérum Anti D et une goutte de suspension
d’hématies à 5 % en solution saline .
Agiter le mélange
Laisser en contact 1 heure à 37 °C
Laver 3 fois dans un grand volume de solution saline
Après avoir aspiré le dernier surnageant, remettre en suspension le culot globulaire lavé dans
le petit volume de surnageant restant.
La réaction de Coombs peut être effectuée en plaque ou en tube
1. Technique sur plaque d’opaline :
- Déposer une goutte d’anti- globuline
- Ajouter une suspension de GR sensibilisés
- Mélanger puis imprimer les mouvements d’oscillation circulaire
- Lire après 3 mn, confirmer les réactions négatives au bout de 5 mn
Joindre pour toute série de réactions :
- Un témoin positif : 1 goutte de solution d’antiglobuline + 1 goutte de suspension
d’hématies Rh + connues à 5% en solution saline
- Un témoin négatif: 1 goutte de solution d’antiglobuline + 1 goutte de suspension
d’hématies Rh - connus à 5% en solution saline.

2. Technique en tube ou en microplaque:


- Déposer dans un tube à hémolyse une goutte d’anti globuline
- Ajouter une goutte de suspension d’hématies sensibilisées
- Centrifuger 1 mn à 1000 t/mn
- Lire la présence ou l’absence des agglutinations par agitation douce

48
Recherche d’allo-anticorps irréguliers anti-érythrocytaires

Un allo-anticorps anti-érythrocytaire ne peut exister que si l’antigène correspondant est absent


des globules rouges. S’il est présent à chaque fois, il est dit « régulier » ; dans le cas contraire,
il est dit « irrégulier ».
Les anticorps peuvent exister sans immunisation apparente, ou, au contraire, etre secondaire à
une immunisation par transfusion ou par grossesse.
Principe :
On met le sérum à examiner en contact avec une gamme de globules rouges connus :
Le panel. Ces globules rouges ont été phénotypes dans le plus grand nombre possible de
systèmes de groupes. Ils sont choisis de façon à offrir une grande diversité d’antigènes et à
permettre le dépistage d’une variété aussi grande que possible de spécificités d’anticorps. le
panel donne aussi une possibilité d’identification : dans les cas simples, la coïncidence des
réactions positives avec la présence ou l’absence d’un antigène sur les hématies du panel
permet l’identification de l’anticorps correspondant. Mais il faut souligner le danger de
conclure hâtivement quand à la spécificité d’un anticorps que l’on a trouvé. On peut, par
exemple, dépister, en faisant les examens sur 3 échantillons, dont un D+ et deux D-, un
anticorps dont l’identification n’est pas poussée plus loin. Si le sérum agglutine le premier et
non les deux autres, peut-on dire qu’il s’agit d’un anti D ? on ne le peut pas : l’Ag D, sur le
premier échantillon, peut très bien coïncider avec la présence d’un autre antigène, qui serait,
lui aussi absent dans les deux autres. Par exemple si les échantillons de globules rouges
étaient CcDee, cc Dee et ccddEe, un anti C donnera les mêmes réactions.
L’identification doit être faite sur un nombre suffisant d’échantillons de globules rouges. Il
faut en outre que la formule antigénique de ces échantillons soit connue aussi complètement
que possible.
Il faut aussi que, au moins pour les échantillons correspondant à des anticorps aussi
communément rencontrés, les échantillons soient sélectionnés de façon à ce que deux de ces
anticorps n’agglutinent pas les mêmes échantillons. les conditions d’activité optimale varient
selon l’anticorps en cause de nature IgM ou IgG, agglutinant ou non en milieu Salin, actif à
basse température ou à 37°C, fixant ou non le complément.
Une recherche cohérente doit ainsi comprendre :
1. une réaction capable de détecter les anticorps agglutinant à basse température : saline à
22°C ou saline à 4 °C ;
2. une réaction capable de détecter les anticorps agglutinants à 37°C ;
3. une série de réactions capables de détecter les différents types d’anticorps incomplets :
réaction en sérum AB, test de coombs indirect polyvalent, réaction enzymatique.

49
PANEL DE G.R
Lot N° : 161 Négatif : 0
Exp. Le 15/11/09 Positif : +

N° Rhésus Kell Duffy Kidd Lewis MNS P


Luth.
G.R D C c E e Kell k Fya Fyb Jka Jkb Lea Leb M N S s P1 Lua Lub
1 + 0 + 0 + + + 0 + 0 + 0 + 0 0 + + 0 +
2 + + 0 0 + 0 0 + 0 + 0 + 0 + + + + 0 +
3 + 0 + + 0 0 + 0 + + 0 + 0 + 0 + + 0 +
4 + + + 0 + + + 0 + + + 0 0 + 0 + + + +
5 + + + + 0 0 0 + + + 0 0 0 + + + + 0 +
6 + + 0 0 + + 0 + + + + 0 0 + 0 + 0 0 +
7 0 0 + 0 + + + + 0 + 0 + 0 + 0 + + 0 +
8 0 + + 0 + 0 0 + + + 0 0 + 0 0 + + 0 +
9 0 + + 0 + 0 + + 0 + + 0 + + + 0 + 0 +
10 0 0 + 0 + 0 0 0 + 0 0 0 0 + 0 + 0 0 +
11 0 0 + 0 + 0 + + 0 + 0 + + 0 + 0 + 0 +
12 0 0 + 0 + 0 0 + + 0 0 + 0 + 0 + + 0 +

Prélèvement :
Le sang à examiner sera de préférence prélevé sur tube sec.
S’il y’a présence d’allo-anticorps irréguliers, les globules rouges du sujet doivent etre
phénotypes tés soigneusement. Ce phénotypage sert de contre épreuve lorsque la recherche
d’allo-anticorps irréguliers est positive, et peuvent aider à l’identification lorsque se pose des
problèmes.
Réactifs :
Panel et témoin auto
Les globules du panel doivent etre placées dans les conditions voulues pour permettre la
manifestation d’anticorps possédant les propriétés déjà indiquées. il est essentiel de leur
joindre un échantillon de globules rouges du sujet (témoin auto)
On prépare donc :
1. une suspension à 5% en soluté physiologique de globules rouges( lavés) du panel et du
sujet.
2. Une suspension à 5% en sérum AB
On traite en outre une petite quantité de ces GR par la papaine ou la broméline.
Sérum antiglobuline
On utilise ici un sérum polyvalent qui contient en particulier, outre les anticorps anti-Ig G, des
anticorps anti complément.
Il est important d’introduire, dans chaque série de réactions, au moins un témoin vérifiant
l’activité de l’antiglobuline.
Technique :
Pour chaque serum à examiner seront disposés 5 séries d’épreuves dont la mise en œuvre est
identique.
Ces épreuves seront effectuées selon le protocole ci-dessous :

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On devra inclure dans les épreuves un témoin de l’activité de l’antiglobuline. Ce témoin sera
inclus dans la série N° 1.
Examiner les tubes de la série 1 et voir s’il s’est produit une agglutination à 37° C de ces
globules rouges en milieu saline.
Epreuve Tubes GR-test (panel) Milieu Sérum T° de l’épreuve incubation
Nature gouttes à (heures)
tester(Gttes)

N° 1
Saline 37° C Kahn normal 1 salin 2 37°C 1
Coombs
Indierct

N° 2 microtube normal 1 salin 1 22°C 2


Saline 22°C

N° 3 microtube normal 1 sérique 1 37° C 2


Sérum AB

N° 4 microtube papaine 1 salin 1 37°C 1


Papaine

Laver la série 1 (y compris le témoin antiglobuline), pendant ce lavage, lire les résultats
obtenus dans la série 4,
Sur les globules lavés de la série 1, faire l’épreuve à l’antiglobuline sur plaque. Bien vérifier
le témoin.
Au bout de 2 heures lire les résultats obtenus dans la série 2 et 3.

Technique d’agglutination directe en tube de Kahn couplée avec le test de Coombs


Dans certains cas, il peut être commode d’effectuer successivement, dans le même tube de
Kahn, la recherche d’agglutination en soluté salé physiologique et le test de Coombs.
Premier temps (saline 37°C en tube de Kahn et temps de sensibilisation du test de
coombs)
Dans chaque tube de Kahn, déposer :
Une goutte de sérum,
Une goutte de globules rouges lavés remis en suspension à 5% en soluté salé physiologique.
Incuber 45 mn à l’étuve à 37°C
Centrifuger une minute à 1000 t/mn
On notera la présence éventuelle d’une hémolyse, qui se traduit par une coloration plus au
moins rosée du surnageant.
Taper ensuite légèrement le fond du tube sur un plan dur pour décoller le culot d’hématies. La
lecture sera alors faite à l’œil nu devant un fond blanc ; on peut parfois s’aider d’un miroir de
Kahn.
Si l’agglutination est (+++), il est inutile de poursuivre. Dans le cas contraire, on enchaine par
le test de Coombs.
Deuxième temps (Test de COOMBS)
Lavage
Pratiquer trois lavages en soluté salé isotonique. Pour décanter le surnageant, il est possible
d’incliner directement le tube ; on complétera la décantation avec une pipette de Pasteur.

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On notera une agglutination éventuelle après le premier lavage.
Après chaque lavage, il est très important de remettre le culot en suspension dans le petit
volume de liquide restant. Après adjonction de soluté salé physiologique, on aura soin
d’obtenir une suspension homogène.
Adjonction de l’antiglobuline
Après le dernier lavage, laisser dans le tube juste assez de soluté salé physiologique pour
obtenir une suspension globulaireà 5%. Cette suspension étant bien homogénéisée, ajouter
une goutte de d’antiglobuline.
Centrifuger une minute à 1000t/min
La lecture sera faite comme à la fin du premier temps.

Recherche des allo-anticorps anti-A et anti-B immuns


Les anticorps naturels et les anticorps immuns ont des propriétés sérologiques différentes qui
peuvent permettre de les séparer et de les identifier ; ceci est important car la présence
éventuelle d’anticorps immuns dans le plasma des sujets de groupe O peut produire des
accidents transfusionnels graves lorsque de tels sangs O sont transfusés à des sujets A, B ou
AB « donneur universel dangereux »
En pratique, la recherche du pouvoir hémolysant en présence de complément est la technique
manuelle la plus utilisée.
Principe :
La réaction consiste à détecter l’hémolyse éventuelle de globules rouges A ou B connus par le
sérum à examiner. Toute réaction hémolytique nécessite la présence de complément présent
dans le sérum à examiner. En théorie, il convient de détruire dans un premier temps le
complément présent dans le sérum à examiner et de le remplacer ensuite par une quantité
connue de complément.
En pratique, si le prélèvement à tester est frais, il peut servir de source de complément. Dans
le cas contraire, le complément provient d’un mélange théorique minimum de 20 échantillons
de sérums humains différents collectés depuis moins de 24 heures dans les proportions
suivantes : 50% de groupe O, 20% de groupe A, 20% de groupe B et 10% de groupe AB ; en
pratique un mélange de groupe AB est suffisant.

Materiel
Bain marie à 56°C
Bain marie ou étuve à 37°C
Tubes à hémolyse
Pipettes pasteurs et poires

Technique
La recherche des hémolysines anti- A et anti- B est effectuée simultanément.
Laver les globules rouges A1et B trois fois et les mettre en suspension isotonique à 10%
Décomplémenter le sérum à examiner par chauffage au bain marie à 56°C pendant 30mn.
Disposer sur un portoir 6 tubes à hémolyse :
Tube 1 : recherche des hémolysines A
Tube 2 : recherche des hémolysines B
Tube 3 : témoin sérum
Tube 4 : témoin complément
Tube 5 : témoin globules rouges A

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Tube 6 : témoin globules rouges B
Distribuer les quantités exprimées en gouttes dans le tableau suivant

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