Los métodos moleculares ofrecen una detección rápida, segura y rentable de bacterias patógenas,

incluido el Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA). Estas pruebas dependen de una rápida
extracción de ADN bacteriano. El objetivo de

este estudio fue para comparar un protocolo optimizado de extracción y purificación de ADN para MRSA
usando magnéticos

Nanopartículas con el método original. La pureza del ADN extraído se evaluó mediante mediciones
fotométricas y la cantidad de ADN se determinó mediante PCR en tiempo real. Tres cepas de referencia
de MRSA (S. aureus

ATCC® 70699, S. aureus ATCC® 43300; S. aureus ATCC® 33592) y once cepas de campo de MRSA, que
incluyen

En este estudio se utilizaron elementos SCCmec de los tipos I a XI. El protocolo optimizado puede
ahorrar aproximadamente 20 min.

El tiempo comparado con el método original y el rendimiento del ADN fue mayor con el nuevo
protocolo. Por lo tanto, esta nueva

El protocolo permite una extracción de ADN más rápida a partir de cultivos de MRSA.

puede ser un colonizador inofensivo de la piel y

Las superficies mucosas de los seres humanos y animales, pero representa - además de

Productor de β-lactamasa y carbapenemase de espectro extendido

Enterobactericeae entre otros, también un patógeno importante en humanos y

medicina Veterinaria. Varias infecciones pueden estar asociadas con S. aureus,

como infecciones de la piel y tejidos blandos, endocarditis, neumonía, osteomielitis y mastitis (Köck et
al., 2014). Estas infecciones suelen tratarse con β-lactámicos (Köck et al., 2014), pero esta opción no está

disponible para S. aureus resistente a la meticilina (MRSA), ya que MRSA son

Se considera resistente contra todos los β-lactámicos, excepto en algunos casos específicos.

sustancias autorizadas únicamente para medicina humana (CLSI, 2018). Por lo tanto, un

La detección rápida de MRSA es muy importante para un tratamiento adecuado de

Pacientes gravemente enfermos. En comparación con los métodos culturales que requieren

Varios días, los métodos moleculares permiten una detección más rápida de MRSA.

(Hogg et al., 2008; Stürenburg, 2009; Gao et al., 2018; Seidel et al.,
2017). En este contexto, la extracción de ADN es un paso importante para iniciar aplicaciones
posteriores como los ensayos de PCR (Hogg et al., 2008;

Wang et al., 2015). Varios métodos de extracción de ADN, incluyendo cualquiera

Kits comerciales o procedimientos de operación estándar, tales como hervir,

La extracción con fenol-cloroformo y los métodos basados en detergentes están disponibles

(Hassanzadeh et al., 2016). Estos métodos pueden venir junto con una

Baja pureza, tiempo de manejo, uso de solventes tóxicos y alta

riesgo de contaminación del ADN extraído (Hassanzadeh et al., 2016).

Las nanopartículas magnéticas (MNP) tienen la ventaja de tiempos de procesamiento más cortos, sin el
uso de productos químicos peligrosos. Su aplicacion

Permite la automatización, es fácil de manejar y tiene bajos costos, y proporciona

altos rendimientos de ADN de suficiente pureza (Wang et al., 2015).

El objetivo de este estudio fue modificar un ADN existente basado en MNP

Protocolo de extracción de Hodgson (2014) establecido para la extracción.

de ADN bacteriano de los alimentos y el agua y evaluar su eficiencia en términos

de tiempo reducido de análisis y rendimiento de ADN de MRSA.

2. Material y métodos.

2.1. Cepas bacterianas

Tres cepas de referencia de MRSA (ATCC® 70699; ATCC® 43300; ATCC®

33592) y once cepas de campo MRSA que comprenden las principales SCCmec

Los tipos I a XI fueron utilizados como objetivos. Los tipos SCCmec fueron confirmados por

análisis de secuencia (GATC Biotech AG, Constanza, Alemania). Todas las cepas

fueron mantenidos rutinariamente en agar sangre Columbia (Oxoid, Wesel,

Alemania). Las suspensiones bacterianas se prepararon inoculando un

Una colonia en 40 ml de caldo Giolitti-Cantoni (Merck KGaA, Darmstadt,

Alemania) e incubación durante 48 h a 36 ° C.

Staphylococcus aureus es un microorganismo Gram positivo que se considera parte de la microbiota
normal del ser humano y de animales, este microorganismo posee B lactamasas y carbapenemasa, lo
cual lo hace resistente a esta familia de antibióticos, por lo anterior es de vital importancia tener
mecanismos de detección de esta bacteria cuando está asociada a diferentes infecciones en lugares
como la piel y tejidos blandos o enfermedades como neumonía osteomielitis y mastitis que generan
graves problemas para la salud.

Para la extracción de ADN de este microorganismo se usaron Tres cepas de referencia de MRSA (ATCC®
70699; ATCC® 43300; ATCC® 33592) y once cepas de campo MRSA, para la extracion de ADN se le
hicieron diversos ajustes al proceso ya establecido lo cual arrojo resultados muy favorables en
comparación con el proceso tradicional.

Inicialmente se debía transferir 100 μL * de cultivo bacteriano a una taza estéril de 1,5 ml y se debía
centrifugar a 10.000 rpm durante 10 minutos< este paso fue omitido y en vez de eso se transfirió 100 μL
de una suspensión de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina a una taza estéril de 1,5 ml con
400 μL de solución tampón que contenia Tris-HCl 100 mM, EDTA 10 mM, NaCl 1 M, pH 8,0 y mezclado
bien esta solución< se debía agregar 10 μL de proteinasa K a la solución pero también fue omitido este
paso y vez de incubar las muestras 20 minutos a 65 c se realizó por 5 minutos a 100 C y no se realizó
centrifugación.

La suspensión fue transferida a una taza estéril de 1,5 ml con 400 μL de tampón de unión (20%), , se
incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos para unir el ADN a las nano partículas, estos se
inmovilizan magnéticamente y se elimina el sobrenadante.luego las nanoparticulas se lavan con 400 μL
de etanol al 75%., se inmovilizan magnéticamente y se elimina el tampón de lavado. El etanol se evapora
a temperatura ambiente. Las nanoparticulas se resuspenden en 100 l de agua desionizada y se incuban
5 minutos a 65 ° C. Finalmente, los MNP son magnéticamente. Inmovilizado de nuevo y el sobrenadante
que contiene ADN se transfiere a una nueva taza.

Este nuevo protocolo de extracción de ADN redujo considerablemente los tiempos de elaboración, y
para determinar la pureza y rendimiento del ADN extraído se usaron mediciones fotométricas Los
valores obtenidos van desde 9.23 a 79.75 ng / μl para el nuevo método en comparación con 2.47 a
16.29 ng /μl para el método original, lo cual representa una gran diferencia entre estos dos métodos y
una mayor efectividad del método nuevo.

El rendimiento del ADN podría deberse a la reducción de los pasos de lavado, ya que se pueden perder
cantidades variables de ADN durante cada etapa de lavado. Sin embargo, tales pasos de lavado podrían
ser necesarios para el aislamiento del ADN de matrices de alimentos u otras muestras que contienen
inhibidores de PCR potenciales.

Dado lo anterior se concluye que este nuevo método es muy eficaz para la extracción de ADN bacteriano
y que ayuda a la identificación de diferentes microrganismos que nos pueden afectar.

2.2. Comparación del método de extracción de ADN modificado y el original.

protocolo
El método de extracción de ADN utilizando MNP de Hodgson (2014) fue

Modificado (Tabla 1). El nuevo protocolo se realiza de la siguiente manera: Para la

método de extracción de ADN modificado 100 μL de una suspensión de MRSA fueron

transferido a una taza estéril de 1,5 ml con 400 μL de tampón (Tris-HCl 100 mM,

EDTA 10 mM, NaCl 1 M, pH 8,0 y mezclado bien. La pared celular se lisó incubando las muestras para

5 min a 100 ° C en un termosellador (700 rpm / min). La suspensión fue

transferido a una taza estéril de 1,5 ml con 400 μL de tampón de unión (20%)

polietilenglicol (Mr 8000) en 4 M NaCl (Carl Roth, Karlsruhe, Alemania)) y 60 μL de MNPs (Q-Bioanalytic
GmbH, Bremerhaven GmbH Alemania) e incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos para
unir el ADN a los MNP. Los MNPs son

Inmovilizado magnéticamente en un soporte magnético y el sobrenadante es

remoto. Luego, los MNP se resuspenden en 100 l de agua desionizada.

e incubado durante 5 min a 65 ° C. Finalmente, los MNP son magnéticamente.

Inmovilizado de nuevo y el sobrenadante que contiene ADN se transfiere

a una nueva taza.

El nuevo protocolo redujo los pasos de extracción / lavado y, por consiguiente, también el tiempo para
la extracción de ADN. Pruebas comparativas utilizando

Se realizaron las tres cepas de referencia y las once cepas de campo.

Comparar los dos métodos utilizando la misma suspensión bacteriana. Cada

La cepa se usó tres veces en ocasiones independientes para cada uno de los dos.

Protocolos de extracción de ADN (tabla 1). Por razones comparativas, 100 μL de

La suspensión bacteriana se utilizó como punto de partida para la extracción de ADN.

para facilitar el manejo debido al uso de tazas de 1,5 ml, aunque

Se utiliza 1 ml del pre-enriquecimiento para la detección de Listeria en el

Método original (Hodgson, 2014).

El rendimiento y la pureza del ADN extraído se evaluaron mediante mediciones fotométricas

(NanoDrop® 1000, Thermo Fisher, Waltham,

Massachusetts, EE. UU.), Que se realizaron por triplicado. Adicionalmente,

Se utilizaron 2 μL de ADN como plantilla para un TaqMan comercial en tiempo real

Kit de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Quick Blue RealTime PCR, kit de detección de
ADN - MRSA, Q-Bioanalytic GmbH,

Bremerhaven, Alemania). La PCR en tiempo real se realizó utilizando un

LC 480 Roche Cycler equipado con un bloque de calefacción de 384 pocillos

(Hoffmann-La Roche, Basilea, Suiza).

2.3. Análisis de datos y análisis estadístico.

Valores de la media geométrica (GM) de las tres mediciones NanoDrop®

de las concentraciones de ADN se transformaron logariticamente para lograr normal

distribución. Utilizamos el coeficiente de variación como medida de dispersión para los datos
distribuidos lognormal; se calcula como cociente de la

Desviación estándar a la media. El valor del ciclo umbral (CT) de la

Se utilizó PCR en tiempo real para estimar la cantidad de amplicones de la

Tensión objetivo y comparar los valores de diferentes experimentos.

La regresión lineal múltiple determinó la significación estadística. los

La concentración de ADN y los valores de CT de la qPCR en tiempo real fueron

En comparación con el método de extracción de ADN, ajustando para

Cada suspensión de cada cepa. Adicionalmente, realizamos un análisis estratificado.

por tensión Las diferencias se reportan a medida que los múltiplos de extracción aumentan con el
respectivo intervalo de confianza del 95%. Los intervalos de confianza de las diferencias, que no
contienen uno, pueden considerarse significativos. Además, la pureza del ADN se evaluó utilizando el

Las proporciones A260 / A280 y A230 / 280, determinadas por las mediciones de NanoDrop®
(http://www.nhm.ac.uk/content/dam/nhmwww/ourscience/dpts-facilities-
staff/Coreresearchlabs/nanodrop.pdf). Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando la versión R
3.50 (R Foundation

La extracción de ADN juega un papel importante para el uso de aplicaciones, tales como PCR o análisis
de secuencia (Wang et al., 2015). En

En este estudio, modificamos un método existente originalmente diseñado para el

Extracción de ADN de matrices alimentarias (Hodgson, 2014). La ebullicion

paso durante la extracción de ADN parecía tener un efecto positivo en el

rendimiento de ácido nucleico, que ya se ha demostrado anteriormente

(Hassanzadeh et al., 2016). Sin embargo, la ebullición de las bacterias es a menudo

asociado con una baja pureza del ADN extraído (Hassanzadeh et al.,

2016), que puede compensarse con el uso de MNP (Hodgson, 2014;

Wang et al., 2015). El método optimizado y el protocolo original.

(Tabla 1) se probaron en paralelo utilizando 100 μL de la misma bacteria

Cultivos de tres cepas de referencia MRSA y once cepas con el

SCCmec tipos I a XI. Los dos elementos SCCmec identificados más recientemente, SCCmec tipo XII (Wu et
al., 2015) y SCCmec tipo XIII (Baig

et al., 2018), no se incluyeron en este estudio como Staphylococcus aureus

cepas que llevan estos elementos SCCmec no estaban disponibles para nosotros en

El tiempo de realización de los experimentos. La extracción de ADN fue

Realizado para cada cepa tres veces utilizando cultivos puros.

Los valores GM de las medidas de NanoDrop® por triplicado obtenidas

para las cantidades de ADN para cada cepa en las diferentes pruebas que van desde

9.23 a 79.75 ng / μl para el nuevo método en comparación con 2.47 a 16.29 ng /

μl para el método original (tabla 2). La amplia gama obtenida para el

Las cantidades de ADN podrían deberse a las diferentes densidades de inóculo utilizadas. Estas

los resultados confirmaron un mayor rendimiento de ADN con el nuevo método en comparación con

El protocolo original (Fig. 1a, Tabla S1a). La razón de lo más alto.

El rendimiento del ADN podría deberse a la reducción de los pasos de lavado, ya que

Se pueden perder cantidades variables de ADN durante cada etapa de lavado.

Sin embargo, tales pasos de lavado podrían ser necesarios para el aislamiento del ADN.

de matrices de alimentos u otras muestras que contienen inhibidores de PCR potenciales. Además, la
variación en las cantidades de ADN extraído fue

Baje utilizando el nuevo método como lo indica un coeficiente de variación.

(CV) de 5.98% (IC 95% [3.16%, 8.79%]) cuando se usa el nuevo método

comparado con el 10.1% (95% CI [7.91%, 12.29%]) cuando se usa el original

método. Además, los datos pueden mostrar que el nuevo método dio lugar a

mayores rendimientos de ADN independientemente de la cantidad de bacterias en el cultivo.

Sin embargo, si se obtuvieron mayores rendimientos de ADN con el método anterior, el

El beneficio agregado del nuevo método fue menor. Tres repeticiones con

Se realizaron diferentes suspensiones y tres mediciones cada una por

Tensión, resultando en nueve valores obtenidos con los valores antiguos y nueve.

Obtenido con el nuevo método. Esto puede proporcionar una visión general

En cuanto a la estabilidad y reproducibilidad del método a nivel de deformación.

Dado que estas pruebas se han realizado para 14 cepas que conducen a 252

En total, el tamaño de la muestra es suficiente para estimar un

Beneficio general del nuevo método.

Las relaciones A260 / A280 de las mediciones NanoDrop® pueden ser

utilizado para determinar la pureza del ADN (Hassanzadeh et al., 2016).

Los valores de aproximadamente 1.8 demuestran un ADN puro libre de contaminación proteica
(Dauphin et al., 2010; http://www.nhm.ac.uk/content/

dam / nhmwww / our-science / dpts-facilities-staff / Coreresearchlabs /

nanodrop.pdf). Se determinaron valores medios de A260 / A280 de alrededor de 1.4

para ambos métodos (nuevo método 1.38, método original 1.41) apuntando

Hacia la contaminación proteica en los extractos de ADN. El A230 / 280

las proporciones fueron de 0.694 para el viejo versus 0.740 para el nuevo método.

Sin embargo, las secuencias diana todavía podrían ser detectadas en posteriores

Ensayos de PCR en tiempo real. Sin embargo, Dauphin et al. (2010) encontraron que el

La pureza del ADN parecía tener una influencia mayor que la del ADN.

concentración en el límite de detección de PCR en tiempo real de Yersinia pestis,

lo que también podría ser asumido para MRSA.

Los resultados de la PCR en tiempo real demostraron valores de TC más bajos para el método
optimizado en comparación con el método original (Fig. 1b, Tabla S1b).

El valor de CT representa el ciclo de PCR en el que se cruza el umbral

Por la señal fluorescente. El valor numérico de la TC es inversamente

relacionado con la cantidad de amplicón, y por lo tanto, cuanto menor sea la TC

valor, cuanto mayor sea la cantidad de amplicones y plantilla de ADN en el

muestra (Schmittgen y Livak, 2008). Esto indica que una mayor

La cantidad de ADN se extrajo utilizando el método optimizado, que fue

Confirmado por el análisis estadístico.

4. Conclusión

Este estudio demostró que el protocolo optimizado es superior al

Método de Hodgson (2014) en términos de tiempo y rendimiento de ADN. Puede

ser utilizado con éxito para extraer y purificar el ADN de forma rápida y eficiente

de varias cepas de MRSA que se utilizarán para el análisis posterior como RTPCR

Fondos

El trabajo fue apoyado por el Ministerio Federal Alemán de

Educación e Investigación (BMBF) a través del Centro Aeroespacial Alemán

(DLR), conceda los números 01KI1301D y 1KI1301H (MedVet-Staph 2).

Conflicto de intereses

JH, KS y BO están presentes y CE, EE, JWE son ex empleados de

Q-Bioanalytic GmbH, Bremerhaven, Alemania. Otros autores: ninguno a

declarar.

Expresiones de gratitud

Agradecemos al consorcio MedVet-Staph por su asesoramiento en el diseño del

ensayo de extracción. Agradecemos a Stefan Ulrich, Fabian Busch y

Jens-Oliver Axe (Q-Bioanalytic GmbH, Bremerhaven, Alemania) para

Excelente asistencia técnica y asesoramiento. Agradecemos a Ingo

Klarholz (ttz Bremerhaven, Alemania) por proporcionar equipo técnico y asesoramiento. Agradecemos a
Ralf Ehricht y Stefan Monecke por proporcionar las cepas MRSA utilizadas en este estudio.

Anexo A. Datos suplementarios.

El material complementario relacionado con este artículo se puede encontrar, en el

Versión en línea, en doi: https: //doi.org/10.1016/j.vetmic.2019.01.00