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Grupo 5QV1
Sección 2
Equipo 12
Alumnos:
Suarez Gómez Alexis Gabriel
Torres Márquez Dafne Yaqueline
Urquizo Pulido Gerardo Gustavo
Profesores:
Fig 1. Esquema del modelo propuesto por Watson y Crick en 1953. A la derecha se muestra
una representación de cómo funciona el apareamiento de bases nitrogenadas, creando tres
puentes de hidrógeno entre Guanina y Citosina, dos puentes entre Adenina y Timina.
Cuando una solución de DNA bicatenaria se calienta por encima de una temperatura
característica su estructura nativa se pierde y se separan sus dos hebras
complementarias, y asume un estado conformacional flexible y que fluctúan con
rapidez conocida como espirales al azar. Este proceso de desnaturalización se
acompaña por un cambio cualitativo en las propiedades físicas del DNA.
La manera más conveniente de monitorizar el estado nativo del DNA es por su
espectro de absorción ultravioleta. Cuando el DNA se desnaturaliza, su absorbancia
UV, que casi en su totalidad se debe a sus bases aromaticas, aumenta alrededor del
40% en todas las longitudes de onda. Este fenómeno, conocido como efecto
hipercrómico, es resultado de la ruptura de las interacciones electrónicas entre las
bases cercanas. El cambio hipercrómico del DNA, monitorizado a una longitud de
onda particular (por lo general 260 nm), se produce en límites de temperatura
estrechos. Esto indica que el colapso de una parte de la estructura dúplex del DNA
desestabiliza el resto, un fenómeno conocido como proceso cooperativo.
OBJETIVOS
● · Aislar DNA cromosómico de alto peso molecular, a partir de un cultivo
bacteriano de Escherichia coli w3350.
● · Establecer el espectro de absorción del DNA aislado.
● · Determinar la concentración y grado de pureza del DNA obtenido.
● Determinar la influencia de algunas características de la secuencia del DNA
sobre su desnaturalización empleando el programa bioinformático DNAMAN
DESARROLLO EXPERIMENTAL
1er. día
Inocular 200 µl del cultivo
5mL caldo L obtenido
Sembrar asada
9200 rpm x g
5 minutos
Eliminar el
Eliminar el sobrenadante
sobrenadante
Suspender el
9200 rpm x g
paquete celular en
5 minutos
500 µl de TE pH 7.8
(Tris 50 mM/EDTA
20 mM).
Agitar suavemente Incubar 37°C con
Suspender las Adicionar 1 µl de por inversión agitación (10 minutos)
células en 175 µl RNAsa (10 mg/ml)
de TE pH 7.8 (Tris
50 mM/EDTA 20
mM).
Adicionar 50 µl de
Lisozima (50 mg/ml) y 20
µl de (SDS) al 10%
Incubar 37°C con Mezclar por inversión
agitación (30 minutos)
Extraer cuidadosamente
Pasar la fase acuosa con la micropipeta la fase
a un tubo limpio acuosa
9200 rpm x g
3 minutos
Descartar el
sobrenadante
sin desprender Adicionar
9200 rpm x g
el botón 1mL de 3 minutos
sedimentado Etanol al 70%
frio.
Permitir que el
DNA seque Descartar el
y disolver en sobrenadante
200 µl de agua
destilada estéril
o TE.
Equipos λ (nm)
-Cálculos de pureza del DNA de Escherichia coli W3350 extraído por el equipo 12
𝐴𝑠260𝑛𝑚 0.454
𝑃𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎 = = = 1.8
𝐴𝑠280𝑛𝑚 0.251
DISCUSIÓN
La determinación de la concentración del DNA se calculó por 2 métodos, el primero
fue en una fórmula con su absorción a 260nm y su índice de absorción específica,
qué es la medida de la potencia máxima con la que el campo electromagnético de
radiofrecuencia será absorbido por el DNA, en este cálculo se obtuvo una
concentración de 80.71µg/mL mientras que en el otro cálculo en el cual, está basado
en la turbidimetría, se toma en cuenta las unidades de absorbancia del DNA de doble
cadena con su relación de 50 µg/mL por cada unidad de absorbancia se obtuvo una
concentración de 90.8µg/mL Sin embargo este último método no considera que el
DNA no es la única molécula que absorbe a una longitud de onda de 260nm, por lo
tanto este último método también puede verse interferido por la absorbancia de otras
sustancias como el DNA de cadena sencilla el RNA, que también tiene gran
absorbancia a 260nm, o los aminoácidos aromáticos presentes en las proteínas, que
tienen su mayor absorbancia a 280nm, todos estos factores pueden hacer que el
cálculo de la concentración del DNA por este método se vea sobreestimado por lo
que el cálculo basado en el índice de absorción específica puede ser más exacto en
la cuantificación de DNA. Por lo tanto la concentración más viable es la del método
uno, en donde se utiliza la formula puesto que no hay un componente que interfiera.
CONCLUSIONES
● Se logró el aislamiento del DNA cromosómico de doble cadena de una cepa
de Escherichia coli W3350, comprobando su aislamiento por
espectrofotometría
● El espectro de absorción del DNA extraído mostró una mayor absorbancia a
260 nm
● Se obtuvo una concentración de 80.71µg/mL y una pureza de 1.80
● Se determinó por medio del programa bioinformático DNAMAN que el factor
más influyente en la temperatura media de fusión es el contenido porcentual
de guanina y citosina dentro del oligonucleótido
REFERENCIAS
● Neidhardt F.C. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology.
Vol 1. pp. 14, ASM Press 1996.
● creeme wey, soy 100tifico
● Surzycki, Stefan. (2003)“Human Molecular Biology” EU. Blackwell Publishing.
pp 3-11
● Donald Voet, Judith G. Voet. “Bioquímica” 3ª Edición. Buenos Aires: Editorial
Medica Panamericana, 2006, pp-97,98.
● http://www.bancoadn.org/docs/programa-control-calidad-muestras.pdf
(consultada 10-Febrero-2019)