ENZIMAS DE RESTRICCION

Zaida E. Cadena M.
Estudiante de Biología

Universidad de Pamplona, Facultad de Ciencias Básicas, Departamento de Biología

Email: zahedi@hotmail.es

RESUMEN

Las enzimas de restricción son Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas,
son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que
reconocen las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias
palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones). En el desarrollo de la práctica se
utilizaron muestras de ADN vegetal y animal; las cuales se les agrego un plásmido y una enzima
específica, realizándose luego un corrido en la cámara de electroforesis para así obtener bandas o
fragmentos de diferentes pb cortados por las enzimas, con lo anterior se resalta la importancia de las
enzimas de restricción pues gracias a ellas se puede cortar un gen especifico de interés y colocarse
dentro de otro organismo generando asi recombinaciones.

PALABRAS CLAVES: ADN, enzimas de restricción, plásmido, buffer.

INTRODUCCION

Las enzimas de restricción se denominan nucleasas que cortan el ADN cuando

también nucleasas de restricción, reconocen un patrón de secuencia específico.
endonucleasas de restricción y en ocasiones
Se nombran con tres letradas del género y
restrictasas. Pertenecen a este grupo una gran
especie de la bacteria de la que se aislaron
diversidad de endo desoxirribonluceasas,
originalmente, seguidas a veces por una letra
descubiertas como enzimas propias de
más, que identifica el serotipo (variante
distintas bacterias. Se dispone hoy
antigénica de la bacteria) y, finalmente, por un
comercialmente de un gran número de ellas
número romano que las identifica cuando en
con elevada especificidad, estabilidad y
una misma variante se hayan encontrado
pureza.
varias enzimas con distinta especificidad.
Las enzimas de restricción son nucleasas que
La importancia de las enzimas de restricción
cortan ADN de doble cadena cuando
radica en su gran especificidad para reconocer
reconocen un patrón de secuencia específico.
una secuencia corta de DNA bicatenario e
Generan fragmentos de ADN conocidos como
hidrolizar un enlace fosfodiéster en cada hebra,
fragmentos de restricción. Las enzimas de
siempre en la misma posición. Cada enzima se
restricción son herramientas imprescindibles
caracteriza, pues, por su sitio o secuencia de
en biología molecular, ingeniería genética y
reconocimiento o de restricción, o secuencia
biotecnología. Las enzimas de restricción son
diana. Los fragmentos de DNA resultantes son
útiles para iniciar la clonación celular o
acelular, para el análisis del DNA, para
elaborar mapas físicos de restricción o para la
detección de polimorfismos.
Las diversas enzimas de restricción se
agrupan en tres familias, de acuerdo con sus
propiedades: Tipo I, Tipo II y Tipo III. 1(
Anonimo 25/05/2017).
Existen 3 tipos de enzimas de restricción:
1. Tipo I y Tipo III:
a. Tienen actividad de restricción (cortan) y
modificación (metilan).
b. Cortan a cierta distancia de la secuencia
de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos de la
secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba
o río abajo. Las Tipo III cortan de 5-8 bases
antes o después de la secuencia que
reconocen.
c. Necesitan ATP para moverse a través de
la molécula de DNA, desde el lugar de
reconocimiento hasta el sitio del corte.
2. Tipo II:
a. Sólo tienen actividad de restricción.
b. Cortan de manera consistente y
predecible dentro de la secuencia que
reconocen.
c. Sólo requieren Mg++ como cofactor.
d. No necesitan ATP.
·Aplicaciones de las enzimas de
restricción:
1. Hacer mapa de restricción de un
plásmido o bacteriófago.
2. Fragmentar DNA genómico para
separación de electroforesis y “Southern Blot”.
3. Generación de fragmentos para ser
usados como sondas marcadas en
“Southern”y “Northern” blotting.
4. Generación de fragmentos para ser sub
clonados en los vectores apropiados, creación
de DNA recombinante. 2. (Rivera et, al;
26/05/2017).
El objetivo principal de la práctica se basa en
la utilización de diferentes enzimas de
restricción las cuales se pliegan a la molécula
de ADN que serán evidentes en los
fragmentos de ADN observados tras hacer a
corrida en el gel de agarosa.
METODOLOGIA
El desarrollo de la práctica de enzimas de 4 ADN+enzima 2
restricción se tuvo en cuenta, las muestras de ADN 5 Plásmido + Band H1 2
vegetal y ADN de muestra de Sangre; obtenidas en 6 ADN kit 2
la práctica de extracción de ADN. Para la 7 Plásmido PUC 18 Hind III 3
realización de la siembra se tuvo en cuenta.
8 ADN+ Hind III 3
Cantidad Muestra 9 Plásmido +EcoRI +Band II 4
16µl H2O 10 ADN+EcoRI +Band II 4
2µl Buffer
1µl DNA Finalmente se realizó el revelado del gel para así
1µl Enzimas realizar la observación de las bandas obtenidas.

Se tomaron 2 tubos ependorff los cuales se

rotularon con #1 y #2. Evidencias en imágenes del Procedimiento que
se tuvo en cuenta.
Se adiciono a cada tubo los diferentes
componentes tenidos en cuenta en la tabla anterior;
utilizando la enzima Hind III y el plásmido PUC 18.
En el #1 se agregó el plásmido PUC 18 +Hind iii y
e #2 ADN + Hind iii.
Después de agregados cada uno de los
componentes a cada tubo, se agitaron para que
hubiera homogeneidad en cada tubo y así mismo
no se quedara anda adherido a las paredes.
Se procede a introducir las muestras a centrifugado
por 2 minutos a 12000 RPMx100. Fig.1. Adición del Plásmido PUC 18.

Pasados los 2 minutos se sacan de la centrifuga y

se introducen en la incubadora por 1 hora a 37˚. Al
pasar la hora se agrega 2UL del buffer de carga y
se procede a sembrar.
Una vez sembrados se introducen en cámara de
electroforesis durante 40 minutos a 90 voltios.
Para la siembra se tuvo en cuenta el siguiente
orden y así mismo el plásmido.

pozo grupo Muestra

1 Marcador Fig. 2. Adición de la enzima (Hind III).
2 Plásmido +Eco RI 1
3 ADN+EcoRI 1

Fig. 3. Adición del buffer de carga específico para
la enzima que se trabajó.
Fig 4. Adición de 3 µl de buffer de carga + 12 µl
de cada muestra.
Fig 5. Siembra en los diferentes pozos por cada
grupo. ; Luego se realizó la corrida durante 40
minutos.
CONCLUSIONES
RESULTADOS
Se obtuvo el revelado final de los fragmentos de
ADN con diferentes pares de bases usando l
enzimas de restricción, después corrida en la
cámara durante 40 minutos.
Fig 6. Bandeo formado por las enzimas de
restricción junto al ADN y el plásmido en cada uno
de los pozos.
ANALISIS DE RESULTADOS
Al realizar la observación del bandeo obtenido en
los diferentes pozo ; y tener en cuenta el pozo 7 y
8 que correspondían a las siembras realizadas por
el grupo de trabajo ; no se observó presencia de
fragmentos de ADN unidos a enzimas de
restricción , lo anterior se debe a varios factores
como es el método de siembra, al igual que no se
utilizara la cantidad exacta de muestra de ADN, así
mismo que las muestras después de hacer la
corrida en la cámara por ser de pequeño tamaño
no logran visualizarse según el marcador de peso
molecular.
La obtención del bandeo formado por fragmentos
de ADN unidos a enzimas de restricción puede
estar interferido por la composición y fuerza de mayor tamaño; de esto modo depende la
eléctrica del tampón lo cual afecta la corrida del posición de los mismos en el gel.
ADN; pues si se realiza con pocos iones la
BIBLIOGRAFIA
molécula no se moverá y si por el contrario la carga
de iones es de un nivel alto la molécula se fundirá.
Durante la corrida electroforética el tamaño es un 1.http://bioted.es/protocolos/INTRODUCCION-
factor importante pues los fragmentos de menor ENZ-RESTRICCION.pdf
tamaño corren más rápido en comparación a los

2.http://academic.uprm.edu/~jvelezg/EnzimasDNA
.htm

ANEXOS
HindIII es una enzima de restricción de tipo II (EC 3.1.21.4)1 producida por el microorganismo Haemophilus
influenzae que posee una diana de restricción en el ADN de cadena doble dependiente de una secuencia
metilada, palindrómica y asimétrica, sobre la cual su actividad catalítica hidrolasa genera extremos cohesivos.
La diana de restricción puede representarse según este diagrama: