6.

PARÁMETROS PARA ELABORACIÓN DEL INFORME

1. Realice un esquema/dibujo y un diagrama de flujo del procedimiento donde explique

el fundamento bioquímico de cada una de las etapas de la extracción de proteínas.

2. Explique el efecto del Buffer RIPA (teniendo en cuenta sus componentes) que
permiten la posterior extracción de proteínas de la muestra.
¿Cuál es la razón por la cual las proteínas se ubican en el sobrenadante después de la
centrifugación con el buffer RIPA? ¿Qué componentes se ubican en el precipitado?

R// RIPA es un buffer ampliamente usado para la lisis celular y solubilización proteica
debido a su contenido de sales tipo cloruro de sodio (NaCl) y Trisaminometano (Tris) y
detergentes como el Tritón X-100, Dodecilsulfato sódico (SDS) y el Desoxicolato de sodio.
Principios básicos tales como la ósmosis celular y la estructura fosfolipídica de la
membrana fundamentan el uso de dicho buffer en este procedimiento.

3. Explique qué metodología(s) podría utilizar para analizar la calidad y calidad de las
proteínas extraídas.

Cromatografía de filtración en gel La filtracion en gel separa proteínas (o ácidos

nucleicos) con base en su tamaño efectivo (radio hidrodinamico). Como la cromatografía
de intercambio
iónico, el material de separación consiste en cuentas diminutas que se empacan en una
columna a través de la cual la solución de proteína pasa lentamente. Los materiales que
se emplean en la filtración por gel se componen de polisacáridos con enlaces cruzados
(dextranos o agarosa) de distinta porosidad, lo que permite que las proteínas se difundan
dentro y fuera de las cuentas.
La mejor forma de describir la técnica es con un ejemplo (fig. 18-25). encuentra en
solución con dos proteínas contaminantes de forma similar, una mucho más grande de
250 000 daltones, y la
otra mucho más pequeña, de 75 000 daltones. Un modo en que la proteína podría
purificarse consiste en pasar la mezcla por una columna de cuentas Sephadex G-150,
que permite la entrada
de proteínas globulares menores de 200 kDa. Cuando la mezcla de proteínas pasa por el
lecho de la columna, la proteína de 250 kDa es incapaz de entrar a las cuentas y
permanece disuelta
en la fase solvente móvil. Como resultado la proteína de 250 kDa se extrae en cuanto el
solvente de la columna (el volumen del lecho) termina de gotear. En cambio, las otras
dos proteínas pueden difundirse a los intersticios entre las cuentas y su paso por la
columna se retrasa. Conforme más solvente pasa por la columna, estas proteínas se
mueven hacia abajo y salen por el fondo, pero lo hacen a distintas velocidades. Entre las
proteínas que entran a las cuentas, las especies más pequeñas se retrasan más que las
grandes. Por consiguiente la proteína de 125 kDa se extrae en estado purificado, en
tanto que la proteína de 75 kDa permanece en la columna.

4. Describa algunas aplicaciones biomédicas de la extracción de proteínas a partir de

muestras biológicas

Extracción de proteínas de tejidos y cultivos celulares por ultrasonidos

La extracción de proteínas es un paso esencial en la preparación de muestras en

proteómica.

Las proteínas pueden extraerse de tejidos vegetales y animales, levaduras y

microorganismos.

La sonicación es un método confiable y eficiente de extracción de proteínas que

proporciona altos rendimientos de proteínas en un tiempo de extracción corto.

Extracción de proteínas

La extracción de proteínas de tejidos y células cultivadas es una etapa esencial de

preparación de la muestra que se realiza durante muchas técnicas bioquímicas y
analíticas como ELISA, PAGE, Western blotting, espectrometría de masas, o
purificación de proteínas. Ultrasónico Alteración celular, lisis y extracción. Es una
técnica precisamente controlable para asegurar altos rendimientos de proteínas

Extracción de proteínas del suero sanguíneo, Extracción de proteínas de tejido vegetal,

extracción ultrasónica de albúmina de semillas de calabaza,
5. Realice la curva de calibración (Absorbancia vs Concentración) y describa como puede
asegurarse a partir de este grafico que la solución cumple la ley de Lambert-Beer.
Determine la ecuación de la curva y=mx+b con los datos obtenidos

6. Determine la concentración proteica en la muestra desconocida y en la muestra de

hígado a partir de los datos de absorbancia y utilizando la ecuación obtenida en la curva
de calibración.

7. Teniendo en cuenta la función del hígado, ¿Qué tipo de proteínas de expresión

abundante esperaría usted en este tejido? Explique.

El hígado cumple funciones importantes: almacena la energía proveniente de los

alimentos, produce proteínas y ayuda a eliminar toxinas. El hígado también fabrica la
bilis, un líquido que ayuda a hacer la digestión.

 La alanina aminotransferasa (ALT). Esta enzima, presente en el hígado, cumple

una función en el metabolismo (el proceso que convierte los alimentos en
energía). Si el hígado se lesiona, se libera ALT en el torrente sanguíneo. Los
niveles de ALT son particularmente elevados cuando existe una hepatitis aguda.

 Fosfatasa alcalina (ALP). Esta enzima se encuentra en el hígado, los huesos, los
intestinos, los riñones y otros órganos. Tanto los niños como los adolescentes
 tienen niveles de ALP más elevados que los adultos, aún cuando están sanos, a
causa del crecimiento óseo. Pero los niveles de ALP también pueden aumentar
como consecuencia de infecciones virales, enfermedades hepáticas y el bloqueo
de los conductos biliares.

 Aspartato aminotransferasa (AST). Esta enzima, que desempeña un papel en el

procesamiento de proteínas, está presente en el hígado, el corazón, los músculos
y los riñones. Cuando el hígado se lesiona o inflama, los niveles de AST en la
sangre suelen ser elevados.

 Bilirrubina total y bilirrubina directa. La bilirrubina es un derivado de la

degradación de los glóbulos rojos. Por lo general, pasa a través del hígado y es
eliminada del organismo. Pero si esto no ocurre, a causa de una enfermedad
hepática, los niveles de bilirrubina en la sangre suelen aumentar y la piel se
torna amarillenta (ictericia). Los análisis de bilirrubina pueden ser total (miden
el nivel de toda la bilirrubina en sangre) o directa (miden solamente la
bilirrubina que ha sido procesada por el hígado y como resultado se ha unido a
otras sustancias químicas).

 Albúmina y proteína total. La proteína es necesaria para formar y mantener los

músculos, los huesos, la sangre y el tejido de los órganos. A veces, cuando hay un
problema con el hígado, éste no puede producir proteínas y, por lo tanto, los
niveles de proteínas disminuyen. Los análisis de las funciones hepáticas miden
específicamente la albúmina (la proteína más importante de la sangre producida
por el hígado) y la cantidad total de todo tipo de proteínas en la sangre.