PRACTICA NO.

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CINETICA ENZIMATICA

Jose González1 (200731510), Cristian Gutierrez1 (201604014), Esteban Toño1 (201604170),

Rhydjard Montenegro1 (201604221), Helen Gaitán1 (201616850)
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Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, Universidad de San Carlos
de Guatemala, Carrera de Química Biológica

INTRODUCCIÓN
Las reacciones químicas en los sistemas biológicos ocurren en presencia de catalizadores,
que son proteínas específicas denominadas enzimas, existen factores que pueden alterar la acción
de estas proteínas, tal como: temperatura, pH, concentración de sustrato y efecto inhibidor
(Koolman,2005). La fosfatasa alcalina es una enzima que está presente en los tejidos corporales,
principalmente en el epitelio intestinal y en osteoblastos, por lo que conocer su actividad enzimática
es importante para la detección de enfermedades (Arderiu, 1998). Su actividad se puede determinar
utilizando como sustrato al p-nitrofenilfosfato, que al ser hidrolizado origina p-nitrofenol, compuesto
coloreado que en solución alcalina absorbe luz en la zona visible del espectro (Izquierdo, 2004). Este
sustrato fue empleado en la práctica con el objetivo de conocer la cinética enzimática de la fosfatasa
alcalina, en donde se obtuvieron las absorbancias en una longitud de onda de 405 nm y la velocidad
de reacción, ambas se determinaron en relación con la concentración de sustrato.
METODOLOGÍA Gráfica 1. Curva de calibración de estándar de
La fosfatasa alcalina es una enzima p-nitrofenol.
que cataliza la hidrólisis del enlace éster
fosfórico en un grupo orgánico y un fosforilo a
pH alcalino (Richterich y Colombo, 1983). Se
determinaron lo datos cinéticos de la
fosfatasa alcalina sobre el sustrato p-
nitrofenilfosfato. Se realizó una curva de p-
nitrofenol (producto) para obtener la
ecuación de la recta; a partir de ésta obtener
las diferentes concentraciones de producto y
Fuente: Datos experimentales, obtenidos en
a su vez analizar el efecto de la concentración
de sustrato en la actividad de la fosfatasa el Laboratorio de Bioquímica, Edificio T-12,
alcalina, al aumentar la concentración de USAC.
sustrato aumenta la actividad de la enzima, *µg/mL= microgramos por mL de estándar.
hasta llegar a su máximo valor de velocidad *Rf= coeficiente de regresión lineal.
en el cual todo el enzima ha formado
complejo con su sustrato (Nelsony Cox, 2015).
En la Gráfica 1 se observa la curva de
La curva de calibración se obtuvo por medio
calibración del estándar de p-nitrofenol, la
de la espectrofotometría, este método mide
ecuación con una pendiente m = 0.1371 indica
la cantidad de luz que absorben las sustancias
el valor de linealidad de la recta, así mismo se
a una longitud de onda determinada (Skoog,
determinó estadísticamente el coeficiente de
Holler y Crouch, 2008).
regresión lineal R2 = 0.9989 que indica la
RESULTADOS
correlación entre la absorbancia de la muestra
(Eje Y) y la concentración* del p-nitrofenol
(Eje X).
Gráfica 2. Cinética enzimática de la fosfatasa
alcalina respecto a la velocidad (Vo) de
p-nitrofenol formado en una hora.
Fuente: Datos experimentales, obtenidos en
el Laboratorio de Bioquímica, Edificio T-12,
USAC.
*Molaridad: mmol/mL de p-nitrofenilfosfato.
En la Gráfica 2 se observa la curva de
velocidad del p-nitrofenol formado por hora
con un comportamiento logarítmico (Curva
punteada). En el Eje Y se muestra las
velocidades iniciales de reacción respecto al
Eje X que muestra las concentraciones del
sustrato; la Vo máxima de la reacción se
asocia a una concentración del sustrato de
0.0048M, cuyos valores fueron calculados
algebraicamente.
Gráfica 3. Representación de Lineweaber-
Burk. Inversos de Vo enzimática Vs. Inversos
de concentraciones de p-nitrofenilfosfato.
Fuente: Datos experimentales, obtenidos en
el Laboratorio de Bioquímica, Edificio T-12,
USAC.
*Constante de Michaelis-Menten.
En la Gráfica 3 se observa la curva de
transformación de Lineweaver-Burk. Se
calcularon los parámetros cinéticos Vmáx. con
un valor de 2.3 [p-nitrofenol] M/Hora y Km =
1.1274. Se calculó la ecuación de la recta y el
coeficiente de regresión lineal R2 = 0.8154 que
indica la correlación entre el inverso de Vo
(Eje Y) y el inverso de p-nitrofenilfosfato (Eje
X).
DISCUSIÓN
Los ensayos enzimáticos miden la
velocidad con la que una enzima trabaja en un
determinado tiempo, por ello se recopiló en
las gráficas 2 y 3 la relación entre el tiempo
que tarda una determinada cantidad de
sustrato [S] en transformarse en producto [P].
En esta práctica se determinó los datos
cinéticos de la fosfatasa alcalina del suero
humano, esta enzima tiene la ventaja de
actuar sobre diferentes sustratos, entre ellos
el p-nitrofenilfosfato que cambia de color
cuando son hidrolizados por la enzima,
pudiendo así ser determinado por
espectrofotometría (Plummer, 1998).
La gráfica 1 muestra la relación lineal de la
absorbancia y las concentraciones del p-
nitrofenol, esta curva de calibración se utilizó
para calcular la concentración de p-nitrofenol
a partir de las absorbancias obtenidas,
determinando así que a medida que
incrementa la absorbancia va aumentando la
concentración concluyendo que obedece la
ley de beer-lambert.
En la gráfica 2 se observó cómo al aumentar el
tiempo la concentración del producto (p-
nitrofenol) también aumenta, esto debido a
que la relación es directamente proporcional
ya que a medida que la concentración del
sustrato se agrega mayor cantidad de p-
nitrofenil fosfato produce provocando así una
mayor velocidad de producción. vez que la
reacción deja de seguir la linealidad se
produce una meseta la cual se debe al
decremento de la concentración del sustrato
desnaturalizando e incluso inhibiendo
(Lehninger, 2015).
Se ha demostrado experimentalmente que si
la concentración de la enzima es mantenida
constante y la concentración del sustrato es
incrementado gradualmente, la velocidad de
la reacción incrementara hasta que alcance un
máximo, después de este punto los
incrementos en la concentración enzima-
sustrato es 1:1 por lo cual la enzima sigue una
cinética de saturación descrita por la ecuación
de Michaelis-Menten. El Km es un factor que
indica la afinidad de la enzima por su sustrato
y mientras más pequeño sea su valor hay mas
afinidad de la enzima por el sustrato. En la
gráfica 3 se observó que la fosfatasa alcalina
no está llevando a cabo su reacción normal
catalítica por lo tanto su Km se ve aumentado
por lo que indica que la afinidad entre el
complejo enzima es débil. Determinando así
una baja pureza de la enzima esta
disminución de afinidad es debida a que el
paciente presenta una mala alimentacion
debido a que consumen muy poco contenido
de zinc y proteínas (Arderiu, 1998).
CONCLUSIONES
La enzima fosfatasa alcalina del
suero humano, puede actuar sobre varios
sustratos, al actuar sobre el p-
nitrofenilfosfato cambia de coloración
cuando es hidrolizado por dicha enzima.
A medida de que se aumentó la
concentración del p-nitrofenol, se observó
que tiene una relación con la absorbancia ya
que también aumentó al momento de
medirla.
Se ha demostrado que si la
concentración de la enzima se mantiene
constante la concentración del sustrato
incrementa gradualmente, por lo tanto la
velocidad de la reacción incrementa hasta
llegar a un máximo, posteriormente la
enzima-sustrato sigue una cinética de
saturación.
REFERENCIAS
Arderiu, F. (1998). Bioquímica clínica y
patología molecular. Barcelona España:
Reverté
Bowes, G. & Comb, R. (1988).
Measurement of total alkaline phosphatase
activity in human serum. Clin.Chem.
Izquierdo, F. (2004). Cinética de las
reacciones químicas. Barcelona: Universidad
de Barcelona E.
Koolman, J. (2005). Bioquímica: Texto
y atlas. Buenos Aires Argentina:
Panamericana
Nelson, D., y Cox, M. (2015).
Lehninger: Principios de bioquímica.
Barcelona: OMEGA.
Plummer, D. (1981). Introducción a la
Bioquímica práctica. Colombia: McGraw Hill,
latinoamericana.
 Richterich, R. y Colombo, J. (1983). Figura 1. Representación de V en función de
Química clínica: teoría, práctica e [S], para enzima que obedece la cinética de
interpretación. España: Salvat Michaelis-Menten.
Skoog, D., Holler, F. y Crouch, S.
(2008). Principios de Análisis Instrumental.
(6ta Ed.). México: Cengage Learning

ANEXOS

Fuente: Cinetica Enzimatica:

valoracion de fosfata alcalina. (s.f.)
recuperado de :
http://www3.uah.es/bioquimica/San
cho/farmacia/practicas/fosfatasa.pdf