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Escherichia coli
Angélica M. Arcila Lopera1, Ana M. Ávila García2
Resumen
Los plásmidos son ampliamente usados en el área de la biología molecular, dado
que son fáciles de manipular puesto que tienen un tamaño pequeño. Existen
diferentes métodos para aislar ADN plasmídico, siendo la más común, por su
rapidez y que se requiera de poco contenido de ADN plasmídico, la lisis alcalina. En
esta práctica se aisló y purificó ADN plasmídico de una cepa de Escherichia coli
transformada y con el de poder observar el ADN plasmídico en la electroforesis en
gel de agarosa. Los resultados no son los esperados debido a algunos errores
experimentales, por lo tanto se sugiere tener más cuidado al seguir el protocolo
sugerido.
Palabras clave: plásmidos, cultivo bacteriano transformado, biotecnología,
electroforesis plasmídica
Abstract
Plasmids are widely used in molecular biology area, given they are easy to
manipulate since they have a small size. There are differents methods for isolate
plasmid DNA, being the most common, because of its great speed and that its
requires little content of plasmid DNA, alkaline lysis. In this practice, plasmid DNA
was isolated and purified from a transformed Escherichia coli strain and with the
power of looking at the plasmid DNA in the agarose gel electrophoresis. The results
are not as expected due to experimental errors, therefore, it is suggested to be more
careful when following the suggested protocol.
Keywords: plasmids, transformed bacterial culture, biotechnology, plasmidic
electrophoresis
Introducción
Los plásmidos han sido usados como herramientas en diferentes áreas de la
biología como: la biotecnología y la biología molecular usandolos para la clonación
del ADN. Esto es gracias a su pequeño tamaño en comparación con los
cromosomas que facilita su extracción y su manipulación. Además, sus propiedades
de replicación y conjugación son de gran ayuda para el análisis genético. Existen
diferentes técnicas para aislar el ADN plasmídico, en esta práctica usamos el
método de extracción por lisis alcalina. Este método aprovecha las diferencias en el
tamaño y la superhelicidad que es el grado de torsión que sufre el ADN plasmídico
en contraste con el cromosomal. La mayoría de los cromosomas bacterianos, son
1
angelica.arcila@udea.edu.co
2
amaria.avila@udea.edu.co
moléculas circulares extremadamente grandes que no se encuentran
superenrollados, mientras que los plásmidos son moléculas pequeñas y
superenrolladas. Durante el proceso de extracción, se busca desnaturalizar el ADN
plasmídico y el cromosomal y posteriormente renaturalizar, con el fin de que el ADN
cromosomal, no se aparee rápidamente y pueda ser atrapado por complejos
proteicos, los cuales precipitarán; a diferencia del ADN plasmídico que rápidamente
se renaturaliza y adquirirá su conformación natural. (Rojas et al., 2017). En esta
práctica se aisló y purificó ADN plasmídico de una cepa de Escherichia coli
transformada y con el de poder observar el ADN plasmídico en la electroforesis en
gel de agarosa.
Materiales y Métodos:
Los materiales y los equipos usados en esta práctica fueron: Cepa de Escherichia
coli transformada (12ml), isopropanol (2400 μL), tampón de Lisis ( 2100μL), lisozima
(150μL), ampicilina, tubos de centrífuga estériles, falcon® ( 20 mL), tubos de
microcentrífuga estériles Eppendorf – Tubos®. ( 1,5 mL), micropipetas, parafilm,
pipetas pasteur, RNasa A (Libre de ADNsa), 240 μL Acetato sódico (2,5 M), tampón
TE ( (1050μL) Tris-HCl, 10mM; EDTA, 1 mM (pH 8,0)), cloroformo (1800μL) ( Mezcla
cloroformo alcohol isoamilico ( 24:1, v/v), etanol al 99.6% (conservado a -20°C),
hielo, fenol (600μL), acetato de amonio, palillos estériles centrífuga a T°ambiente,
vortex, gel de agarosa al 0,8% con o Bromuro de etidio (BrEt) a una concentración
final de 0,5 ug/mL, marcador de peso molecular de 1Kb ADN Step Ladder, colorante
de carga, cámara de electroforesis y transiluminador ultravioleta.
Se siguió el protocolo sugerido en el manual de laboratorio (Vanegas et al., 2018),
con algunos cambios; la monitora del curso realizó el cultivo celular de la cepa E.
coli resistente a ampicilina para la obtención ADN plasmídico. El estudiante Juan
Pablo alzate preparó el gel de agarosa al 0,8%, con Bromuro de etidio a una
concentración final de 0,5 ug/mL. Luego cada pareja realizó dos muestras de ADN
plasmídico, para un total de 8 muestras. Primero se aisló el ADN plasmídico, luego
se purificó y se aumentó la concentración con etanol, siguiendo el protocolo (se
cambiaron algunos volúmenes sugeridos en la guia y estos están especificados
junto con los materiales) para finalizar se ejecutó el ADN de plásmido en un gel de
agarosa, por falta de tiempo no se realizó la cuantificación de ADN.
Resultados
Después de realizar el protocolo sugerido por Vanegas et al. (2018), donde se aisló,
purificó y posteriormente se corrió el plásmido en un gel de electroforesis (Fig. 1), se
obtuvo un gel que se esperaba se observaran bandas gruesas en cada uno de los 8
pozos donde se colocaron las muestras de ADN plasmídico.
Al visualizar las bandas de ADN del gel en el transiluminador UV (Fig. 2) se puede
observar que de las 8 muestras de ADN plasmídico corrido, sólo una muestra se
puede ver con una banda delgada color anaranjado fluorescente en la parte superior
del gel en el pozo A1 y una leve banda anaranjado fluorescente muy delgada e
indeleble, en la parte superior correspondiente también al pozo A2, casi al borde del
gel, correspondiente a nuestro equipo de trabajo, las otras 6 muestras no se
observan en el gel de agarosa, ni las bandas de Marcador de peso molecular (P1 y
P2).
Fig. 1. Orden de los pozos. P1,P2 Marcadores de peso molecular, JP1 y JP2
muestras de Juan Pablo Alzate, J1 y J2 muestras de Jessica Wagner. A1 y A2
muestras de Angélica Arcila y Ana Maria Avila, S1 y S2 muestras de Sebastian
Sánchez y Cristhian Tomann
Conclusiones
Se aislaron, purificaron y corrieron en gel de agarosa 2 moléculas de ADN
plasmídico de E. coli (correspondiente a nuestro equipo), d
e las cuales sólo una fue
exitosa evidenciándose en la electroforesis; para que este tipo de prácticas sean
exitosas se recomienda tener más cuidado y rapidez a la hora de realizar cada uno
de los pasos sugeridos en el protocolo, como no hablar encima de las muestras y
esperar los tiempos estipulados.
Las muestras se visualizan en la parte superior del gel debido a que no se tuvo
cuidado al poner los electrodos y la peinilla en la cámara de electroforesis, por lo
tanto se sugiere más cuidado a la hora de realizar este paso.
Agradecimientos
El equipo de trabajo agradece a Ángela, la monitora por haber preparado el cultivo
de cepas transformadas de E. coli y los demás reactivos y equipos usados en esta
práctica, también a la profesora Ana María Mesa por asesorarnos y acompañarnos
en cada paso de la práctica. A Juan Pablo Alzate por preparar el gel donde se
realizó la electroforesis y a Sebastián Sánchez por preparar cada muestra con el
colorante de corrido y colocar cada muestra en los pozos del gel.
Referencias