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Unité de recherche
EN LABORATOIRE DE CONFINEMENT L2

SOMMAIRE

1- INTRODUCTION ..................................................................................................................... 2

2- CONSIGNES DE SECURITE GENERALES .................................................................................... 2

3- ENTREE DANS LE LABORATOIRE ............................................................................................. 3

4- TRAVAIL DANS LA SALLE DE CULTURE L2 ................................................................................ 3


4.1- UTILISATION D’UN PSM II.......................................................................................................3
4.2- CAS PARTICULIER DES OGM ...................................................................................................5

5- GESTION DES DECHETS .......................................................................................................... 5


5.1. DECHETS BIOLOGIQUES SOLIDES ...........................................................................................5
5.2. DECHETS BIOLOGIQUES LIQUIDES .........................................................................................6
5.3. CAS PARTICULIER DES OGM ...................................................................................................6

6- NETTOYAGE ET DESINFECTION .............................................................................................. 7


6.1 - DESINFECTION DES SURFACES AVEC ANIOXY-SPRAY WS ...................................................7
6.2- DESINFECTION DE LIQUIDE AVEC REA-STABIL ....................................................................8
6.2- NETTOYAGE REGULIER ........................................................................................................8

7- SORTIE DU LABORATOIRE ...................................................................................................... 8

8- PROCEDURES D’URGENCE ..................................................................................................... 9

9- INTERVENTION SUR LE MATERIEL DES LABORATOIRES DE CONFINEMENT L2 ......................... 9

REDACTION Signature VERIFICATION Signature APPROBATION Signature Date d’application


Aurore GIRARDEAU Angélique ERRAUD
Leslie AUDIGANE
Amandine CAILLAUD Stéphanie BONNAUD
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1- INTRODUCTION

Les laboratoires de confinement L2 sont à considérer comme des outils et non comme des pièces de travail classiques.
Leur accès est strictement réservé aux seules personnes autorisées à y pénétrer et formées spécifiquement pour y
travailler.

Ce guide de bonnes pratiques en L2 a pour objectif d’harmoniser les pratiques d’utilisation de ces structures de
confinement et de leurs équipements. Il fournit une référence technique aux personnels qui travaillent ou envisagent
de travailler en laboratoire de niveau de confinement L2.

La variété d’organisation des laboratoires, de leurs équipements et des applications scientifiques qui y sont
développées est telle qu’elle rend impossible toute harmonisation stricte, au sein d’un document unique et exhaustif.
Ce guide est donc un document type qui doit être adapté et/ou complété pour tenir compte de la situation locale par
les utilisateurs en concertation avec la cellule hygiène et sécurité.

2- CONSIGNES DE SECURITE GENERALES

Il est interdit de consommer ou de conserver des aliments ou des boissons dans les sas des laboratoires L2 et dans
les laboratoires L2. Il est interdit de fumer, se maquiller, manipuler des lentilles de contact et se ronger les ongles.

Il est interdit d’entreposer des vêtements civils ou d’autres blouses que les blouses L2 dans le sas.

Le nombre de personnes travaillant en même temps dans un laboratoire L2 (hors 122) doit être limité à 4.

Les entrées et sorties dans les laboratoires L2 doivent être réduites au maximum.

Un téléphone est disponible dans tous les laboratoires L2 pour communiquer avec l’extérieur du L2.

Seuls les agents biologiques de groupe 1 et 2 peuvent être manipulés dans les laboratoires de confinement L2 (voir
Tableau 1).

Tableau 1. Groupe de risques des agents biologiques : les agents biologiques autorisés à être manipulés en laboratoire de
confinement L2 sont entourés en bleu, les autres sont interdits.
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Les OGM regroupent tout organisme dont le matériel génétique a été modifié autrement que par multiplication ou
recombinaison naturelles. Leur production ou utilisation nécessite d’en avoir fait la déclaration auprès du HCB1.
Chaque manipulation d’OGM est classée en confinement OGM C1 ou OGM C2. Leur utilisation nécessite des
précautions supplémentaires détaillées dans ce document.

3- ENTREE DANS LE LABORATOIRE

Seules les personnes formées et informées de la nature des recherches sont autorisées à entrer dans le laboratoire
L2. La liste du personnel autorisé est affichée à l'extérieur du laboratoire, elle est mise à jour par le chargé de la
qualité à la demande du référent de laboratoire.
Avant d’ouvrir une porte du sas (accès couloir ou accès laboratoire), il faut systématiquement vérifier que les autres
portes soient bien fermées.

Mettre des sur-chaussures


Se laver les mains
Mettre une blouse réservée au L2 (logo de l’institut entouré de rouge)
Mettre des gants
Si du matériel doit être entré dans le laboratoire, désinfecter l’extérieur
Entrer dans le laboratoire L2

Règles spécifiques à l’utilisation de vecteurs viraux : mettre, en plus sur la blouse L2, une sur-blouse à fermeture
dorsale et une double paire de gants.

Changer de gants toutes les 20-30 minutes.

4- TRAVAIL DANS LE LABORATOIRE DE CONFINEMENT L2

Nettoyer et désinfecter les surfaces de travail (PSM II, paillasse) avant et après manipulation.

Utiliser du matériel jetable uniquement.

Des incubateurs, réfrigérateurs et congélateurs sont disponibles dans les laboratoires L2 et sont dédiés au stockage
et à la conservation des milieux de cultures, des cultures et des échantillons.

4.1- UTILISATION D’UN PSM II

Liste des opérations à réaliser impérativement sous PSM II :


− Maintenance et traitements des lignées cellulaires nécessitant un confinement L2 :
o Congélation
o Décongélation
o Repiquage
o Préparation de traitements
1

Haut Conseil des Biotechnologies (Ministère de l’enseignement supérieur, de la recherche et de l’innovation)


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o Changement de milieu et traitements
o Manipulation OGM : Transduction, Infection, Transfection…
− Traitement de cellules à la mitomycine (Attention : la mitomycine est un agent classé mutagène (cat. 1A)
cancérigène (cat. 1A) et reprotoxique (cat. 2))
− Réception et manipulation de prélèvements humains

Note : Préparation des échantillons pour des manipulations hors PSM II : rester sous PSM II au maximum,
transférer la manip sous Sorbonne si utilisation de produits chimiques dangereux. Traiter tous les déchets
conformément au niveau de confinement des échantillons.

1 seul utilisateur par PSM II

Mettre la ventilation du PSM en fonctionnement 15 minutes avant la manipulation


Régler la hauteur du siège
Nettoyer et désinfecter le plan de travail et la vitre du PSM II
Désinfecter le matériel nécessaire à la manipulation
Positionner le matériel sur le plan de travail du PSM II en n'obstruant pas les bandeaux d'aspiration avant
et arrière
Eviter de surcharger la zone de travail et les bandeaux de reprise d’air des PSM II, afin de ne pas perturber
les flux. Ne pas utiliser plus de 40% de la zone de travail
Se positionner de façon à ne pas gêner l'aspiration par la veine de garde (bandeau d'air aspiré à l'avant
du plan de travail qui crée une barrière immatérielle et protège le manipulateur)
Utiliser les repose-poignets si ils sont présents

Ne pas passer la main au-dessus des tubes, boîtes de cônes ou contenants de culture cellulaire ouverts et limiter
l'ouverture de ces derniers au maximum.

Mettre en œuvre toutes les pratiques opératoires évitant la formation de gouttelettes et aérosols :
- Éviter les éjections sous pression
- Éviter les pipetages rapides
- Ouvrir les tubes après centrifugation avec délicatesse
- Réaliser les remises en suspension avec précaution : aspirations et refoulements doux et écoulement des
liquides contre les parois du récipient.

A la fin de la manipulation :
Laisser le PSM en fonctionnement pendant 5 à 10 minutes pour purger l'intérieur de tout aérosol
contaminant
Ranger le plan de travail
Nettoyer et désinfecter le plan de travail
Laisser en fonctionnement 15 minutes pour éliminer les aérosols générés par le nettoyage
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4.2- CAS PARTICULIER DES OGM


Les PSM II utilisés pour la manipulation des OGM doivent impérativement avoir été certifiés par le LNE (mention NF
sur le PSM II). La manipulation d’OGM dans les PSM II doit être clairement mentionnée. Aucun OGM ne doit être
manipulé sous les PSM II non identifié OGM.

Selon les cas, port :


o d’une blouse spécifique OGM et d’une paire de gants spécifiques qui ne serviront que pour les
manipulations OGM
o ET, d’une sur-blouse jetable et d’une double paire de gants pour la manipulation de vecteurs viraux
A la fin de la manipulation ou avant de commencer une manipulation sans OGM :
o Changer les gants et la blouse, se laver les mains.
o Dans le cas de manipulations de vecteurs viraux, retirer la première paire de gant, retirer la sur-blouse
et la blouse spécifique avant de retirer la dernière paire de gants. Se laver les mains.

Note : Ces pratiques de travail dans le cadre de manipulation d’OGM pourront être modifiées en fonction du type de
vecteurs, de cellules hôtes ou de gènes modifiés dans les projets scientifiques.

5- GESTION DES DECHETS

5.1. DECHETS BIOLOGIQUES SOLIDES

Tous les déchets biologiques solides (matériel jetable contaminé, tubes, plaques de cultures…) sont
évacués dans les poubelles jaunes de Déchets d’Activité de Soins à Risques Infectieux (DASRI).

Identifier les poubelles DASRI à l’ouverture et à la fermeture (Noter sur l’emballage : le nom de l’unité, le N° de
pièce, la date et vos initiales).
Ne pas « bourrer » les poubelles DASRI : risques de perforation.
Bien refermer le sachet plastique avec le lien.
Evacuer les poubelles dès qu’elles sont pleines devant les monte-charges.

Tous les objets, piquants, coupants, tranchants contaminés ou non sont jetés dans les poubelles
jaunes en plastique rigide (boite pour déchets perforants d’activités de soins). Une fois pleine, les
boites sont fermées et déposées dans une poubelle DASRI carton.

Les grandes quantités de pipettes doivent être récupérées dans les bacs à pipettes. Une fois pleine,
les boites sont correctement fermées et déposées dans une poubelle DASRI classique. Trop de
pipettes en vrac dans une poubelle DASRI carton risqueraient de la perforer !
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5.2. DECHETS BIOLOGIQUES LIQUIDES

Les déchets biologiques liquides en petites quantités (Vol <50mL) doivent être placés dans des
contenants fermés (ex: tubes Falcon) puis éliminés dans le DASRI, avec un maximum d'1L par DASRI.

Les déchets biologiques liquides en grandes quantité doivent être gélifiés puis éliminés en DASRI.

CONSIGNES POUR LA GELIFICATION DES DECHETS BIOLOGIQUES


• Mettre le gélifiant dans la poche de récupération des déchets biologiques liquides
• Bien refermer le bouchon
• Mélanger et laisser agir quelques minutes
• Mélanger, si nécessaire relaisser agir quelques minutes
• Bien vérifier la gélification de toute la poche
• Eliminer la poche en DASRI

5.3. CAS PARTICULIER DES OGM

Tous les DASRI contenant des déchets d’OGM doivent être identifiés OGM C1 ou OGM C2.

Utilisez les petits sachets rouges de récupération des déchets biologiques directement sous le PSM II.
Fermer et désinfecter le sachet avant de le sortir du PSM et le mettre dans le DASRI.
L’évacuation des déchets biologiques solides doit être faite après chaque manipulation.
Décontamination a minima des déchets solides ayant été en contact avec les OGM C2 (vecteurs viraux
notamment) par aspiration refoulement de solution désinfectante (Javel).

Les déchets liquides doivent être inactivés directement sous le PSM II après chaque manipulation avec
0,43% de chlore actif final pendant minimum 12 heures. Après inactivation, ces déchets doivent être
gélifiés puis éliminés en DASRI.
Utilisez de la javel en pastille et fermer le bouchon de la poche après avoir introduit la pastille sous
PSM II, ou par aspiration d'eau de javel dans les poches d’aspiration.
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6- NETTOYAGE ET DESINFECTION

6.1 - DESINFECTION DES SURFACES AVEC ANIOXY-SPRAY WS


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6.2- DESINFECTION DE LIQUIDE AVEC REA-STABIL

6.2- NETTOYAGE REGULIER

Dans chaque laboratoire de confinement L2, un planning d’entretien est établi afin d’assurer le nettoyage en
profondeur des PSM II, incubateurs et autres équipements le nécessitant.

Le sol est nettoyé et désinfecté une fois par semaine par le service logistique.

7- SORTIE DU LABORATOIRE

Après manipulation, veiller à l'extinction des appareils en fin de journée (système d'aspiration, PSM II,
bain-marie)
Vérifier les stocks de consommables et réactifs et les renouveler si nécessaire
Sortir dans le sas
Retirer la blouse dans le sas
Retirer les surchaussures (à jeter en DASRI)
Retirer les gants (à jeter en DASRI)
Se laver les mains
Eteindre la lumière

Transport d’échantillons entre deux laboratoires :


Les échantillons doivent être transportés dans une boite plastique fermée avec un couvercle étanche. L’extérieur de
la boite doit être désinfectée avant de sortir du sas.
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8- PROCEDURES D’URGENCE

Un téléphone est disponible dans tous les laboratoire L2

• Déversement de liquide : Mettre des gants propres. Absorber le liquide avec un papier absorbant, changer
de gants puis désinfecter. Nettoyer la surface au désinfectant au moins 2 fois. Vérifier que le liquide ne soit
pas tombé sous le plan de travail du PSM, nettoyer en suivant les mêmes instructions si c’est le cas. Changer
de gants après le nettoyage! Jeter tous les déchets dans un DASRI (gants, papiers absorbants).

• Décontamination d'un incubateur : Mettre des gants propres. Vider l’incubateur si besoin, absorber le liquide
avec du papier absorbant, changer de gants et désinfecter les surfaces souillées de l’incubateur (ANIOXY-
SPRAY WS : voir fiche technique). Si l'incubateur est équipé d'une réserve d'eau, la vider dans un seau et
traiter l'eau comme un déchet biologique liquide (0.43% Chlore actif - 12h). Remettre de l'eau propre.
Changer de gants après le nettoyage! Jeter tous les déchets dans un DASRI (gants, papiers absorbants).

• Décontamination d'un bain-marie : Mettre des gants propres. Eteindre le bain-marie, puis le vider dans un
seau et traiter l'eau comme un déchet biologique liquide (0.43% Chlore actif - 12h). Changer de gants,
désinfecter le bain-marie, changer de gants et remplir le bain-marie (eau distillée ou milliQ), ajouter le
désinfectant liquide.! Jeter tous les déchets dans un DASRI (gants, papiers absorbants).

9- INTERVENTION SUR LE MATERIEL DES LABORATOIRES DE CONFINEMENT L2

Pour toute intervention d’une personne extérieure sur un équipement de laboratoire de confinement L2, une analyse
de risque est réalisée pour déterminer si une décontamination est nécessaire. Cette décontamination est
systématiquement réalisée lors de la mise au rebut d’un équipement. Un certificat de décontamination est alors
remis au prestataire en charge de la destruction, maintenance ou entretien de l’équipement.
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