1.1.

METODOLOGIA

1.1.1. MATERIALES Y EQUIPOS

a) MATERIALES

 Vasos precipitados
 Probetas
 Pipetas
 Matraz Erlenmeyer
 Papel filtro
 Placas Petri
 Termómetro
 Petri film para acetobacter
 Calentador eléctrico
 Cuchillo

b) EQUIPOS
 Estufa
 Espectrofotómetro
 Balanza analítica
 PH metro
 Congelador
 Birreactor
 Licuadora

c) REACTIVOS
 Agua destilada
 Hidróxido de Sodio 0.1 N
 Etanol 90 y 70 %
 Ácido Nítrico
 Fungicida
 Acetato de Sodio
 Muestra de Gluconacetobacter xylinus
 Fruta recolectada de mercados
1.1.2. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Se procedió a producir películas de celulosa a partir de una fermentación agitada usando como

sustrato frutos en inicio de descomposición recolectados en mercados de la ciudad de Arequipa-

Perú.
 a) Recolección de materia prima:

Se procederá a la recolección de frutos que sean desechados por los vendedores de frutos en los

mercados.

b) Selección y lavado

Elegiremos los frutos de acuerdo a su grado de descomposición, mientras menor sea este se

procederá a un lavado.

c) Pesado y separación

Separaremos la materia que no sea útil y procederemos al pesado de lo que si nos es útil.

d) Triturado

Licuaremos los frutos, obteniendo un jugo el cual será el sustrato para nuestras bacterias, para tal

añadiremos agua a 70°C para facilitar la operación.

e) Esterilizado

Se llevará el jugo a autoclave a 100°C por 10 min (heurística), para eliminar posibles

microorganismos que contaminen el cultivo.

f) Preparación del medio

Se prepara al medio de acuerdo a las necesidades de la Gluconacetobacter xylinus, como plus

se le añadirá fungicidas para evitar la competencia de levaduras.

g) Fermentación

Se lleva al birreactor donde se combinará con las bacterias, la agitación se dará por un motor de

pecera el cual oxigenará y agitará el cultivo.

 h) Obtención de biopeliculas de celulosa

Se extrae cuidadosamente la celulosa formada, para posteriormente lavada y dejarla secar a

ambiente.

i) Pruebas y análisis

Se realizará pruebas fisicoquímicas a la celulosa obtenida y se calculara el rendimiento por balance

de materia, toda prueba es basada en una norma técnica estandarizada.

1.1.3. BIOREACTOR A REALIZAR

Colonias de Acetobacter xylinum (Gluconacetobacter xylinus) serán inoculadas en 500 mL de medio

de cultivo en un matraz Erlenmeyer de 1 L y se adicionó etanol 1.0% (v/v), las cuales fueron

incubadas a 30°C por 24 h en agitación a 125 rpm. Posteriormente, previo control de pureza,

mediante la observación de las características morfológicas típicas en preparaciones en fresco y

tinciones. Este inóculo activado será transferido al biorreactores cilíndricos de Vidrio de 20 cm de

diámetro y 20 cm de altura, con un volumen final de 2 litros de medio en el biorreactor, con tapa

de plástico y orificios cubiertos con tapones de algodón y gasa estéril a 30°C por 1.5, 3, 7,14, 21 y 28

días bajo condiciones estáticas y de flujo de aire intermitente (se suplirá aire en el área superficial

de los cultivos de forma intermitente y se controlara la suministro de aire dependiendo del tipo de

aireado)
Figura: Diagrama del recipiente de cultivo (biorreactor plástico cilíndrico), 2000 mL de medio de

cultivo, Estático y Estático + Aireación (elaboración propia)

1.2. PRUEBAS
a) Preparacion de microoganismo
Se utilizó la cepa de Gluconoacetobacter xylinus de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC

No. 700178), se propagó en medio YGC (Extracto de levadura, glucosa y carbonato de calcio)

(Tabla 2). Se incubó a 30 °C por 48 h y se mantuvo a 4 °C. Una vez propagado fue observado al
microscopio óptico para verificar la existencia y su morfología haciendo uso de la tinción de Gram.

b) Fermentación
Como segunda etapa se llevó a cabo la producción de BC empleando un biorreactor

(fabricación propia) con capacidad nominal de 3 L y capacidad de trabajo de 2L. El

tiempo del cultivo fue de 144 h durante los cuales se tomaron muestras de 30 mL

cada 24 h para determinar consumo de glucosa, biomasa y pH. Estas muestras

fueron centrifugadas a 8,000 rpm por 10 min a 4 °C. Posteriormente, se filtró el

sobrenadante de cada una de las muestras con el uso de papel Whatman No. 44 y

se guardaron el sobrenadante y el pellet para su posterior tratamiento.

c) Determinación del consumo de glucosa.

La concentración de glucosa se determinará mediante el método de azúcares

reductores con ácido 3,5-dinitrosalicilico (Miller, 1959). Para tal fin, previamente se

realiza una curva estándar de glucosa (XI.1 Anexo). Dicha determinación se lleva a

cabo de la siguiente manera: se adicionaron 0.5 mL de muestra y 0.5 mL del reactivo

de DNS. Los tubos se colocaron en baño de agua a 100° C por 7 min. Después se

colocaron en hielo para enfriarlos y así detener la reacción. Posteriormente se

agregaran 4 mL de agua destilada, se agitara vigorosamente y se determina la

 absorbancia a 575 nm en el espectrofotómetro . Cada muestra se leera por

triplicado.

d) Determinación del crecimiento microbiano.

La biomasa (BM) se separa del medio de cultivo mediante centrifugación a 10,000

rpm y se determina mediante gravimetría, secando la muestra a 105 °C por 24 h.

e) Determinación de la producción de celulosa.

Para la determinación de la BC se purificaron las muestras de biomasa para separar

el biopolímero de la bacteria, posteriormente se cuantifica mediante gravimetría,

secando las muestras a 105 °C por 24 h, respectivamente.

f) Determinación del pH.

Para estudiar el comportamiento del pH, este se mide en cada uno de los

experimentos realizados en el presente proyecto (matraces y reactores) con un

potenciómetro (Hanna Instruments pH 216, Microprocessor pH meter).

g) Purificación de celulosa
El caldo de fermentación será separado de la biomasa y celulosa producida

mediante centrifugación a 10,000 rpm por 15 min a 4°C. Posteriormente se colecta

el precipitado y se somete a un tratamiento con solución de NaOH 0.5 M a 90 °C por

30 min en agitación. Se centrifuga el pellet tratado a 10,000 rpm por 10 min a 4°C.

Este procedimiento se repitió tres veces con el propósito de separar las células

bacterianas de la celulosa. Posteriormente, la celulosa purificada se lava con agua

destilada hasta llegar a pH neutro (7). Después de cada lavado se recupera el pellet

mediante centrifugación a 10,000 rpm por 10 min a 4°C. Finalmente, la celulosa

purificada se seca a 105 °C.