INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS DE

JUGO DE FRUTOS POR CROMATOGRAFÍA
BIDIMENSIONAL EN CAPA FINA.

MÉTODOS DE ANÁLISIS
PROFESOR:
Q.B.P. ROSA MARTHA CABRERA MARTÍNEZ

4IM2
SECCIÓN 2

HERNÁNDEZ SOTO ARTEMISA DALIA

OBJETIVOS

 Determinar las diferencias entre una cromatografía sencilla en capa fina y una
bidimensional en capa fina.
 Conocer la forma en la que se distribuyen las manchas de soluto en una cromatografía
bidimensional.
 Determinar algunos de los aminoácidos que tiene el melón.
 Comparar el grado de resolución o el grado de separación de los componentes de la
mezcla problema entre la cromatografía bidimensional y unidimensional.

FUNDAMENTO DEL MÉTODO

La cromatografía en capa fina se basa en el principio de reparto entre dos fases inmiscibles,
en esta técnica los componentes de una mezcla se reparten de forma diferenciada entre una
fase móvil y otra estacionaria. La fase móvil es líquida y la estacionaria es una placa sólida y
polar. La fase móvil por lo general es menos polar que la estacionaria, de esta forma los
componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares.

La cromatografía bidimensional se fundamenta en realizar un segundo desplazamiento

sobre una hoja cuadrangular en un sentido girado 90° sobre aquel en que se realizó la primera
elución. Esta cromatografía permite que más solutos puedan ser detectados individuamente
como resultado de la expansión del espacio de separación disponible.

DATOS EXPERIMENTALES

a) Determinar los valores de Rf de cada aminoácido en los cromatgramas unidimensionales

y enlistarlos en orden creciente de Rf en la primera fase móvil, como se indica en la tabla
1.

Tabla 1. CROMATOGRAMAS UNIDIMENSIONALES TIPO DESARROLLADOS EN LAS 2

FASES MÓVILES

1a fase móvil 2a fase móvil

AMINOÁCIDO Frente del Frente del Frente del Frente del
Rf Rf
soluto disolvente soluto disolvente
Arginina 2.4 7.7 0.3117 1 7.3 0.1370
Licina 3.7 8 0.4625 0.7 7.4 0.0946
Prolina 5.3 8 0.6625 2.1 7.4 0.2838
Glicina 6 7.9 0.7595 2.2 7.4 0.2973
Treonina 6.7 8 0.8375 2.4 7.5 0.3200
Histidina 6.8 8 0.8500 0.8 7.4 0.1081
Ác. Glutámico 6.8 7.8 0.8718 2.4 7.3 0.3288
Tirosina 7 8 0.8750 4.3 7.4 0.5811
Metionina 7.4 8 0.9250 4 7.4 0.5405
Fenilalanina 7.5 8 0.9375 4.5 7.4 0.6081
b) Determinar los valores de Rf de cada mancha del cromatograma bidimensional tipo y
enlistarlos en orden creciente de Rf en la primera fase móvil, como se indica en la tabla 2,
e identificar, por comparación con los valores de Rf de los cromatogramas
unidimensionales, a que aminoácido corresponde cada mancha.

Tabla 2. CROMATOGRAMA BIDIMENSIONAL TIPO DESARROLLADO EN LAS 2

FASES MÓVILES

1a fase móvil 2a fase móvil

No. De Aminoácido
Frente del Frente del Rf (Orden Frente del Frente del Rf (Orden
mancha correspondiente
soluto disolvente creciente) soluto disolvente creciente)
1 2.4 7.8 0.3077 1 7.5 0.1333 Arginina
2 3.6 7.8 0.4615 0.7 7.4 0.0946 Lisina
3 4.9 7.9 0.6203 1.8 7.3 0.2466 Prolina
4 5.5 7.9 0.6962 1.7 7.3 0.2329 Ác. Glutámico
5 6.2 7.9 0.7848 2.1 7.4 0.2838 Glicina
6 6.2 7.8 0.7949 0.6 7.4 0.0811 Histidina
7 6.3 7.9 0.7975 4 7.4 0.5405 Meteonina
8 6.3 7.8 0.8077 1.1 7.4 0.1486 Treonina
9 6.7 7.9 0.8481 3.7 7.4 0.5000 Tirosina
10 7.3 8 0.9125 4.5 7.4 0.6081 Fenilalanina

c) Determinar los Rf de las manchas del cromatograma bidimensional problema, acomodar

en orden creciente de Rf en la primera fase móvil como se indica en la tabla 3, comparar
los Rf del cromatograma bidimensional tipo e identificar los aminoácidos que contiene la
muestra problema.

1a fase móvil 2a fase móvil

No. De Aminoácido
mancha Frente Frente del Rf (Orden Frente Frente del Rf (Orden correspondiente
del soluto disolvente creciente) del soluto disolvente creciente)
1 3.9 7.7 0.5065 2.6 7.3 0.3562
2 4.2 7.7 0.5455 2 7.3 0.2740 Prolina
3 4.5 7.7 0.5844 3 7.3 0.4110
4 5.3 7.7 0.6883 1.7 7.4 0.2297 Ác. Glutámico
5 6.1 7.7 0.7922 2.2 7.4 0.2973 Histidina
6 6.5 7.7 0.8442 1.6 7.4 0.2162 Treonina
7 6.8 7.7 0.8831 3.4 7.3 0.4658 Tirosina
8 6.9 7.7 0.8961 4.4 7.4 0.5946
9 7.3 7.7 0.9481 4.7 7.4 0.6351 Fenilalanina
PREGUNTAS EXTRA

1. Investigar en la literatura los aminoácidos que contiene el jugo empleado como problema.
Compare sus resultados y concluya.
Áminoacidos en jugo de melón
Triptófano Lisina Fenilalanina Aminoácidos tipo
Treonina Isoleucina Metionina
Cisteína Tirosina Valina
Histidina

Aminoácidos encontrados en el jugo de melón problema

Prolina Treonina
Ác. Glutámico Fenilalanina
Histidina Tirosina

2. Escriba la reacción completa y con nombres, de la Ninhidrina con un aminoácido.

3. ¿Es posible cambiar el orden de las fases móviles? Explique su respuesta.

Sí es posible, siempre y cuando se elimine completamente la primera fase móvil utilizada

antes de utilizar el segundo eluyente.
Esto es debido a que independientemente del eluyente que se use primero, el
fundamento del método va a seguir siendo el mismo.

4. Indique las posibles fuentes de error de esta técnica

La fuente más común es el analista, ya que de él depende el buen uso de la micropipeta
para adicionar los volúmenes establecidos de aminoácidos tipos y muestra problema. De
igual forma la determinación de los Rf está sujeta a errores en la medición del frente del
solvente y los solutos separados.

DISCUSIÓN

En esta práctica se desarrollaron 4 cromatogramas, 2 unidimensionales tipo, uno con eluyente

cloroformo-metanol-amoniaco (2:2:1) y el segundo con butanol-ácido acético-agua (3:1:1); 1
cromatograma bidimensional tipo y otro con la muestra problema.

Los cromatogramas unidimensionales se realizaron con el objetivo de comparar los Rf de los

aminoácidos tipo (obtenidos con los distintos eluyentes) con los Rf de los aminoácidos tipos
del cromatograma dibimensional (obtenidos con los 2 eluyentes anteriormente mencionados).

Así cuando los Rf de la fenilalanina obtenidos en las 2 cromatografías unidimensionales

coincidían con los 2 Rf obtenidos con la cromatogrfía bidimensional, podíamos asegurar que
se trataba del mismo aminoácido.

Nuestro cromatograma problema reveló la presencia de 9 manchas que se podían distinguir

una de otra, siendo estas las correspondientes a 9 clases de aminoácidos. De estos
aminoácidos, 6 de ellos correspondían a los aminoácidos tipo ocupados en la elaboración de
los cromatogramas. Con base en lo anterior podemos argumentar que los 3 aminoácidos
restantes no pudieron ser identificados debido a que no correspondían a ninguno de los
aminoácidos tipo utilizados, o, que la cromatografía bidimensional no tuvo el suficiente grado
de resolución para separar la pequeña mezcla de solutos que se mantuvieron juntos,
quedando así, como una pequeña mancha difusa en el cromatograma.

Por otra parte, según la bibliografía, el melón cuenta con Lisina, Fenilalanina, Treonina,
Metionina, Tirosina, Valina, Cisteína, Triptófano e Isoleucina, de los cuales fueron identificados
los primeros 4; la Prolina encontrada en la muestra problema puede ser producto de la
liberación de aminoácidos debido a la maduración del melón; así mismo, el Ácido Glutámico
es un aminoácido esencial en el proceso de la transaminación, mediante la cual se crean a
partir de éste, nuevos aminoácidos importantes en la fabricación de las proteínas necesarias
en la formación, desarrollo y crecimiento del melón. Este aminoácido es comúnmente
encontrado en plantas y frutos, así como en fertilizantes, razón por la cual es factible que esté
presente en la muestra problema.
 CONCLUSIONES

 La cromatografía bidimensional permite una mayor separación entre los componentes

de una mezcla.
 Las manchas de los solutos en una cromatografía bidimensional no siguen un
comportamiento rectilíneo como la cromatografía unidimensional.
 La maduración de un melón implica la liberación de aminoácidos contenidos en sus
proteínas.
 El grado de resolución de la cromatografía bidimensional es mayor al de la
cromatografía unidimensional.

BIBLIOGRAFÍA

- Demain, A. L. “Microbial Enzymes: Tools for Biotechnological Processes”, Biomolecules, 2014,

4, pp. 117-139.
- María José Noriega Borge. (2000). Principios de Bioquímica. 1ª Edición. Barcelona. Editorial
Masson.
- Scott, Raymond P.W. John Wiley & Sons. (1992). Liquid chromatography column theory, pp 132