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PROGRAMA ACADÉMICO DE
MAESTRÍA EN ENERGÍAS RENOVABLES
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
PRESENTA
Agradezco a mis compañeros y amigos, José Carlos, Jero, Valente, Scarlett, Rocío,
Gera, Ing. Gilberto, Karina y aquellos que hayan estado ahí, por su valiosa ayuda y
compañía cuando los días eran largos y cansados en el laboratorio. Sin ustedes esto
no sería posible.
La tesis la dedico con todo mi amor y cariño a mi familia. A mi hijo al que adoro, mi
motor en la vida para seguir adelante. A mi mamá y a mis hermanos, por su gran
apoyo no solo durante esta etapa sino toda mi vida.
Resumen ................................................................................................................. 1
Glosario ................................................................................................................... 3
ANEXOS
Índice de tablas
1
mg/L, SST(g/L): 0.184, 0. 046, SSV (g/L): 0.13 y 0.034, SDT (g/L): 0.799, 0.745, SVT
(g/L): 0.276, 0.128, ST(g/L) 0.938, 0.791, Coliformes Fecales (NMP/ml) 1,100 y 4.
2
Glosario
3
• Lípidos: son un grupo de compuestos químicamente diversos, solubles en
solventes orgánicos (como cloroformo, metanol o benceno) e insolubles en
agua. La mayoría de los organismos, los utilizan como reservorios de moléculas
fácilmente utilizables para producir energía (aceites y grasas).
4
Capítulo 1 Introducción
A partir de la crisis de 1973, los combustibles fósiles, mismos que se han usado como
principal fuente para la producción de energía, han incrementado sus precios y
reducido sus reservas, además, de provocar efectos ambientales adversos. Entre
estos efectos se encuentran, principalmente, un incremento en la producción de gases
de efecto invernadero (GEI) [1], mismos que derivan en otras problemáticas como son
el calentamiento global y el cambio climático, los cuales ya están teniendo impactos
negativos sobre la biosfera [2]. En México, la combustión de este tipo de energéticos
es responsable de poco más del 61% de las emisiones de CO2 y del 46% de los GEI.
Por otro lado, las reservas de petróleo estimadas para el 2009, incluyendo el petróleo
que podrían obtenerse de depósitos ya descubiertos, aquél que puede ser obtenido
con la tecnología y condiciones económicas actuales, así como del que no pueden ser
recuperado con la tecnología común, es de alrededor de 1,376 billones de barriles, lo
cual corresponde a reservas que durarán cerca de 35 años [3].
5
1.2 Justificación
6
Por otro lado, para el año 2014, en México, se estimaba que el agua residual generada
era de 228.7 m3/s (7.21 miles de hm3/año), de la cual, 211.0 m3/s (6.65 miles de
hm3/año) fue recolectada a través de los sistemas de alcantarillado, y de esta, el
52.8%, es decir 111.3 m3/s (3,51 miles de hm3/año) fue tratada a través de las 2,337
plantas de tratamiento de aguas residuales en operación a lo largo del país, además,
se espera que estas cifras vayan en aumento. Muchos de estas plantas no llegan a
tener tratamientos terciarios, por lo que es posible que contengan aún contaminantes
en concentraciones que podrían llegar a dañar el ambiente [12]. Los nutrientes en el
agua residual, como el amonio, nitratos, fosfatos y materia orgánica pueden contribuir
a la eutrofización de los cuerpos de agua, por lo que el agua residual no puede ser
descargada directamente en los cuerpos de agua naturales antes de algún tratamiento
especializado [13]. Las microalgas son usadas como tratamiento terciario, aunque,
generalmente también crecen de manera adecuada en aguas residuales sin
tratamiento alguno [3].
Así también, las Naciones Unidas reportaron un incremento aproximado del 55% de la
demanda de agua para el año 2050, la cual incluye 800 km3 solo para el uso doméstico.
El mismo reporte indica que en un futuro cercano, mayores esfuerzos podrían ser
dirigidos en lograr tratamientos de agua residual doméstica adecuados y accesibles
económicamente [13].
7
1.3 Antecedentes
8
Por otro lado, la Unión Europea, con una producción de 8,812 millones de litros (ML)
en 2008, es el líder mundial en la industria del biodiesel en la actualidad, y se estima
que lo seguirá siendo durante la década próxima. Alemania, por su parte, encabeza la
lista de países productores (3,203 ML), seguido por EUA (3,182 ML), Francia (2,063
ML) e Italia (676 ML); además, países en desarrollo tales como Malasia, China, Brasil,
Colombia, Argentina e Indonesia, son prometedores en la industria del biodiesel.
Además, se estima un mercado mundial de biodiesel de 168,206 ML para el 2016 [6]
[10].
Los estudios realizados en relación con las microalgas para la producción de biodiesel,
nos proporcionan un panorama mucho más amplio con respecto a sus propiedades y
capacidades, así como los retos a superar para lograr producciones suficientes de esta
clase de biocombustibles.
9
de biodiesel, encontrando una especie en particular, Ankystrodesmus sp., con alto
contenido de lípidos totales con más del 40% con predominancia de triglicéridos [5].
Por otro lado, un consorcio de microalgas extraído de aguas residuales de una granja
lechera en Malasia, fue evaluado para conocer su capacidad de producción de
biodiesel, en donde se encontró que el 72.70% del lípido obtenido de las algas podría
ser convertido en biodiesel [18].
En China, 2015, se realizó una revisión de las microalgas como recursos en el país y
su potencial en la producción de biocombustible líquido y productos de alto valor en
una refinería con un enfoque integrado, con el fin de tener una visión más clara de una
producción económicamente factible con el uso de microalgas [6].
Un estudio en india, realizado en 2017 con el alga Euglena sanguinea, una de las
especies más robustas en el agua dulce con altas productividades de lípidos, fue
explorada tanto a escala laboratorio, así como en masa mediante canales. La
transesterificación se llevó a cabo usando mejillón blanco, el cual es tanto recuperable
como ecológico. Los resultados demuestran que el biodiesel generado tiene un nivel
apropiado para proveer una mejor estabilidad a la oxidación y propiedades de
combustión para su uso en aplicaciones automotrices [19].
10
Finalmente, en el año 2017, un estudio realizado con agua de mar y agua residual
tratada, las cuales se utilizaron y se combinaron para ser usadas como medio de
crecimiento para Nannochloropsis oculata y Tetraselmis suecica bajo las mismas
condiciones de cultivo. Fueron investigados los efectos de estos tipos de agua sobre
la proliferación celular y la cinética de crecimiento. Se encontró que diferentes
concentraciones de agua residual muestran diferentes resultados de crecimiento de
las especies, por lo que, tanto N. oculata como T. suecica pueden tolerar y utilizar las
aguas residuales, esto es debido al efecto de mayores concentraciones de las fuentes
fundamentales en la etapa de crecimiento y cambio de la composición iónica del medio
de cultivo. Además se evaluó el rendimiento de producción de bioetanol de estas dos
cepas. Los resultados mostraron que T. suecica es muy adecuado para la producción
de etanol utilizando aguas residuales municipales como medio de cultivo [20].
Los estudios con microalgas son bastante extensos, sin embargo, aún hacen falta
mayores esfuerzos para lograr que este tipo de sistemas sean viables a mayores
escalas, por lo que es de suma importancia continuar con las investigaciones en este
tema para así lograr mayores eficiencias en su producción y procesamiento.
11
1.4 Objetivos
Objetivo general.
Objetivos específicos
1.5 Hipótesis
biomasa y lípidos con potencial para producir biodiesel, que en conjunto representen
una cantidad viable para su producción en comparación con otros métodos de cultivo.
12
Capítulo 2 Marco Teórico
2.1.1 Biodiesel
13
Figura 2.1. Transesterificación de aceite para biodiesel (R1–3 son grupos de hidrocarburos) [21].
14
Las ventajas del uso de microalgas para la producción de biodiesel, sobre otros tipos
de biomasa, son: su cultivo se puede realizar usando CO2, lo que ayuda a la mitigación
de GEI [21] [24]; el ciclo de cosecha de las microalgas es bastante corto y su tasa de
crecimiento es alta [22], de 1-3 duplicaciones por día, lo cual es al menos de 5 a 10
veces mayor que la tasa de crecimiento de las plantas [24]; las algas son capaces de
usar nutrientes libremente disponibles en aguas residuales, como nitrógeno y fósforo
[24] [26] [3] lo que disminuye los costos de su producción [26]; tienen un rendimiento
de aceite mucho mayor que cualquier cultivo convencional [3] (ver figura 2.2);
sintetizan y acumulan grandes cantidades de lípidos neutrales/ aceites (20-50% con
base en peso seco) [27]; crecen adecuadamente en fotobiorreactores, superando la
productividad de las plantas terrestres en aproximadamente diez veces; pueden ser
cultivadas sobre tierras no productivas, como son los desiertos o las costas [3] [24]
[21], y usando agua de mar, salobre o residual, con lo cual se disminuye la presión
sobre el agua dulce requerida para la producción de alimento [3].
Figura 2.2. Productividad de aceite de las microalgas en comparación con los cultivos convencionales
[3].
15
Por otro lado, los retos a los que se enfrenta este enfoque son: la selección de cepas
con alto contenido lipídico, alta productividad, mejor perfil de lípidos y adaptabilidad al
tipo de agua a usar y a las condiciones ambientales; el establecimiento de estrategias
de cultivo adecuadas, que permitan lograr una alta productividad de lípidos y de
biomasa; el uso de aguas residuales, evitando contaminaciones; la selección del tipo
de reactor más adecuado, o una combinación de ellos, para lograr la máxima
productividad de biomasa al mínimo costo y la disminución de los costos de cosecha,
extracción de lípidos y conversión a biodiesel [28] [3].
Las microalgas sintetizan ácidos grasos para dar lugar a varios tipos de lípidos que
varían dependiendo de la especie, estos son: lípidos polares, lípidos neutrales, ceras,
esteroles, fosfolípidos, glicolípidos, carotenoides, terpenos, tocoferoles y quinonas. De
estos, los lípidos neutrales (triacilglicéridos) son los más indicados para la producción
de biodiesel [3].
Los ácidos grasos que componen a las microalgas, incluyen generalmente, moléculas
lineales de 12 a 22 átomos de carbono en número par, saturadas e insaturadas, donde
la posición y el número de enlaces dobles (1 a 6) es variable, observándose por lo
general una configuración cis. Los ácidos grasos más frecuentes son los de 16C a
18C, sin embargo, en algunas especies predominan moléculas de cadena media (10C,
12C, 14C) o demasiado larga (> 20C). Por lo general, en las microalgas dulceacuícolas
prevalecen los ácidos grasos saturados y mono-insaturados, mientras que los
compuestos poli-insaturados (PUFAs, Polyunsaturated Fatty Acids) constituyen,
ocasionalmente, la mayor fracción de ácidos grasos en especies marinas. Esta
16
variación en el perfil de ácidos grasos entre grupos algales, puede también observarse
bajo distintas condiciones de cultivo [10].
17
oleaginosas se colocan bajo condiciones de estrés impuestas por estímulos
ambientales químicos o físicos, ya sea actuando individualmente o en combinación.
Los principales estímulos químicos son la inanición de nutrientes, la salinidad y el pH
del medio de crecimiento. El mayor estímulo físico es la temperatura ambiente y la
intensidad luminosa. Además de los factores químicos y físicos, la fase de crecimiento
y / o el crecimiento de la cultura afecta el contenido de TAG y la composición de ácidos
grasos [27].
2.1.4.1 Nutrientes
2.1.4.2 Temperatura
2.1.4.3 Luz
19
Las altas intensidades luminosas disminuyen el contenido de lípidos polares, con un
aumento en la cantidad de lípidos neutrales almacenados, en su mayoría triglicéridos,
mientras que intensidades bajas, a su vez, promueven la síntesis de lípidos polares
altamente insaturados, estructural y funcionalmente asociados con las membranas
[10] [27].
2.1.4.5 Otros
El tipo de carbono usado para la fotosíntesis es CO 2, dado que las algas viven con
altas concentraciones de CO2, los gases de efecto invernadero (GHG), el dióxido de
20
nitrógeno (NO2) y los contaminantes en la atmósfera de diversas fuentes serán
nutrientes para las algas. [13]
La microalga debe tener ciertas características, con el fin de que estas generen los
lípidos adecuados, entre las principales se encuentran: rápido crecimiento; gran
contenido de productos de alto valor agregado; capacidad para desarrollarse en
ambientes extremos; células grandes en colonias o filamentos; tolerancia a
condiciones ambientales diversas, a niveles altos de CO2 (15% o más), a
contaminantes, al efecto físico de la agitación o turbulencia y, finalmente, las excretas
de la microalga deben estar libres de autohinibidores [10].
De las cepas de algas oleaginosas, las algas verdes representan el mayor grupo
taxonómico que ha sido identificado. Esto puede ser debido a que están presentes en
diversos hábitats naturales, por lo que pueden aislarse fácilmente, además de que
generalmente crecen más rápido en condiciones de laboratorio que las especies de
otros grupos taxonómicos. Las algas verdes oleaginosas, reportadas en la literatura,
muestran un contenido promedio de lípidos totales de 25.5% (con base en peso seco).
Dicho contenido aumenta considerablemente (al doble o triple) cuando las células se
someten a condiciones de cultivo desfavorables, tales como el estrés foto-oxidativo o
la inanición de nutrientes. En promedio, hay un aumento en los lípidos totales a un
45,7% (con base en peso seco) a partir de algas verdes oleaginosas cultivadas bajo
condiciones de estrés. Por otro lado, las algas verdes en el nivel del género no
presentan diferentes capacidades para sintetizar y acumular lípidos. La capacidad
21
intrínseca de producir grandes cantidades de lípidos y aceites es específica de la
especie o cepa [27].
2.2.2 Cultivo
El contenido de lípidos en las microalgas puede exceder el 80% del peso seco de la
biomasa, aunque los niveles del 20% al 50% son bastante comunes. La productividad
de lípidos, que es la masa del aceite producido por unidad de volumen del caldo de
microalgas por día, depende de la tasa de crecimiento algal y el contenido de la
biomasa [21]. El contenido de lípidos aumenta considerablemente (al doble o triple)
cuando las células son sometidas a condiciones de cultivo desfavorables, tales como
estrés foto-oxidativo o deficiencia de nutrientes [27].
22
De estos, algunos de los, sistemas de cultivo que han sido ampliamente utilizados,
son: los cultivos en suspensión, incluyendo estanques abiertos y reactores cerrados y
cultivos inmovilizados, incluyendo sistemas matrix-inmovilizados y biopelículas. Los
sistemas de cultivo abierto a gran escala más comunes en la práctica, son los
estanques de carrusel o canales (raceway ponds), estos son estanques abiertos y
poco profundos, con ruedas de paletas para proporcionar la circulación de las algas y
nutrientes, son también relativamente baratos de construir y operar, pero a menudo
sufren baja productividad. Los fotobiorreactores tubulares son el único tipo de sistemas
cerrados utilizados en la producción a gran escala de algas [8].
23
La floculación es usada muchas veces como un primer paso en los procesos de
cosecha, con el fin de agregar las células, y de esa forma incrementar su tamaño de
partícula y así, facilitar la subsecuente centrifugación, filtración o sedimentación. Las
células algales están cargadas negativamente, lo cual previene su agregación en
suspensiones celulares, sin embargo la adición de sales minerales, pueden reducir o
eliminar esta carga.
Otro método usado es la filtración, para la cual se usa presión de vacío junto con el
uso de filtros, los cuales son adecuados para recolectar algas grandes (>70m) pero no
para pequeñas microalgas, para las cuales se puede usar membranas de
microfiltración o ultrafiltración, sin embargo, la necesidad de reemplazo constante de
estas membranas y el costo de bombeo lo vuelve un proceso caro. En general, la
centrifugación sigue siendo el método más confiable y preferido y es solo ligeramente
más caro que los métodos alternativos. [26]
24
que impide parcialmente la liberación del lípido de su interior, por lo que los procesos
mecánicos no son usados para extraer los lípidos de las microalgas [29].
Los solventes químicos son el método más comúnmente usado para la extracción.
Esto se debe a su alta selectividad y solubilidad con los lípidos, de esta forma, los
lípidos dentro de la microalga pueden ser extraídos a través de su pared celular
mediante difusión [29]. Los métodos de extracción con disolventes se realizan de la
manera siguiente: los disolventes orgánicos polares, como el etanol, pueden romper
el enlace de hidrógeno entre los lípidos polares; y los disolventes orgánicos no polares
son capaces de romper las interacciones hidrofóbicas entre los lípidos no
polares/neutrales. Es posible usar varios disolventes orgánicos para la extracción de
lípidos, por ejemplo, hexano, etanol, cloroformo o sus mezclas, con lo que puede
extraerse hasta un 98% de lípidos de la biomasa seca [25]. Sin embargo, algunas de
las desventajas de estas técnicas, son los costos y la energía adicionales necesarios
para la recuperación del solvente, así como, la contaminación de la biomasa libre de
lípidos, restringiendo las posibilidades para el posterior aprovechamiento de este co-
producto, además de la alta toxicidad hacia el ser humano y el ambiente circundante
[10].
25
puede ser utilizada directamente como alimento para animales, fertilizantes o como
sustratos para la digestión anaerobia. Sin embargo, la inversión de capital es alta,
además de la alta presión requerida durante el proceso, limitando la aplicación práctica
[25].
26
aspectos favorables siguen existiendo limitaciones económicas, biológicas y logísticas
significativas, las cuales se deben superar si se espera realizar el proceso completo
[16].
27
Tabla 2.1. Biomasa y productividades de lípidos de microalgas crecidas en varios tipos de agua residual
[26].
Productividad
Contenido Productividad
de Biomasa
Tipo de Agua Residual Especie de Microalga de Lípido de Lípido
(DW)
(%DW) (mg/L*día )
(mg/L*día)
Municipal (tratamiento
nd 25 nd Nd
primario)
Chlamydomonas
Municipal (concentrado) 2000 25.25 505
reinhardtii
Municipal (tratamiento
Scenedesmus obliquus 26 31.4 8
secundario)
Municipal (tratamiento
Botryococcus braunii 345.6 17.85 62
secundario)
Mezcla de Chlorella sp.,
Municipal (tratamiento
Micractinium sp., 270.7 9 24.4
primario+CO2)
Actinastrum sp.
Agrícola (estiércol de puerco
B. braunii 700 nd 69
alto en NO3-N)
Agrícola (residuos lácteos
230 mg m-2
con soporte de espuma de Chlorella sp. 2.6 g m-2 día-1 9
día-1
poliestireno)
Agrícola (orina fermentada
Scenedesmus sp. 6 0.9 0.54
de cerdo)
Mezcla de Microspora
willeana, Ulothrix
Agrícola (residuos lácteos zonata, Ulothrix
5.5 g m-2 día-1 nd Nd
de digestión anaerobia) aequalis, Rhizoclonium
hieroglyphicum,
Oedogonium sp.
Agrícola (Efluente de cerdo
máxima tasa de residuos R. hieroglyphicum 10.7g m-2 día-1 0.7 72 mg m-2 día-1
cargados)
Agrícola (Efluente lácteo 210 mg m-2 día-
R. hieroglyphicum 17.9 g m-2 día-1 1.2 1
+CO2)
Agrícola (Residuos de leche
Chlorella sp. 81.4g 13.6i 11i
digestada 20x dilución )
Mezcla de Chlorella sp.,
Agrícola (Agua residual
Micractinium sp., 59 29 17
láctea, dilución 25%)
Actinastrum sp.
Industrial (fábrica de
B.braunii 34 13.2 4.5
alfombras sin tratamiento)
Industrial (fábrica de
Chlorella saccharophila 23 18.1 4.2
alfombras sin tratamiento)
Industrial (fábrica de
Dunaliella tertiolecta 28 15.2 4.3
alfombras sin tratamiento)
Industrial (fábrica de
Pleurochrysis carterae 33 12 4
alfombras sin tratamiento)
Agua residual artificial Scenedesmus sp. 126.54 12.8 16.2
DW= peso seco
28
2.3.1 Eficiencia del crecimiento de microalgas en aguas residuales
La eficiencia del crecimiento algal depende de ciertas variables críticas, como el pH,
la temperatura, la concentración de nutrientes esenciales y la disponibilidad de la luz,
O2 y CO2. Hay algunos aspectos que afectan el crecimiento de la microalga en las
aguas residuales, como son: la alta concentración de nutrientes, en particular, el
nitrógeno en forma de amonio; la presencia de toxinas como el cadmio y el mercurio,
o químicos orgánicos; factores bióticos, como bacterias patógenas o zooplancton
depredador, así como, microorganismos en el agua residual que pueden llegar a
competir con la microalga por nutrientes esenciales. Otro factor crítico es la densidad
inicial del inóculo en el agua residual, puesto que influye en el crecimiento de la
población completa. Estos aspectos, pueden diferir dependiendo del tipo de agua
residual y del sitio donde esté ubicada, así como de las características y habilidades
de la especie de microalga [26].
29
Los nutrientes indispensables para el crecimiento de las algas, presentes en el agua
residual son incorporados por medio de dos procesos vitales en la naturaleza, el ciclo
del nitrógeno y el ciclo del fósforo, sin los cuales ésta no sería capaz de sobrevivir.
El amonio puede ser asimilado e incorporado de vuelta a las biomoléculas por una
variedad de organismos aerobios y anaerobios, o, de manera alternativa, el amonio
puede ser oxidado mediante microorganismos nitrificadores bajo condiciones
aerobias.
El amonio formado durante la fijación del N es incorporado al material celular por una
de dos rutas metabólicas. La mayoría de los organismos fijadores de nitrógeno, como
las plantas y las bacterias, producen glutamato como producto inicial de la asimilación
de 𝑁𝐻4+ , en dicha ruta, el glutamato es formado de la aminación reductiva de α-
oxoglutarato mediante la enzima glutamato deshidrogenasa (GDH):
30
Ecuación 2.1.
𝑁𝐴𝐷(𝑃)𝐻 + 𝑁𝐻4+ + 𝛼 − 𝑜𝑥𝑜𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑟𝑎𝑡𝑜 → 𝑁𝐴𝐷(𝑃)+ + 𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑚𝑎𝑡𝑜 + 𝐻2 𝑂
La GDH tiene solo una moderada afinidad por el 𝑁𝐻4+ , y ya que el 𝑁𝐻4+ generalmente
reprime la actividad de la enzima nitrogenasa, una rápida asimilación es imperativa.
Así, algunas veces es usada una alternativa para una alta afinidad en la ruta de
asimilación que mantiene una baja concentración de 𝑁𝐻4+ . Inicialmente, el 𝑁𝐻4+ es
agregado al glutamato por medio de un ATP con la enzima glutamina sintetasa (GS):
Ecuación 2.2.
𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑚𝑎𝑡𝑜 + 𝑁𝐻4+ + 𝐴𝑇𝑃 → 𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛𝑎 + 𝐴𝐷𝑃
Ecuación 2.3.
𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛𝑎 + 𝛼 − 𝑜𝑥𝑜𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑟𝑎𝑡𝑜 + 𝑁𝐴𝐷𝑃𝐻 → 2 𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑚𝑎𝑡𝑜 + 𝑁𝐴𝐷𝑃
31
Finalmente, durante la desnitrificación, se convierte el 𝑁𝑂3− a N2 removiendo el
nitrógeno fijado del ambiente, proceso que consiste en un número de pasos de
reducción respiratoria:
Ecuación 2.4
𝑁𝑂3− → 𝑁𝑂2− → 𝑁𝑂 → 𝑁2 𝑂 → 𝑁2
32
Los procesos microbianos en gran parte controlan la inmovilización y movilización del
fósforo en ambientes acuáticos. Durante la mineralización de la materia orgánica, los
enlaces orgánicos del fósforo son asimilados parcialmente y liberados parcialmente
como fósforo inorgánico disuelto por la comunidad heterotrófica microbiana. La
cantidad de fósforo liberado y consumido, depende principalmente de la proporción
C:P de los substratos orgánicos.
Ecuación 2.5.
𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 + 𝐴𝑇𝑃 → 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 6 − 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑡𝑜 + 𝐴𝐷𝑃
Los detalles del ciclo del fósforo pueden variar dependiendo de las condiciones locales.
El fósforo es generalmente el principal nutriente limitante en el crecimiento del
fitoplancton en lagos de agua dulce, mientras que el nitrógeno limita la producción en
costas oceánicas y en muchas áreas del océano abierto.
33
Capítulo 3 Metodología
Parámetro Referencia
Standard Methods for the Examination of Water and
Amonio
Wastewater [37].
Nitratos NMX-AA-079-SCFI-2001 [38].
Standard Methods for the Examination of Water and
Fosfatos
Wastewater [37].
pH NMX-AA-008-SCFI-2011 [39].
Conductividad NMX-AA-008-SCFI-2011 [39].
Sólidos Suspendidos
NMX-AA-034-SCFI-2001 [40].
Totales
Sólidos Suspendidos
NMX-AA-034-SCFI-2001 [40].
Volátiles
Sólidos Totales NMX-AA-034-SCFI-2001 [40].
Sólidos Volátiles Totales NMX-AA-034-SCFI-2001 [40].
Sales Disueltas Totales NMX-AA-034-SCFI-2001 [40].
34
La especie fue recientemente descrita por Hegewald (2013), presenta células ovaladas
y alargadas de menos de 10 micras, generalmente de entre 4 y 7 µm con granulaciones
en la pared celular, forman cenobios de 4 a 8 células, las cuales están ligeramente
aplanadas en los sitios donde se unen y casi siempre formados por dos hileras de
células apretadas dispuestas en diferentes planos. Ha sido reportada en Brasil,
Alemania y México [41] [42].
Se realizó, como primera fase, una comparación entre tres medios de cultivos (M1,
M2 y M3), con el fin de evaluar el crecimiento del alga en los mismos (Tabla 3.2) [17].
Medios Características
M1 Descarga de agua residual cruda.
Agua residual tratada en un sistema
M2
de lodos activados convencional.
Agua destilada enriquecida con
M3 nutrientes (fertilizante Bayfoland
forte) a una concentración 1:1000
El agua residual fue filtrada con el fin de eliminar los sólidos presentes en esta, ya que
los nutrientes esenciales para el alga se encuentran disueltos en el agua residual
como nitrógeno y fósforo inorgánico. Al mismo tiempo este proceso facilita el manejo
de las algas y permite una mejor distribución de la luz.
35
exponencial. Para conocer la concentración del inóculo, se realizó un conteo mediante
cámara de Neubauer y se obtuvo una cantidad de 658,333.33 ± 236,290.78 cel/ml. Se
inocularon 6,583,333.33 cel/ml (10 ml) de dichos tubos a matraces Erlenmeyer de 500
ml, con 240 ml de los tres medios de cultivo indicados, estériles y sin esterilizar, cada
uno con tres réplicas, con excepción de M3, que tuvo dos réplicas y fue usado como
blanco. Los tratamientos se agitaron manualmente todos los días para adicionar CO 2
atmosférico y se dejaron crecer durante 10 días (ver figura 3.1).
Figura 3.1. Cultivo de algas en matraces de 500 ml con 250 ml de medio inoculado.
36
aire de 2L/min, permitiendo que se realizara el proceso durante 44 días más, hasta
llegar a la fase estacionaria, ya que en esta etapa se presenta en las microalgas una
mayor acumulación de lípidos [16] [43].
Todos los tratamientos se mantuvieron bajo fotoperiodos de luz- oscuridad 12:12, con
una lámpara de luz fluorescente de 25 watts y 1,650 lúmenes, colocada a 25 cm de
distancia, temperatura de 25°C ± 5 y agitaciones manuales diarias para la adición de
CO2 ambiental en la fase inicial, y, con bombeo de aire durante el segundo y tercer
escalamiento [31].
Para el análisis estadístico se usó una regresión lineal con el modelo sigmoidal de
Gompertz (ANEXO 2) a cada una de las cinéticas de crecimiento durante los
escalamientos, para la evaluación de correlación entre puntos (R2 y Valor de P en tabla
4.3). Mientras que para evaluar las diferencias entre los grupos probados se llevó a
cabo un análisis de varianza (ANOVA).
37
3.4 Coliformes fecales
38
Figura 3.3. Prueba presuntiva de coliformes fecales.
Mediante tablas estadísticas (ver ANEXO 3) se llevó a cabo el cálculo del número más
probable (NMP) de organismos coliformes que puedan estar presentes en la muestra,
a partir de los números de los tubos que dan resultados confirmativos positivos.
39
Contenido de caldo lactosado:
Componentes Cantidad (g) Medio comercial (g)
Triptosa 6 13
Lactosa 2
Cloruro de sodio (NaCl) 2
Fosfato monobásico (NH2PO4) 1.25
Fosfato dibásico de potasio (K2HPO4) 1.25
Lauril sulfato de sodio 0.5
Esta cantidad se diluyó en 1 L de agua, se calentó con agitación constante para que
el medio estuviera completamente mezclado, después de esto se distribuyeron 9 ml
en los tubos de ensayo necesarios para las pruebas, a cada tubo se le colocaron
campanas Durham, y finalmente se esterilizaron en autoclave a 121°C y 15 libras de
presión durante 15 minutos.
Esta cantidad se diluyó en 1 L de agua, se calentó con agitación constante para que
la mezcla se encontrara completamente mezclada, y finalmente se esterilizó en
autoclave a 121°C y 15 libras de presión durante 15 minutos.
Medio EC:
Componentes Cantidad (g) Medio comercial (g)
Triptosa 20.0
Lactosa 5.0
Mezcla de sales biliares 1.5
13
Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4) 1.5
Fosfato dibásico de potasio (K2HPO4) 4.0
Cloruro de sodio (NaCl) 5.0
40
Se diluyó en 1 L de agua hirviendo, se distribuyeron 9 ml en los tubos de ensayo
necesarios para las pruebas y finalmente, a cada tubo se le colocaron campanas
Durham, para después llevar a esterilización en autoclave a una temperatura de 121°C
durante 15 minutos.
Para las pruebas de amonio (fig. 3.4) se usaron 10 ml muestra filtrada, a la cual se
agregó 0.2 ml de reactivo R1, 0.2 ml de reactivo R2 y 0.2 ml de reactivo R3 y se esperó
durante 10 minutos, para finalmente medir la absorbancia a 630 nm.
41
R1: Se disolvieron 2 g de EDTA disódico 2H2O en 70 ml de agua destilada calentando,
para después adicionar 25 g de citrato sódico tribásico.2H2O y 1 g de nitroprusiato
sódico y finalmente completar hasta 100 ml con agua destilada.
La curva de calibración (fig. 3.5) se llevó a cabo usando una disolución madre de 1000
ppm, a la cual se le agregó 4.714 g de amonio sulfato anhidro aforado a 1 L con agua
destilada y se le agregó 0.3 ml de cloroformo. De la disolución madre se realizó la
dilución 1:100, para la disolución estándar intermedia de amonio de 10 ppm, de esta,
se agregaron 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 ml en tubos de reacción y se completaron a 10 ml con
agua destilada, al mismo tiempo que se preparó un blanco con 10 ml de solo agua
destilada. Finalmente se procedió con la adición de los reactivos indicados.
42
Figura 3.5. Curva de calibración de amonio (𝑁𝐻4+ ).
R2=0.9902
43
Figura 3.6. Análisis de la concentración de fosfatos.
La curva de calibración se llevó a cabo usando una disolución madre a 1000 ppm a la
que se le agregaron 4.394 g de potasio fosfato monobásico anhidro KH2PO4 aforado
a 1000 ml con agua destilada, finalmente se le adicionaron 0.3 ml de cloroformo. De
la disolución madre se realizó la dilución 1:100, para hacer la disolución estándar
intermedia de fosfatos de 10 ppm.
Para la curva patrón (fig. 3.7), se tomaron 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 ml de la disolución
estándar intermedia y se agregaron en tubos de ensayo los cuales se completaron a
10 ml con agua destilada. De estos tubos se tomaron 5 ml y se agregaron a tubos de
reacción, al mismo tiempo se preparó un blanco con 5 ml de solo agua destilada y
finalmente se procedió con la adición de los reactivos indicados.
44
Figura 3.7. Curva de calibración de fosfatos ( 𝑃𝑂43− )
R2=0.9973
Para realizar el análisis de nitratos fue necesario filtrar la muestra, con el fin de
remover turbiedad. Se midieron 10 ml de muestra con o sin dilución y se transfirieron
a tubos de ensayo, mismos que se sumergieron en un baño de agua fría, para después
añadirles 2 ml de disolución de cloruro de sodio y mezclarlos. El siguiente paso fue
agregarles 10 ml de disolución de ácido sulfúrico, procediendo a mezclarlos y
45
enfriarlos. En seguida, se agregaron 0.5 ml del reactivo brucina-ácido sulfanílico,
mezclando y enfriando los tubos después. Los tubos se colocaron en un baño de agua
en ebullición durante 20 minutos, al concluir el tiempo estos se sacaron y se
sumergieron en agua fría. Los patrones y muestras se leyeron a 410 nm (ver fig. 3.8).
46
La curva de calibración se realizó a partir de una disolución madre de nitratos de 100
ppm, para la cual se secó aproximadamente 1g de nitrato de potasio a 105°C por 24
h, después se pesaron 0.7218 g, los cuales se diluyeron en agua y se aforaron a 1000
ml. Esta disolución se preservó con 2 ml de cloroformo por no más de 6 meses.
Para la curva patrón (ver fig. 3.9) se midieron 1,0, 2,0, 4,0, 7,0 y 10,0 ml de la
disolución estándar intermedia de nitratos y se llevaron a 10 ml cada uno, usando al
mismo tiempo 10 ml de agua destilada como referencia. Obteniendo disoluciones de
0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.7 y 1 ml de nitratos. Finalmente con los tubos se siguió el
procedimiento explicado anteriormente.
Ecuación 3.3.
47
Modelo de la regresión lineal: 𝑦 = 0.292𝑥 + 0.2196
R2=0.9924
El recuento celular es el más utilizado por ser un método sencillo y poco costoso, el
cual permite además un mejor seguimiento del cultivo mediante su inspección visual
[47].
Debido a esto, la concentración celular se realizó mediante conteo celular por medio
de un hematocitómetro de 0.1 mm de profundidad con reglilla de Neubauer. Al tratarse
de células grandes (mayores de 6 µm), el recuento se llevó a cabo usando los cuatro
cuadros marcados en la figura 3.10 como A, B, C y D, lo cuales tienen 1 mm en cada
uno de sus lados y un volumen correspondiente a 0.1 µL. Finalmente se realizó un
promedio del conteo hecho en los cuatro cuadros.
Para hacer el conteo celular, se agitaron los cultivos en cada uno de los reactores para
permitir una distribución uniforme de las células y se tomaron muestras de 1 ml, las
cuales se colocaron en tubos previamente lavados y secos, agregando una gota de
lugol a cada tubo con el fin de fijar las células. Cada tubo se agitó y se succionó cada
48
muestra con una pipeta Pasteur, para posteriormente llenar la cámara y ver al
microscopio. La cámara se enfocó con el objetivo de 40X, con el fin de facilitar la
identificación de las células y discriminar los residuos y demás partículas con tamaño
similar a la especie algal cultivada (ver figura 3.11 y .
b
a
Figura 3.11. a) Vista al microscopio de la microalga con el objetivo 40X. b) Vista en el microscopio de
barrido electrónico (imagen extraída de [48]).
Con el fin de tener un recuento más preciso, se usaron tres submuestras de cada
muestra y con éstas se calculó la concentración media.
Ecuación 3.4
𝐶 = 𝑁 ∗ 104 ∗ 𝑑𝑖𝑙
En donde:
C= concentración celular (cel/mL).
N= promedio de células presentes en 1mm2 (0.1µL)
dil= factor de dilución
104= factor de conversión de 0.1µL a 1mL
49
Ecuación 3.5
µ = 𝑥 ± 2√𝑥
En donde:
µ= es la media poblacional
x= es el promedio de células contadas en 1 mm2
Ecuación 3.6
𝜇𝑒 = (𝑙𝑛𝑁𝑡 − 𝑙𝑛𝑁0 )/(𝑡2 − 𝑡1 )
Donde:
µ= tasa de crecimiento específica en (días).
ln= es el logaritmo natural.
N0= corresponde a la concentración de la población inicial (cel/ml).
Nt= concentración después del tiempo final de crecimiento (cel/ml).
t1= tiempo inicial para el intervalo de crecimiento de interés en (días).
t2= tiempo final de crecimiento del intervalo en (días).
Ecuación 3.7
𝑘 = 𝜇𝑒 / 𝑙𝑛 2
Ecuación 3.8
tg = ln 2 /µe
50
Para cada réplica se consideraron los días de cultivo, correspondientes a la fase
exponencial de crecimiento de acuerdo con las tasas de crecimiento acumuladas (Σµe)
generadas [50].
51
3.8. Extracción de lípidos totales
El alga cosechada fue secada a 60°C por 24 horas para la extracción del análisis de
lípidos. Los lípidos fueron extraídos en el aparato Soxhlet (ver fig. 3.14) operado a
aproximadamente 80°C por 8 horas, para lo que se añadieron 150 ml de hexano en
matraces bola de 250 ml, la biomasa seca de cada muestra se introdujo en un cartucho
de celulosa cubierto con algodón para protegerla de posibles derrames.
52
Figura 3.15. Destilación de lípidos suspendidos en hexano por medio de Rotavapor.
Ecuación 3.9.
𝑃𝐿
𝐶𝑜𝑛𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜 𝑑𝑒 𝑙í𝑝𝑖𝑑𝑜𝑠 (%) = ( ) 𝑥100
𝑃𝑀
Donde:
PL= peso seco de los lípidos totales
PM= es el peso seco de las microalgas.
53
Figura 3.16. Lípidos extraídos después de la destilación con rotavapor.
54
Capítulo 4 Discusión de Resultados
El agua residual usada provino de una PTAR municipal, que trata el agua por medio
de un proceso de lodos activados convencional. En el agua residual el nitrógeno se
encuentra en su mayoría como NH4+ o NH3, dependiendo del pH, ya que el NH4+ tiene
mayor presencia en el agua a un pH menor de 9, mientras que a un pH de 9 los dos
compuestos se encuentran en equilibrio; para lograr su remoción, es necesario cumplir
con los procesos de amonificación, nitrificación y desnitrificación, los primeros dos
pasos con presencia de oxígeno y el último sin ella [53] [54]. La desnitrificación es
difícil de lograr, ya que generalmente, hay presencia de oxígeno en la zona anóxica
del reactor, debido sobre todo a la recirculación constante del sistema, por lo que al
final del tratamiento de lodos activados hay altas concentraciones de NO− −
3 y NO2 ,
55
Tabla 4.1. Caracterización de los parámetros fisicoquímicos al agua residual cruda y tratada.
𝐏 − 𝐏𝐎𝟑−
𝟒 (mg/L) 5.10 ± 0.31 1.21 ± 0.03
𝐍 − 𝐍𝐎−
𝟑 (mg/L) 0.65 ± 0.04 57.16 ± 2.18
56
Tabla 4.2. Contenido típico de nutrientes en agua residual municipal cruda en mg/L [57].
Rango de valores
Parámetro
en el agua residual
𝐍 − 𝐍𝐇𝟒+ (mg/L) 20-75
𝑵 − 𝐍𝐎− −
𝟑 + 𝐍𝐎𝟐 (mg/L) 0.1-0.5
𝟑−
𝐏 − 𝐏𝐎𝟒 (mg/L) 4-15
SST (mg/L) 250-600
SSV (mg/L) 200-480
pH 7-8
Otros estudios con microalgas usando agua residual como medio de cultivo, muestran
comportamientos similares a los mencionados anteriormente, Komolafe et al [58],
utilizan agua residual de entrada (cruda) y muestran en su caracterización
concentraciones altas de NH4+ , aunque menores a las reportadas en este estudio con
29.12 ± 0.0 mg/L y de PO3−
4 , en este caso mayores a las reportadas, con 35.4 ± 0.1
y 2.50 ± 0.03 para NO3− , se puede observar que las concentraciones de NH4+ y PO3−
4 ,
no tan notorio como el que presenta este estudio, seguramente debido a variaciones
en el tratamiento del agua residual; los valores de pH y SST, se asemejan a los
presentados, con pH de 6.5 ± 0.0 y 6.4 ± 0.0 y SST de 250.00 ± 0.05 y 10.00 ± 0.0
mg/L para el afluente y el efluente respectivamente.
Por otro lado Fernández et al [59], realizaron un estudio con agua residual tratada,
después de un reactor biológico, en donde la concentración de NH4+ fue bastante baja,
con 0.56 ± 0.02 mg/L, coincidiendo con lo reportado en este estudio, al igual que Arias
et al [60], los cuales usaron agua residual tomada al finalizar un tratamiento de lodos
activados, y exponen concentraciones bajas para NH4+ de 0.21 ± 0.84 mg/L y PO3−
4 de
57
2.18 ± 0.87 mg/L, así como mayores cantidades de NO−
3 con 15.94 ± 4.94 mg/L tal
como se esperaría para este tipo de tratamiento, así también los SST y SVT fueron
menores a 30 mg/L, cantidad mucho menor en comparación con el agua usada.
58
Figura 4.1. Duplicaciones acumuladas de Verrucodesmus verrucosus en los diferentes medios de
cultivo durante el primer escalado.
Figura 4.2. Cinéticas de crecimiento del primer escalado en las diferentes calidades de agua
La fig. 4.2 muestra las cinéticas de crecimiento del alga para cada medio de cultivo.
Se puede observar, que al inicio de la fase exponencial, el medio que presentó un
mejor crecimiento fue AF con 1.32 x 105 cel/ml, debido a que este medio se usó como
59
inóculo inical por lo que supone una adaptación previa de la microalga, los siguientes
medios fueron ART-E con 7.17 x 104 ± 3.00 x 103, ART 6.03 x 104 ± 7.47 x 103, los
cuales no tuvieron diferencia significativa entre ellos, ARC-E con 6.00 x 104 ± 1.18 x
104 y finalmente ARC con 4.18 x 104 ± 1.03 x 104 con el menor crecimiento, estos
últimos sin diferencia significativa.
60
Tabla 4.3. Concentraciones celulares (cel/ml) iniciales y finales de las etapas exponenciales en cada
medio. Parámetros poblacionales: tasa de crecimiento específico (µmáx/día); tiempo de duplicación, tg
(días) y divisiones por día, k. Primer escalado de 250 ml.
Tasa de
Medio Concentración Concentración Tiempo de
Valor crecimiento Divisiones
de celular inicial celular final R2 duplicación,
de P específico, por día, k
Cultivo (cel/ml) (cel/ml) tg (días)
µmáx/día
AF5 1.32 x 105 d 5.17 x 105 b 0.98 0.03 0.63a 1.10 0.91
* Media de tres repeticiones. ** Los promedios (± error estándar) dentro de cada columna sin superíndice
común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA).
1
Agua Residual Cruda.
2
Agua Residual Tratada.
3
Agua Residual Cruda Estéril.
4
Agua Residual Tratada Estéril.
5
Agua con Fertilizante.
La tasa de crecimiento máxima fue diferente para la especie en cada medio de cultivo
(tabla 4.3). Los valores más altos se observaron en el medio control con 0.63, en ARC-
E con 0.60 y en ART con 0.58, mientras que ART-E y ARC tuvieron valores más bajos
con 0.52 y 0.39 respectivamente. En un estudio similar Sacristán et al [17], obtiene
tasas de crecimiento menores de entre 0.06 y 0.14 para Scenedesmus acutus en agua
residual cruda y tratada, sin embargo, el medio control obtuvo una mayor tasa de
crecimiento, seguido por el agua residual tratada y finalmente el agua residual cruda,
61
comportamiento parecido al encontrado en este estudio. Otro estudio con
Scenedesmus obliquus en agua residual cruda pretratada sin filtrar, mostró una tasa
de crecimiento de 0.28, menor a la mostrada por ARC [51]. Por otro lado, en pruebas
hechas con agua residual tratada usando Scenedesmus sp., la tasa de crecimiento
máxima de dos estudios fueron de 1.65, en agua esterilizada con autoclave [62] y de
1.39, en agua filtrada y esterilizada con luz UV [63], siendo estos datos mayores a los
arrojados por ART y ART-E, cabe mencionar que en dichos reportes, extendieron el
crecimiento de la cepa hasta su fase estacionaria, por lo que las altas tasas de
crecimiento podrían ser debido a esa diferencia de tiempos de cultivo con respecto a
este estudio.
Para el análisis estadístico se usó una regresión lineal con el modelo sigmoidal de
Gompertz, para la evaluación de correlación entre puntos (R2 y Valor de P en tabla
4.3). Mientras que para evaluar las diferencias entre los grupos probados se llevó a
cabo un análisis de varianza (ANOVA).
Para seleccionar los medios para los siguientes escalados, se tomaron en cuenta las
tasas de crecimiento específico, los tiempos de duplicación y las divisiones diarias, así
como la cantidad de nutrientes esenciales para el crecimiento del alga presentes en el
medio, siendo el tratamiento más adecuado ARC-E.
62
Figura 4.3. Duplicaciones acumuladas de Verrucodesmus verrucosus en los diferentes medios de
cultivo durante el segundo escalado.
Si comparamos las cinéticas de crecimiento de la figura 4.4 del primer escalado con el
segundo, se pueden observar menores variaciones en el crecimiento, así como
concentraciones celulares mayores, lo que podría ser debido a la adición de CO2
atmosférico durante esta etapa, ya que se ha demostrado que esta puede aumentar la
productividad algal a más del doble debido a un aumento en la actividad fotosintética
[64] [65] [66].
63
Figura 4.4. Cinéticas de crecimiento del segundo escalado en las diferentes calidades de agua
64
Tabla 4.4. Concentraciones celulares (cel/ml) iniciales y finales de las etapas exponenciales en cada
medio. Parámetros poblacionales: tasa de crecimiento específico (µmáx/día); tiempo de duplicación, tg
(días) y divisiones por día, k. Segundo escalado de 1 L.
Tasa de
Medio Concentración Concentración Tiempo de
Valor crecimiento Divisiones
de celular inicial celular final R2 duplicación,
de P específico, por día, k
Cultivo (cel/ml) (cel/ml) tg (días)
µmáx/día
AF2 1.83 x 105 a 1.54 x 106 a 0.99 0.00 0.92 a 1.46 0.68
* Media de tres repeticiones. ** Los promedios (± error estándar) dentro de cada columna sin superíndice
común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA).
1
Agua Residual Cruda Estéril.
2
Agua con Fertilizante.
Las tasas de crecimiento (tabla 4.4) de la especie fueron similares a las presentadas
por Martínez [67], el cual reporta tasas de crecimiento diarias de entre 0.45 y 1.05 para
Scenedesmus obliquus cultivada en agua residual cruda. Mientras que Ruíz [45]
obtuvo una mayor concentración celular para Scenedesmus obliquus, con 5.8 x 106
cel/ml en agua residual urbana, pero una menor tasa de crecimiento diario, con 0.15.
ARC-E no logra una buena correlación con el modelo asignado, esto puede ser debido
a que los diez días no son suficientes para lograr terminar la fase logarítmica del
tratamiento y empezar con la estacionaria, momentos necesarios para lograr el ajuste.
Las duplicaciones acumuladas (fig. 4.5) para ambos medios muestran el inicio de la
etapa exponencial a partir del día dos, al igual que en los escalamientos anteriores. La
tasa de crecimiento diaria fue mayor para AF que para ARC (tabla 4.5), por lo que la
65
fase exponencial termina para AF el día 28, mientras que para ARC-E el día 34,
aunque las concentraciones celulares finales no tienen diferencias significativas, por
lo que la diferencia de tiempos podría deberse a los obstáculos que encuentra el alga
para lograr un crecimiento adecuado en el agua residual, provocando un retraso en su
crecimiento.
Los puntos iniciales y finales de la cinética de crecimiento (fig. 4.6) en los dos medios
no tuvieron diferencia significativa, lo que indica que a pesar de que AF crece de
manera más acelerada y la concentración es ligeramente superior, ARC-E podría ser
usada en la producción de biomasa algal ya que genera altas concentraciones de la
misma en un tiempo no muy diferente al del medio control, con una diferencia de 6
días antes de llegar a la fase estacionaria.
66
Figura 4.6. Cinéticas de crecimiento del tercer escalado en las diferentes calidades de agua
Tabla 4.5. Concentraciones celulares (cel/ml) iniciales y finales de las etapas exponenciales en cada
medio. Parámetros poblacionales: (µmáx/día); tiempo de duplicación, tg (días) y divisiones por día, k.
Tercer escalado de 18 L.
Tasa de
Medio Concentración Concentración Tiempo de
Valor crecimiento Divisiones
de celular inicial celular final R2 duplicación,
de P específico, por día, k
Cultivo (cel/ml) (cel/ml) tg (días)
µmáx/día
AF2 1.33 x 105 a 1.57 x 106 a 0.99 0.00 0.41 a 1.71 0.58
* Media de tres repeticiones. ** Los promedios (± error estándar) dentro de cada columna sin superíndice
común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA).
1
Agua Residual Cruda Estéril.
2
Agua con Fertilizante.
67
Xiong et al [68], realizó estudios con Scenedesmus obliquus expuesta a 0, 1, 20, 50 y
100 mg/L de Levofloxacingo para evaluar su ecotoxicidad en agua residual salina
sintética esterilizada y obtiene tasas de crecimiento específico diario de entre 0.64 a
0.22, las cuales son cercanas a las obtenidas en este estudio. De la misma forma,
Song et al [69], hizo pruebas con agua residual artificial con el género Scenedesmus,
con diferentes concentraciones de fósforo y amonio, para conocer el efecto de estos
nutrientes en las algas, obteniendo tasas de crecimiento de entre 0.28 a 0.42, mientras
que en el medio control de 0.27. Labbé et al [70], también realizó un estudio, en donde
utilizó cultivos mezclados de Scenedesmus en agua residual de una granja lechera y
obtuvo un crecimiento celular máximo de 5.6 x 10 7 cel/ml, así como una tasa de
crecimiento máxima por día de entre 0.156 ± 0.002 y 0.239 ± 0.026. Wu et al [71],
realiza una investigación con Scenedesmus obliquus, usando diferentes
concentraciones de nitratos (de 0.3, 0.6, 0.9, 1.5 g/L) en medio BG11, obteniendo una
tasa máxima de crecimiento diario de 0.54, con una concentración de 0.9 g/L de
nitratos. Y, finalmente, en un estudio realizado por Arenas [48], con Verrucodesmus
verrucosus en agua residual cruda, presenta crecimientos máximos para la fase
estacionaria de 3 x 106 cel/ml, con una tasa de crecimiento de 0.08, mientras que el
medio control con Bayfoland forte, obtuvo un crecimiento de 9 x 106 cel/ml y una tasa
de crecimiento de 0.23. Se puede observar que los valores en general, tienen ligeras
variaciones, sin embargo, no se alejan mucho del rango de 0.23 a 0.41 obtenido para
Verrucodesmus verrucosus en este estudio (tabla 4.5), sin embargo, los valores
cambian dependiendo del tipo y estado del alga, así como las condiciones a las que
se sometan los tratamientos.
68
biomasa la acumulación es poca. Con el fin de conocer el rendimiento de biomasa
algal, se realizó una relación entre el peso del alga y volumen del medio, obteniéndose
para AF, un rendimiento, de 600.00 mg/L de biomasa, mientras que para ARC-E,
383.33* ± 23.57 mg/L (tabla 4.6).
69
4.4 Remoción de nutrientes y coliformes fecales
Tabla 4.7. Caracterización de los diferentes medios de cultivo. Amonio (𝑁𝐻4+ ), Fosfatos (𝑃𝑂43− ) y
Coliformes Fecales (NMP/ml).
𝐍𝐇𝟒+ (ppm) 57.49 ± 1.26 a 0.10 ± 0.01 b 51.00 ± 7.96 ac 0.07 ± 0.02 b 40.80 c
𝐏𝐎𝟑−
𝟒 (ppm) 5.10 ± 0.31 a 1.21 ± 0.03 b 1.36 ± 0.11 b 0.93 ± 0.01 c 27.28 d
Coliformes
Fecales 16.66 ± 2.88 a 3.66 ± 0.57 b 0 0 0
(NMP/ml)
* Media de tres repeticiones. ** Los promedios (± error estándar) dentro de cada columna sin superíndice
común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA).
1
Agua Residual Cruda.
2
Agua Residual Tratada.
3
Agua Residual Cruda Estéril.
4
Agua Residual Tratada Estéril.
5
Agua con Fertilizante.
En la tabla 4.7 se puede observar altas concentraciones de amonio para ARC y ARC-
E, así como para el medio control, aunque este fue ligeramente menor al de los dos
anteriores, ART y ART-E tuvieron las menores concentraciones. Para los fosfatos, la
máxima concentración se obtuvo para AF, seguido de ARC y ARC-E, y finalmente,
ART y ART-E. Se puede observar que después del proceso de esterilizado hay una
ligera disminución de las concentraciones tanto de amonio, como de fosfatos,
70
habiendo diferencia significativa entre los fosfatos de los mismos medios, estériles y
sin esterilizar, mientras que la reducción de amonio en los medios no provocó
diferencias significativas.
Los coliformes fecales (tabla 4.8) tuvieron una gran disminución en su concentración
en comparación con la caracterización inicial, posiblemente debido al proceso de
filtrado, ya que se elimina gran parte de la materia orgánica, y estos se alojan en los
sedimentos [74]. La mayor remoción se obtuvo para ARC, con un 42% y la menor para
ART, con un 18.18%. Otros estudios reportan porcentajes de remoción superiores [45]
[58], lo que puede deberse al tiempo de cultivo y a las bajas concentraciones de estos
microorganismos en el medio usado para los tratamientos, debido al proceso de filtrado
realizado.
71
Tabla 4.8. Concentración inicial de Amonio (𝑁𝐻4+ ), Fosfatos (𝑃𝑂43− ) y Coliformes Fecales (NMP/ml) para
los diferentes medios de cultivo durante el primer escalamiento.
La máxima remoción de amonio (tabla 4.9) se obtuvo para ART-E con 83.36%, seguido
de ART con 83.07%, ARC-E tuvo una menor remoción con 40.19%, mientras que ARC
logró 24.99%, y finalmente, AF tuvo 0.52%. Las mayores remociones para ART-E y
ART podrían deberse a la baja concentración inicial de amonio en estos medios, por
lo que su consumo fue bastante rápido. ARC-E y ARC tuvieron bajas remociones de
nitrógeno, sin embargo, podría deberse al tiempo que se le permitió crecer en el agua
residual, ya que la cinética no alcanzó a llegar a la fase estacionaria. AF por otro lado,
tuvo una remoción de amonio prácticamente nula, sin embargo, el medio comercial
bayfoland, cuenta con otros nutrientes, como nitritos y nitratos, que también pudieron
ser usados por el alga.
72
Tabla 4.9. Concentración final de Amonio (𝑁𝐻4+ ), Fosfatos (𝑃𝑂43− ) y Coliformes Fecales (NMP/ml) para
los diferentes medios de cultivo durante el primer escalamiento.
𝐍𝐇𝟒+ (ppm) 44.46* ± 0.42** a 1.27 ± 0.06 b 32.92 ± 1.70 c 1.19 ± 0.11 b 44.25 a
𝐏𝐎𝟑−
𝟒 (ppm) 1.63 ± 0.08 a 0.27 ± 0.02 b 1.78 ± 0.17 a 0.83 ± 0.20 c 23.99 d
Coliformes
9.66 ± 1.15 a 3.00 ± 0.00 b 0 0 0
Fecales (NMP/ml)
* Media de tres repeticiones. ** Los promedios (± error estándar) dentro de cada columna sin superíndice
común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA).
1
Agua Residual Cruda.
2
Agua Residual Tratada.
3
Agua Residual Cruda Estéril.
4
Agua Residual Tratada Estéril.
5
Agua con Fertilizante.
En el caso de los fosfatos (tabla 4.9), las máximas remociones se lograron para ART
con 94.18% y ARC con 81.41%. ART-E obtuvo 79.46%, mientras que ARC-E 65.23%,
finalmente, AF obtuvo la menor remoción con 22.36%. En general los fosfatos en el
agua tuvieron buenas remociones, con excepción de medio control, debido a las altas
concentraciones de este compuesto en el medio, a diferencia de los demás que tenían
concentraciones menores.
En el tiempo cero del segundo escalado (tabla 4.10) se puede observar altas
concentraciones de amonio para ambos medio y de fosfatos para el medio control, lo
que podría ser debido a las altas concentraciones que aún contenían los medios en el
primer escalado, ya que este se agregó en el momento de la inoculación.
73
Tabla 4.10. Concentración inicial de Amonio (𝑁𝐻4+ ) y Fosfatos (𝑃𝑂43− ) para los medios de cultivo durante
el segundo escalamiento.
56.09* ±
𝐍𝐇𝟒+ (ppm) 99.27 b
0.53** a
5.28 ±
𝐏𝐎𝟑−
𝟒 (ppm) 79.06 b
0.22 a
* Media de dos repeticiones. ** Los promedios (± error estándar) dentro de cada columna sin superíndice
común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA).
1
Agua Residual Cruda Estéril.
2
Agua con Fertilizante.
Los porcentajes de remoción de amonio (tabla 4.11), fueron para ARC-E de 66.73%,
mientras que para AF de 58.60%. Los fosfatos alcanzaron remociones de 78.22% para
ARC-E y de 64.44% para AF. Se puede observar que las remociones son casi el doble
de las logradas durante el primer escalamiento en el mismo tiempo, lo que podría
deberse al sistema de aireación implementado durante esta etapa, ya que el CO 2
ayuda a regular el pH en el medio, el cual tiene efectos sobre la toxicidad del amoniaco
y en la disponibilidad del fósforo [75].
Tabla 4.11. Concentración final de Amonio (𝑁𝐻4+ ) y Fosfatos (𝑃𝑂43− ) para los medios de cultivo durante
el segundo escalamiento.
18.66* ±
𝐍𝐇𝟒+ (ppm) 41.10 a
4.29** a
1.15 ±
𝐏𝐎𝟑−
𝟒 (ppm) 28.11 b
0.22 a
* Media de dos repeticiones. ** Los promedios (± error estándar) dentro de cada columna sin superíndice
común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA).
1
Agua Residual Cruda Estéril.
2
Agua con Fertilizante.
Las concentraciones iniciales para el tercer escalamiento (figura 4.7) fueron mucho
menores, puesto que la dilución de inóculo en el medio fue mucho mayor, además de
74
que hubo mayores remociones de nutrientes en el escalado anterior. Para AF se puede
observar una disminución inicial hasta el día ocho, a partir del cual, se observa un
aumento en la cantidad de amonio hasta el día 28, en donde vuelve a haber una
disminución. En ARC-E la disminución es más constante con excepción de un pequeño
pico el día 16.
Figura 4.7. Remoción de amonio 𝑁𝐻4+ de los medio de cultivo durante el tercer escalado. Superíndice
común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA).
75
a 35°C, en ambas investigaciones se pueden observar porcentajes de remoción
menores a los reportados por esta investigación. Otros estudios reportan mayores
porcentajes, como el de Lekshmi et al [77], en donde utilizan la especie Scenedesmus
abundans, cultivada en agua residual colectada de un tanque de aireación de una
planta de tratamiento de aguas residuales y reportan un porcentaje de remoción
máximo de 98.68%. Arenas [48], en un estudio con agua residual cruda, obtuvo una
remoción máxima de amonio en agua residual cruda, con V. verrucosus de 99% y en
el medio control, de 64%.
Para el fosfato en AF (figura 4.8), se observó un incremento el día 28, a partir del cual
las concentraciones comenzaron a bajar, mientras que en ARC-E su concentración
disminuyó casi en su totalidad, a partir del día 4, lo que pudo deberse no solo al
consumo del alga, puesto que se trataba de una etapa temprana de crecimiento, sino
también a la adsorción del compuesto en las celulas y en las paredes del reactor [67].
ab
Figura 4.8. Remoción de fosfatos (𝑃𝑂43− ) de los medio de cultivo durante el tercer escalado.
Superíndice común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA).
76
concentraciones iniciales fueron mucho mayores en comparación con ARC-E, por lo
que no fue posible consumir la mayoría del fosfato presente. En tiempos diferentes, a
lo largo de los tratamientos, hay aparentes aumentos en la concentración de fosfatos,
fenómeno probablemente relacionado con la ruptura de las células en el medio,
derramando su contenido de fosforo [67] [78].
Tabla 4.12. Concentración inicial y final de (𝑁𝑂3− ) y porcentaje de remoción de los medios de cultivo
durante el tercer escalamiento.
Concentración inicial de Concentración final de
Medios Remoción (%)
nitratos (𝑵𝑶𝟑− ) en mg/L nitratos (𝑵𝑶𝟑− ) en mg/L
AF2 85.74 a 13.83 a 83.86
ARC-E1 14.09 ± 0.19 b 0.17 ± 0.01b 98.73
* Media de dos repeticiones. ** Los promedios (± error estándar) dentro de cada columna sin superíndice
común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA).
1
Agua Residual Cruda Estéril.
2
Agua con Fertilizante.
77
Las remociones de nitratos fueron bastante altas, con un 98.73% para el agua residual
(ARC-E) y un 83.86% para el medio control (AF), lo que indica problemas de
disponibilidad del amonio, ya que se ha demostrado que las algas tienen una mayor
afinidad por este compuesto [79], sin embargo, este es bastante inestable en el medio,
de acuerdo a la siguiente ecuación [67]:
Ecuación 4.1
𝑁𝐻4+ + 𝑂𝐻 − ⇋ 𝑁𝐻3 + 𝐻2 𝑂
Ecuación 4.2
𝐻𝐶𝑂3− ⇆ 𝐶𝑂2 + 𝑂𝐻 −
Por otro lado, la utilización metabólica de los iones NH4+ disminuye el pH, de acuerdo
con la siguiente ecuación [80]:
78
Ecuación 4.3
NH4+ ⇋ NH3 + H + ⇋ org − N + H +
Figura 4.9. Comportamiento del pH durante el primer escalamiento de 250 ml durante 10 días.
Superíndice común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA).
En la figura 4.9 se puede observar que ART tuvo un aumento constante del pH, hasta
alcanzar un valor máximo de 9, este tratamiento tuvo altas concentraciones de
Verrucodesmus verrucosus en el agua, por lo que el pH elevado puede atribuirse a la
actividad del alga en el medio. ART-E y ARC-E se mantuvieron más o menos
constantes el día 0 y el día 4, con un incremento a partir de ese momento hasta llegar
a un pH aproximado al 9, lo que puede ser debido a la actividad fotosintética en el
agua, la cual fue poca en los primeros días y comenzó a elevarse al mismo tiempo que
el crecimiento de las algas era más notorio. ARC, aumentó su pH de manera constante
hasta alcanzar las 8.9 unidades, sin embargo, este tratamiento tuvo el menor
79
crecimiento algal, por lo que se puede concluir que en el medio seguramente existían
otros microorganismos fotosintéticos que compitieron con la especie utilizada.
Finalmente AF tuvo un aumento poco acelerado del pH hasta el día 8, a partir del cual
éste incrementó, lo que se le atribuye de la misma forma, a la poca actividad del alga
los primeros días y un aumento en la fase final. Cabe mencionar que el pH se mantuvo
dentro del rango indicado para el crecimiento de las algas, lo que indica que las
agitaciones manuales realizadas diariamente para la adición del CO 2 en esta etapa
fueron suficientes para lograr un correcto desarrollo de la especie en los medios.
80
al formar ácido carbónico. El día 4 el pH aumentó, puesto que hubo un mayor
crecimiento del alga, disminuyendo los días 6 y 8, posiblemente debido al consumo de
amonio del medio, y aumentando finalmente el día diez. Al finalizar el tratamiento estos
alcanzaron valores de 9.1 para ARC-E, y de 8.95 para AF. Se puede observar que el
pH estuvo fuera del rango de 7-9, para el medio control con 6.8 unidades el día 2,
mientras que ARC-E con 9.1 unidades el día 10, sin embargo, esto no influyó en el
crecimiento de las algas, pues se pudo observar una mayor concentración celular en
comparación con el primer escalado, ya que la adición de CO2 ayuda en el crecimiento
autótrofo del alga.
a a
En la figura 4.11 se observa una disminución del pH los primeros ocho días de
tratamiento, posiblemente, al igual que en el escalamiento dos, debido al sistema de
bombeo de CO2 atmosférico el cual aumenta la acidez del medio formando ácido
carbónico y a la baja concentración celular de las algas, lo que provoca una baja
81
actividad fotosintética; en los siguientes días el pH se eleva y se observa un pico de
disminución entre el día 20 y 32 para AF y 24 y 32 para ARC-E, los cual podría ser
debido al consumo de amonio del medio. El pH durante el tercer escalamiento se
mantuvo dentro del rango de 7-9, lo cual indica que el sistema de bombeo en este
escalado fue adecuado para equilibrar el medio básico provocado por la actividad
fotosintética del alga, con la acidez generada por el dióxido de carbono.
82
Tabla 4.13. Rendimiento máximo de lípidos en % y en mg/L, en los tratamientos con ARC-E y AF.
Rendimiento
Medio de Rendimiento de
Algas secas (g) Lípidos (g) de lípidos
Cultivo lípidos (%)
(mg/L)
AF2 2.00 0.08 3.95 a 23.70 a
ARC-E1 2.00 0.05 2.43* ± 0.16** a 9.31 b
* Media de dos repeticiones. ** Los promedios (± error estándar) dentro de cada columna sin superíndice
común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA).
1
Agua Residual Cruda Estéril.
2
Agua con Fertilizante.
Figura 4.12. Gráfica comparativa de la concentración inicial de amonio (𝑁𝐻4+ ) y la concentración final
de lípidos.
84
concentración cuando el nitrógeno (principalmente), se encuentra en menores
cantidades. Este principio se usa para inducir altas concentraciones de lípidos.
85
Capítulo 5 Conclusiones
El agua residual cruda, tuvo altas concentraciones de amonio y fosfatos, mientras que
el agua residual tratada presentó altas concentraciones de nitratos. Los tres nutrientes
esenciales para el alga. Sin embargo, el agua residual cruda, presentó altas
concentraciones de microorganismos que compiten con el alga y retrasan su
crecimiento, por lo que se observó un mayor crecimiento en el agua residual estéril,
ARC-E, con una concentración celular máxima de 5.67 x 105 ± 1.35 x 105 cel/ml, por
otro lado en el agua residual tratada se observó un comportamiento contrario, el medio
sin esterilizar, ART, tuvo un mejor crecimiento que el agua tratada estéril, ART-E, con
1.26 x 106 ± 1.08 x 105 cel/ml, lo que se le atribuyó posiblemente a algún tipo de relación
simbiótica del alga con cierta bacteria. Los siguientes escalados se realizaron con
ARC-E y AF, en donde se observó un crecimiento máximo sin diferencia significativa,
con 1.57 x 106 cel/ ml para AF y 1.28 x 106 ± 2.36 x 105 cel/ml para ARC-E lo que indica
que es posible la producción de microalgas en agua residual, obteniendo resultados
favorecedores.
La remoción final de nutrientes de los medios fue bastante buena si se compara con
otras investigaciones, habiendo variaciones en los porcentajes, debido a diversos
factores que influyen en las algas. El medio control tuvo una mayor remoción de
amonio en el agua residual, con un 80.35%, mientras que ARC-E obtuvo una remoción
de 78.91%, no observándose diferencia significativa entre ellos. ARC-E, por otro lado,
consumió la mayor cantidad de fosfatos, con un 83.44%, aunque es posible que parte
de estos hayan sido adsorbidos en las células o en las paredes del reactor.
Verrucodesmus verrucosus fue capaz de consumir amonio y fosfatos del agua
residual, considerándose así, una especie con una buena capacidad de adaptación y
tolerancia a ambientes adversos o poco favorables.
El desarrollo del alga, así como las condiciones del medio, tuvieron gran influencia
sobre el pH, el cual tuvo diversas variaciones a lo largo del proceso, observándose
generalmente disminuciones a principio de los tratamientos con bombeo de aire, lo que
86
se le atribuyó a la adición de CO2, acidificando el medio, además de observarse
pequeños picos de disminución de pH en etapas avanzadas del desarrollo del alga,
posiblemente debido a la metabolización del amonio del medio.
87
Capítulo 6 Recomendaciones
Medir nitratos antes y después de los escalados con agua residual tratada, ya que es
el nutriente que se encuentra en mayores concentraciones en este medio.
88
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96
ANEXOS
ANEXO 1
Tabla. Índice de NMP y límite de confianza del 95% para varias combinaciones de
resultados positivos para una serie de 3 tubos cada uno con 0,1, 0,01 y 0,001 g ó mL
de muestra.
0-0-0 <3 - -
0-0-1 3 <0.5 9
0-1-0 3 <0.5 13
1-0-0 4 <0.5 20
1-0-1 7 1 21
1-1-0 7 1 23
1-1-1 11 3 36
1-2-0 11 3 36
2-0-0 9 1 36
2-0-1 14 3 37
2-1-0 15 3 44
2-1-1 20 7 89
2-2-0 21 4 47
2-2-1 28 10 150
3-0-0 23 4 120
3-0-1 39 7 130
3-0-2 64 15 380
3-1-0 43 7 210
3-1-1 75 14 230
3-1-2 120 30 380
3-2-0 93 15 380
3-2-1 150 30 440
3-2-2 210 35 470
3-3-0 240 36 1300
3-3-1 460 71 2400
3-3-2 1100 150 4800
3-3-3 ≥2400 - -