Ce] a rr —_ Analisis de ADN y genética forense Pablo Noseda, David Gangitano, Guillermo Juvenal Lab. Huellas Digitales Genéticas, Dpto. Salud Integral, SENAF Pablo Noseda Lab. Huellas Digitales Genéticas, Dpto. Salud Integral- SENAF pnoseda@senal.gob.ar David Gangitano Forensic Sciences Program Co- lege of Criminal Justice, Sam Houston State University, USA dag006@shsu.edu Guillermo Juvenal Divisién Bioquimica Nuclear, ‘Comisién Nacional de Energia Atomica juvenal@cnea.govar Introduccion ‘Sibien el establecimiento de vin- culos biologicos data de princi- pios del siglo 20 a través del es- tudio de los sistemas de grupos sanguineos (ABO, Rh, etc.) y la idea de obtener niveles de discrimi- nacién © certeza indiscutibles era impensada hasta hace 25 afios, Con el descubrimiento de regiones polimérficas _(varia- siones en la secuencia), en el ADN y su posterior utilizacion en. la identificacién de personas a mediados de los 808, la genética tomé un rol protagénico dentro: de las ciencias forenses. La ven- taja de estudiar el ADN radica no: s6lo en su estabilidad sino tam- bién en que el ADN es idéntico tanto si se analiza en sangre, hhueso, semen, etc. Por otra parte se necesitan cantidades fimas y el analisis del ADN per- mite una inclusion superior al 99, 99%. Para entender los principios de la metodologia usada en la ac- 61 (1-3) 2011 tualidad se har una breve descripcién de! genoma humano. Genoma Humano El genoma humano esta local- izado en la mitocondria y en el nucleo celular. El ADN es un polimero formado por dos cade- nas antiparalelas constituidas por nucleétides, Unidos en forma covalente a través de uniones fosfodiester, descripta por primera vez por James Watson y Francis Crick en 1953. Cada nu- cleétido contiene: un aziear (desoxitibosa), un grupo fostato y una base nitrogenada. Estas son: adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T).. Las dos eadenas estén estabilizadas por la formacién de puentes de hidrégeno entre las bases com- plementarias de cada cadena (A con T, C con G), manteniendo juntas las dos cadenas. Esto im-plica que si en una cadena en- contramos la_—_secuencia 5°... CGTTGTAAGCC...3° en la ota debemos —_ encontrar 3°...GCAACATTCGG...5’ Acada apearamiento (A-T, G-C), lo llamamos par de bases. ADN nuclear EIADN nuclear es lineal y se en- cuentra organizado en estruc- turas llamadas cromosomas. 'Una célula diploide de un ser hu- mano cantiene 23 pares de cro- mosomas: 22 pares de ‘autosomas y un par de cromoso- mas sexuales (X:X 0 X:Y). Cada uno de estos cromosomas de un par proviene, uno del padre y otro de la madre. A cada par lo llamamos cromosomas homélo- gos. Los 23 cromosomas con- tienen en total 3 mil millones de pares aproximadamente. Una pequefia proporcién eorre- sponde a genes. En la actuali- dad luego del secuenciamiento (la lectura de las bases), del genoma humana se calcula que el numero de genes es de alrededor de 30.000 genes. El ADN es estable, sin embargo ocasionalmente ocurren muta- ciones pudiendo traer conse- cuencias severas si en esas secuencias por ejemplo reside la informacion para una proteina. La mayoria de los genes deter- minan cuales son y en que orden estarn dispuestos los aminoaci- dos de una determinada pro- teina. Aeste ADN lo conocemos ‘como ADN codificante. Sin em- bargo, la mayor parte del ADN nuclear es no codificante. Parte del ADN no codificante esta cons- ADN y Genética tituido por ADN repetitive que como Su nombre Io indica, co- mesponde a diferentes secuen- cia de ADN que se encuentran repetidas a lo largo de todo el genoma. Dentro de éstas encon- tramos las de repeticion interdis- persa o intercalada que orresponden a secuencias de numero variable de bases que se encuentra repetidas en dife- rentes lugares del genoma ‘Otras secuencias _llamadas salélites estan repetidas en tan- dem, come los vagones de un tren (Figura 1). De acuerdo a su tamafo se las clasifica en satélites, mini y microsatélites (estas secuencias pueden for- mar parte de seauencias codifi- antes). El nimero de repeticiones varia de una persona a otra, asi por ejemplo un individuo puede tener 12 repeticiones de deter- minada secuencia en un cromo- soma, heredadas de padre, y 13 repeticiones en el otro cromo- soma homélogo, heredadas de la madre. Mientras que en otro: individuo la misma secuencia se encuentra 15 veces repetida, es. decir que lo que varia es el largo. del “tren’, en ambos cromoso- mas por ejemplo. Si bien dos in- dividuos no emparentados pueden llegar a tener el mismo. numero de repeticiones de una determinada Secuencia, es muy dificil que dos individuos presen- ten el mismo perfil (genotipo obtenida de analizar un determi- nado grupo de marcadores), salvo que sean gemelos, una vez analizados varios mar- adores (0 secuencias). Justa- mente el anélisis del ADN en 60 jentificacién forense se basa en el analisis de estas repeticiones. de corto tamafio denominados STR (Short Tandem Repeat) Cada niimero de repeticiones corresponde a un alelo determi nado. Cada par de alelos se ubica en igual locus a lugar del cromosoma. Por alelo enten- demos las diferentes formas posibles de un marcador genético. En el caso que una persona tenga dos mismos ale- los para un determinado mar- cador se dice que es homocigota, si los alelos son diferentes para un mismo mar- cador entonces es heteracigota. Existen alelos que son mas probables de ser compartidos por diferentes individuos de una misma etnia. Se hace impres- cindible contar por lo tanto con una base de datos (frecuencia de un alelo en una determinada poblacién), a fin de poder inter- pretar los resultados y realizar estudios de estadisticos adecua- dos. Los comienzos La aplicaci6n al estudio de estas secuencias en el campo de la medicina forense fue descu- rta por Alec Jeffreys de la Uni: versidad de Leicester en Inglaterra en 1984, condecorado més tarde con el titulo de Sir. En 1985 se emple6 por primera vez el analisis del ADN en el ambit de la justicia para la resolucion de un caso de inmigracion en el que estaba involucrada una fa- milia procedente de Ghana y que residia en el Reino Unido. Uno. de los nifios fue a visitar a su padre a Ghana y al regreso a61 gran Bretafia el funcionario de inmigracién no lo dejé entrar aduciende que la documentaci¢n era falsa. Luego de realizados los estudios, llevade a cabo en el laboratorio de Jeffreys, com- parando el ADN del nifio con el de su madre y hermanos se pudo resolver su identidad (Jet- freys analiz6 marcadores mini- satélites multilocus mediante la tecnica de Southern Blot). Posteriormente, el mismo grupo pudo esclarecer un caso de vio- lacion y asesinato. En 1983 en Narborough, una pequefia local idad cercana a Leicester, una nifia de 15 afios fue violada y asesinada. Tres afios mas tarde otra victima fue asesinada de la misma forma en Enderby, cerca de Narborough. La policia arres- toa Rodney Auckland, un joven de 17 afios, quien luego de un extenso interrogatorio admitio ser el autor del asesinato de la segunda joven pero no de la primera. La policia, convencida que el joven habia sido el autor de las dos violaciones, envid muestvas de semen recogidas de las vietimas y una muestra de sangre del acusado. El laborato- Fio de Jeffreys determind que los dos homicidios habian sido ‘cometidos por la misma persona pero que no correspondia a Auckland convirtiéndose en el primer caso en que gracias a esta técnica pude demostrarse la inocencia del acusado. La policia comenz6 a realizar una enorme busqueda a fin de dar con el cue pable. Se tomaron muestras de todos los hombres de Narbor- ough y suburbios aledafios, alrededor de 5000. Al comienzo no se puda determinar al culpa- Ce] ble, pero lan Kelly en una re- unién de amigos confesé que se habia hecho pasar por una per- sona de apellide Pitchfork por dinero. Alguien presente en el pub hizo la denuncia a la policia. Poco tiempo después, mediante el andlisis de ADN se pudo de- terminar que Pitchfork habia sido. el responsable de los asesinatos. Metodologia En el caso de un estudio de pa temidad se toman muestras de sangre 0 hisopados bueales, generalmente, de los supuestos: padres y del hijo y se obtienen los respectives ADN. Los alelos presentes en el hijo deben en- ‘sontrarse en los del padre y de la madre. En un homicidio 0 vio- lacién se compara el ADN ex- traido de diferentes fuentes tales ‘como manchas de sangre, semen o saliva, depositados en. ropa, vasos, cigartillos, sobres, hisopados vaginales o anales ‘obtenidos de victimas de vio- lacién, objetos personales como. peines, maquinas de ateitar, cepillos dé dientes, ete obtenidas en la escena del erimen con el ADN de las posi- bles sospechosos. Con la invencién de la Reaccién en Cadena de la Polimerasa 0 PCR (Polymerase Chain Reac- tion) por Kary Mullis y la posibili- dad de amplificar pequenias regiones polimérficas repetitivas. del + ADN + (microsatélites), ‘comenz6 un cambio tecnologico: dentro de la Genética Forense que puso en jaque a la técnica desarrollada por Jeffreys dado que esta requeria gran cantidad de ADN (cuestién dificil de en- 61 (1-3) 2011 contrar en el Ambito forense) y era laboriosa y costosa. Esta técnica hace posible pro- ducir millones de copias de una determinada secuencia de ADN. Para ello se desnaturaliza el DN obtenido y se lo incuba luego con oligonucledtidos o primers que estén compuestos de aproximadamente una vein- tena de nucledtidos que son complementarios a los extremos. de la secuencia de ADN a ampli- ficar. La polimerizacion la realiza una enzima que es la Taq polimerasa. Esta enzima inicial- mente fue obtenida de Thermus aquaticus (en la actualidad se obtiene por ingenieria genética), una bacteria termofila que habita en géiseres y por lo tanto resiste. altas temperaturas. Se debe tener en cuenta que la desnatu- ralizacién del ADN requiere tem- peraturas de 95°C y ninguna enzima de organismos superio- res puede trabajar a esta tem- peratura. Luego de alrededor de 30-35 ciclos, se obtienen millo- nes de copias (2"2), donde n es. el niimero de cictos. Una vez amplificada la regi6n deseada del ADN, en este caso. las secuencias repetidas en tan- dem, se identifica el tamafio de los alelos mediante una electro- foresis en gel y posterior com- paracion con marcadores de tamajo conocido (Figura 2). En la actualidad se dispone de equipos automatizados. Estos equipos permiten el andlisis de varios marcadores @ la vez. Esta técnica permitio analizar muestras degradadas por el paso del tiempo 0 con niveles muy bajos de ADN que hacian