CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA HPLC 1.

DESARROLLO DE UNA TÉCNICA Y

CUANTIFICACIÓN DE UN PRODUCTO COMERCIAL

VITAMINA C (ACIDO ASCORBICO)

Autores: Camilo Andrés Hernandez Vargas Cod: 06162706
Corporación Tecnológica de Bogotá , Tecnología en Regencia en Farmacia, Instrumental
Bogotá -Colombia
Fecha 28-03-19
Chernandez14@ctb.edu.co;

1. RESUMEN tomar las medidas necesarias para la preparación de

las muestras ya que se oxida con facilidad al estar
expuesta con la luz. Cada tableta contiene 500 mg de
Se realizo la práctica con el fin de determinar el
activo, el objetivo principal es cuantificar y confirmar
contenido de vitamina C en un producto comercial,
la cantidad de activo que declarada es verídica. Por
mediante el método instrumental HPLC
otra parte, se buscó encontrar las condiciones óptimas
(Cromatografía Líquida de Alta Resolución).
para la extracción, identificación y condiciones
cromatográficas para cuantificar; para ello se
La cromatografía por HPLC se basa en la distribución
implementó la monografía USP 40 Capítulos Generales
de los componentes en fases inmiscibles, una
<580> Valoración de Vitamina C, Se utilizo el método
estacionaria y otra móvil, en la práctica se pudo llevar
II, Método cromatográfico aplicando el procedimiento
a cabo el reconocimiento del cromatógrafo HPLC,
II que se realiza por gradiente y realizando una
donde hay un sistema de suministro un inyector,
variación en tiempo para la solución amortiguadora y
columna y un detector, por medio de este método
el solvente.
analítico de HPLC, se llevó a cabo el análisis de un
producto farmacéutico Ácido ascórbico (Vitamina C).
Se evaluó los siguientes parámetros: Columna
(dimensiones, relleno y tamaño de la partícula), fase
El ácido ascórbico (AA) es una vitamina esencial en la
móvil, flujo, longitud de onda, temperatura, cantidad
dieta humana, y su determinación por cromatografía
a inyectar presión, finalmente requisitos de aptitud,
liquida es una técnica sensible y rápida, es importante
concentración es decir que utilizamos el tipo de
cromatografía en fase inversa. Se realiza la creación
del proyecto y método, se preparó fase móvil y se
transfiere a cada uno de los reservorios. Se adecuo la
columna, purgamos el equipo con la finalidad de evitar
que halla aire en la tubería y varié los tiempos de
retención y la presión. Se crea la secuencia y se
registran las muestras que se van a inyectar en este
caso sería el estándar y muestra; Se guarda secuencia
y método. Se deja estabilizar el equipo hasta que haya
una buena línea base. Se realiza el pesaje y la
preparación de las muestras que se van a inyectar. El
equipo a través de la interfaz transforma la
información por medio cromatogramas
representando en Picos de forma simétrica indicando
la respuesta de la muestra y el estándar en un tiempo
de retención muy similar.
Palabras Clave:
Cromatografía HPLC, fase móvil, Vitamina C,
concentraciones, Fase móvil, Fase estacionaria.
2. ABSTRACT
The practice was carried out in order to determine the
vitamin C content in a commercial product, using the
HPLC instrumental method (High Resolution Liquid
Chromatography).
Chromatography HPLC is based on the distribution of
the components in immiscible phases, one stationary
and one mobile, in practice this might lead one end
Recognition HPLC chromatograph, UN hay Where
injector system provided a detector column UN and,
through this analytical method HPLC was conducted
Analysis UN Product pharmaceutical ascorbic acid
(vitamin C ).
Ascorbic acid (AA) is an essential vitamin in the human
diet, and its determination by liquid chromatography
is a sensitive and rapid technique, it is important to
take the necessary measures for the preparation of
the samples as it is easily oxidized when exposed with
light. Each tablet contains 500 mg of active, the main
goal is to quantify and confirm the amount of asset
declared to be true. On the other hand, the aim was to
find the optimal conditions for the extraction,
identification and chromatographic conditions to
quantify; to this end, the monograph USP 40 General
Chapters <580> Valuation of Vitamin C was
implemented, Method II, Chromatographic method
was used by applying the procedure II that is
performed by gradient and performing a variation in
time for the buffer solution and solvent.
The following parameters were evaluated: Column
(dimensions, fill and particle size), mobile phase, flow,
wavelength, temperature, quantity to inject pressure,
finally aptitude and concentration requirements. The
project and method is created, the mobile phase is
prepared and transferred to each of the reservoirs.
The column was adjusted, the equipment was purged
in order to prevent air from being found in the pipe
and the retention times and pressure varied. Create
the sequence and record the samples to be injected in
this case would be the standard and sample; save
sequence and method. The equipment is stabilized
until there is a good baseline. Weighing and
preparation of the samples to be injected is
performed. The computer through the interface medida que adelantan por la columna. El grado de
transforms the information by means of retención de los componentes de la muestra
chromatograms representing in Peaks symmetrically depende de la naturaleza del compuesto, de la
indicating the response of the sample and the composición de la fase estacionaria y de la fase
standard in a very similar retention time. móvil.

El tiempo que tarda un compuesto a ser eludido de

KEYWORDS
la columna se denomina tiempo de retención y se
Chromatography HPLC, mobile phase, vitamin C,
considera una propiedad identificativa
concentrations, mobile phase, stationary phase.
característica de un compuesto en una
determinada fase móvil y estacionaria.
3. INTRODUCCIÓN
La utilización de presión en este tipo de
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA
cromatografías incrementa la velocidad lineal de
RESOLUCIÓN (HPLC) los compuestos dentro de la columna y reduce así
su difusión dentro de la columna mejorando la
resolución de la cromatografía.

CROMATOGRAFÍA DE FASE INVERSA

La HPLC de fase inversa (RP-HPLC) consiste en

una fase estacionaria apolar y una fase móvil de
polaridad moderada.

El tiempo de retención aumenta con la adición de

disolvente polar a la fase móvil y disminuye con
En el HPLC el compuesto pasa por la columna la introducción de disolventes más hidrofóbicos.
cromatográfica a través de la fase
La cromatografía de fase reversa es tan utilizada
estacionaria (normalmente, un cilindro con
que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna
pequeñas partículas redondeadas con ciertas
especificación adicional.
características químicas en su superficie)
mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta
presión a través de la columna.

La muestra a analizar es introducida en pequeñas

cantidades y sus componentes se retrasan
diferencialmente dependiendo de las interacciones
químicas o físicas con la fase estacionaria a

La cromatografía de fase reversa se basa en el
principio de las interacciones hidrofóbicas que
resultan de las fuerzas de repulsión entre un
disolvente relativamente polar, un compuesto
relativamente apolar, y una fase estacionaria
apolar. La fuerza conductora en la unión del
compuesto a la fase estacionaria es la disminución
del área del segmento apolar del analito expuesto
al disolvente.
Cromatografía: La cromatografía es un método
físico de separación en el cual los componentes a
separar se distribuyen entre dos fases, una que es
estacionaria (fase estacionaria) mientras que la
otra, (la fase móvil) se mueve en una dirección
determinada.
Cromatograma:
Es un gráfico u otra representación de la respuesta
del detector, de la concentración del analito en el
efluente o de otra magnitud utilizada para medir
una propiedad del efluente frente al volumen de
efluente o tiempo. En cromatografía en plano,
"cromatograma" puede ser el papel o capa con las
zonas separadas.
Cromatografiar: Separar por cromatografía.
Cromatógrafo:
Sistema instrumental para llevar a cabo la
separación cromatográfica.
Fase estacionaria: La fase estacionaria es una de
las dos fases que forman un sistema
cromatográfico. Puede ser un sólido, un gel, o un
líquido. Si es un líquido, puede estar adherido
sobre un sólido. Este sólido puede o no contribuir
al proceso de separación. El líquido también se
puede unir químicamente al sólido (fase unida
químicamente) o inmovilizarse sobre él (fase
inmovilizada). formas en las que se presenta la
fase estacionaria.
Fase inmovilizada: Es una fase estacionaria que
está inmovilizada sobre las partículas del soporte
o sobre la pared interna de la columna, por
ejemplo, por polimerización in situ (reticulación)
después del recubrimiento.
Fase móvil: Es un fluido que penetra a través o a
lo largo del lecho estacionario, en una dirección
determinada.
Eluir: El proceso de elución se puede detener
mientras todos los componentes están aún en el
lecho cromatográfico, o continuar hasta que todos analito para designar a un componente de la
los componentes lo hayan abandonado. muestra.

Efluente: Es la fase móvil que sale de la columna. Soluto: Es un término que designa a los
componentes de una muestra en una cromatografía
Estándar:
de reparto.

Disolvente: Es un término con el que algunas

veces se denomina a la fase estacionaria líquida,
en una cromatografía de reparto.

Es un patrón primario con una sustancia utilizada 4. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

en química como referencia al momento de hacer
MATERIALES
una valoración o estandarización. Usualmente
Balones aforados 250 mL
son sólidos que cumplen con las siguientes Balones aforados 100 mL
características: Composición conocida, alta Balones aforados 10 mL
Pipeta aforada 1 mL
pureza, deben ser estables a temperatura Pipeta aforada 2 mL
ambiente, que se puedan secar en estufa, que no Pipeta aforada 5 mL
Pipeta aforada 10 mL
absorban gases o reaccionen con los Pipeta graduada 1 mL
Pipeta graduada 5 mL
componentes de aire.
Pipeta graduada 10 mL
Vaso de precipitado 250 mL
Muestra: La muestra consiste en un determinado
Vaso de precipitado 50 mL
número de componentes cuya separación se Pera de succión
alcanza en el lecho cromatográfico cuando son Microespatula
Vidrio de reloj
arrastrados o eluidos por la fase móvil. Filtros para fase móvil y muestras
viales
REACTIVOS
Agua HPLC
Metanol HPLC
Ácido fosfórico concentrado
Ácido ascórbico
INSTRUMENTOS
Componentes de la muestra: Son los Cromatógrafo líquido HPLC marca
SHIMADZU-EZCHROM ELITE
constituyentes químicamente puros de la muestra. Balanza analítica
Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria, Sistema de filtrado para fase móvil
ultrasonido
estar parcialmente retenidos (es decir eluidos en
tiempos diferentes), o bien permanentemente
retenidos. Se puede aceptar también la palabra 5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
 CONDCIONES CROMATOGRAFICAS

Cromatógrafo líquido HPLC

 Determinar el contenido de ácido
marca SHIMADZU-
ascórbico en tabletas de vitamina C
Equipo: ZCHROM ELITE
usando la técnica de cromatografía líquida
Columna: L7, 10 mm x 4,6 mm, 3,5 µm.
de alta eficiencia (HPLC).
Longitud de 245 nm
onda:
 Analizar cuantitativamente el contenido
Fase móvil: Gradiente
de ácido ascórbico mediante el uso de
Flujo: 0,8 mL/min.
curva de calibración externa.
Volumen de 10,0 µL.
inyección:
 Determinar la precisión del análisis y
Temperatura: 25°C.
compararla con la composición en el lote
Tiempo de 10,0 minutos.
de producción del fármaco.
Corrida:

Concentración: 0,05 mg/mL Acido Ascórbico

PROCEDIMIENTO ADECUADO PARA UNA CORRIDA

CROMATOGRAFICA Solución Amortiguadora: Pesar 7,8 g de Fosfato
Diacido de Sodio en 1 Litro de agua grado HPLC y
ajustar a pH 2.5 con H3PO4. Mezclar, sonicar y filtrar
por membrana de 0,45 micras y desgacificar.

Fase Móvil: Solución Amortiguadora y MEOH HPLC.

DESCRIPCIÓN
Diluyente: Pesar 73 g de Acido Metafosforico en 800
Tomar 10 tabletas y pesar, realizar peso promedio. mL de Agua grado Hplc, adicionar 84 mL de Acido
Macerarlas para la preparación de la muestra. Acético y llevar a volumen de 1000 mL.

PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN
IDENTIFICACIÓN ESTÁNDAR

El tiempo de retención del pico principal en el
cromatograma de la valoración de la solución de la
muestra corresponde con el del cromatograma de la
solución de estándar según se obtienen en valoración.
VALORACIÓN DE ACIDO ASCORBICO
Solución Madre estándar de Ácido Ascórbico: Pesar
10,0 mg de estándar Acido Ascórbico, transferir
cuantitativamente a un balón aforado de 10 mL,
completar a volumen con diluente. Mezclar, sonicar y
filtrar por membrana de 0,45 micras y desgacificar. La
concentración de la solución es de 1 mg/mL de Ácido
Ascórbico.
Solución estándar de Ácido Ascórbico: Transferir 6. RESULTADOS
cuantitativamente una alícuota de 5 mL de la solución
madre a un balón aforado de 100 mL, llevar a volumen PESO PROMEDIO (mg)
1 1558 11 1542
con diluente, Mezclar, sonicar y filtrar por membrana
2 1546 12 1548
de 0,45 micras y desgacificar. La concentración de la 3 1546 13 1550
solución es de 0,05 mg/mL de Ácido Ascórbico. 4 1559 14 1545
5 1551 15 1559
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA:
6 1551 16 1548
Pesar 77.5 mg de las tabletas maceradas; (Equivalente 7 1547 17 1546
8 1550 18 1558
a 25 mg de Ácido Ascórbico), transferir
9 1556 19 1555
cuantitativamente a un un balón aforado de 250 mL, 10 20
1549 1542
adicionar el 50% de diluyente y sonicar, llevar a PROMEDIO 1550
volumen con diluente. Transferir una alícuota de 5 mL
y llevar cuantitativamente a un balón aforado de 10 mL
Cromatograma Vitamina C
disolver y llevar a volumen con diluente. Filtrar por
membrana de 0,45 micras y desgasificar. La
concentración de la solución es de aproximadamente
0,05mg/mL para Ácido Ascórbico.

FORMULA PARA LA CUANTIFICACIÓN DEL

CONTENIDO DE ÁCIDO ASCÓRBICO

Calcular el % de Ácido Ascórbico / Tabletas en la

muestra analizada, utilizando la siguiente fórmula:

𝐴𝑚𝐴𝑠𝑡𝑥𝑊𝑠𝑡𝑉1𝑠𝑡𝑥𝐴1𝑠𝑡𝑉2𝑠𝑡𝑥 𝑃𝑜𝑡𝑠𝑡 %
𝑥𝑉1𝑚𝑊𝑚𝑥𝑉2𝑚𝐴1𝑚𝑥𝑃𝑝𝐶𝑑= AREA
AREA ESTANDAR
MUESTRA
6004827 5999321
Dónde:
6004876 5996916

6003711 5995802
Am: Área de la muestra.
Ast: Área del estándar. 6004113

Wst: Peso del estándar (mg). 6006513

Potst: Potencia del estándar en base húmeda (%). 6004808 5997346,333
PROMEDIO
Wm: Peso de la muestra (mg). 1072,199142 1798,535608
DESVIACION
V: Volumen (mL). 0,017855677 0,029988857
RSD %
Pp: Peso promedio (mg).
Cd: Concentración declarada (mg/Tab).
Peso de la Muestra:77,5 mg
Volumen 1 del Muestra:250 mL
Volumen 2 del Muestra:10 mL
Alícuota del Muestra: 5 mL

Peso del Estandar:10 mg

Volumen 1 del Estándar: 10 mL
Volumen 2 del Estándar: 100 mL
Alícuota del estándar: 5 mL

Potencia del estándar BH:100%

Peso promedio:1550 mg
Concentración declarada: 500 mg /Tab
Tiempo de retencion:4 Min Aprox

7. ANALISIS DE RESLTADOS

Según los datos arrojados y remplazando en la formula

tendríamos 99.9% del activo es decir que por cada
tableta contiene 499,5 mg de Ácido Ascórbico.
Claramente el producto cumple con los requerimientos
óptimos de calidad.

8. BIBLIOGRAFIA

QUATTROCHI O, Andrizzi S., Laba R. "Introducción a la

HPLC". Artes Gráficas Farro S.A. Buenos Aires-
Argentina, 1992.

SKOOG D, Holler F, Nieman T. "Principios de análisis

instrumental 5a ed". Madrid-España. McGraw-Hill.
2001

Plantilla guía práctica de laboratorio

corporación tecnológica de Bogotá,