Validation des méthodes

d'analyse

Journées Qualité et Chimie 2010

Une démarche qualité au service de la chimie
Autrans - 14 octobre 2010

Marie-Dominique Blanchin Laboratoire de Chimie Analytique

 Référentiels

  ISO 5725 : 1994 - Exactitude et fidélité d'une

méthode de mesure
  ISO 17025 : 2005 - Prescriptions générales
concernant la compétence des laboratoires d'essai
et d'étalonnage
  Compétences management de la qualité
  Compétences techniques

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Référentiels/Industrie Pharmaceutique

  ICH : International Conférence on Harmonisation

  Q2(R1) 2005 : validation of analytical procedures
test and methodology
  Pharmacopée américaine, USP33-NF28
  <1225> Validation of compendial methods
  FDA guidance for industry.
  Analytical procedures and method validation
  Eurachem

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ICH /Définitions

  Méthode d'analyse
  Document écrit
  "Moyen de réaliser l'analyse"

  "Description détaillée des différentes opérations

nécessaires pour effectuer l'analyse de la
substance à examiner"

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ICH / Définitions

  Validation

  "Le but de la validation d'une méthode d'analyse

est de démontrer qu'elle correspond à l'usage
pour lequel elle est prévue"

  Ensemble des opérations nécessaires pour

prouver que le protocole est suffisamment exacte
et fiable pour avoir confiance dans les résultats
fournis et ceci pour un usage déterminé

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Définitions

  Validation

  Application déterminée
 

  Niveau de la validation
  Fonction de l'application
  Objectif clairement déterminé

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Critères de validation

  Spécificité
  Linéarité

  Exactitude

  Fidélité

  Intervalle d'application

  Limite de détection

  Limite de quantification

  Robustesse

  Stabilité des solutions

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Spécificité Specificity

  "Capacité de la méthode de permettre une

évaluation non équivoque de l'analyte en
présence de composants qui sont susceptibles
d'être présents"

  Capacité de faire la discrimination analyte /substances

interférentes
  Garantir que le résultat de l'analyse  analyte
  Absence d'interférences

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Spécificité Specificity

  Impuretés
  Ajouts dosés impuretés disponibles sur composé ou
formulation
  Comparaison avec résultats obtenus sur des
échantillons contenant des impuretés ou des
produits dégradation (lumière, t°, humidité, hydrolyse
acide ou alcaline, oxydation)
  Profil impuretés

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Spécificité Specificity

  Si méthode CLHP, vérifiée par

  Injection
  placebo analytique = matrice (dégradé, non dégradé)
  composés interférents potentiels, produits de décomposition,
intermédiaires, précurseurs de synthèse
  échantillons dégradés (lumière, t°, acide, alcalin, oxydant)

  Observation des chromatogrammes obtenus

  Vérification homogénéité des pics

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Linéarité Linearity

  "Capacité dans un intervalle donné d'obtenir des

résultats de dosage directement proportionnels
à la concentration ou à la quantité d'analyte
dans l'échantillon"

  Relation linéaire signal - concentration

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Linéarité Linearity

  Exemple méthode CLHP, vérifiée par injection de

  solutions étalons d’analyte : linéarité de la gamme

d'étalonnage

  Solutions  échantillons reconstitués concentrations

d'analyte différentes : linéarité de la méthode

n ≥ 5 concentrations
n ≥ 3 répétitions de chaque niveau

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Linéarité Linearity

  Intervalle de linéarité fonction de

  Analyte (impureté, principe actif, conservateur,…)

  Application (formulation, test de dissolution,…)

  Vérifiée : examen de la courbe, analyse de variance

  Exprimée : Équation de la droite avec intervalle de
confiance sur pente, ordonnée à l’origine, coefficient
de détermination r2

Si linéarité + ordonnée origine =0 : 1 seul point étalon

en routine

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Exactitude (justesse) Accuracy

  "Etroitesse d’accord entre la valeur trouvée et la valeur acceptée

soit comme valeur conventionnellement vraie soit comme valeur
de référence"

  ISO 5725
  Exactitude : étroitesse d'accord entre la résultat d'essai et la
valeur de référence acceptée
  Justesse : étroitesse d’accord entre la valeur moyenne obtenue à
partir de larges séries d'essais et une valeur de référence
acceptée

écart d'une valeur obtenue / valeur considérée comme exacte

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Exactitude (justesse) Accuracy

Exact, non fidèle Inexact, non fidèle

Exact, fidèle Inexact, fidèle

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 Exactitude (justesse) Accuracy

  Exactitude  erreur systématique (biais) d'une

valeur obtenue / valeur considérée comme exacte

  Vérifiée par comparaison

  méthode de référence
  préparation échantillons reconstitués (matrice + quantité
connue d’analyte) et étalons
  n ≥ 3 x 3 concentrations différentes en analyte

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Exactitude (justesse) Accuracy

 Tracé droite qté trouvée - qté ajoutée

(= théorique ou vraie)
  Méthode exacte si
  pente=1
  ordonnée origine =0
  Tracé droites réponse-qté ajoutée et réponse-
quantité étalons
  Méthode exacte si pente et ordonnée origine =0
identiques
  Taux de recouvrement ou erreur relative %
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Fidélité Precision

  " Etroitesse d’accord entre une série de

mesures obtenues dans des conditions
prescrites à partir de prises d’essais multiples
provenant d’une même échantillon
homogène"

  ou degré de dispersion des résultats

  ou écart aléatoire de valeurs / valeur moyenne

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Fidélité Precision

Fidèle, inexact Non fidèle, inexact

Fidèle, exact Non fidèle, exact

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Fidélité Precision

  Fidélité  erreurs aléatoires

  Répétabilité
  Fidélité intermédiaire

  Reproductibilité

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Fidélité, répétabilité Repeatability

 "Larépétabilité exprime la fidélité évaluée dans

des conditions opératoires identiques et dans un
court intervalle de temps"

Déterminée à partir d'un même échantillon, évaluée

dans des conditions opératoires identiques (même
analyste, même équipement, même laboratoire,…) et
dans un court intervalle de temps

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Fidélité, répétabilité Repeatability

  Répétabilité de la mesure : n ≥ 6 même

échantillon
  Répétabilité de la méthode : n ≥ 6 ou n ≥ 3x3

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Fidélité, fidélité intermédiaire
Intermediate precision

  "La fidélité intermédiaire exprime la variabilité

intra-laboratoire : jours différents, analystes
différents, équipements différents, etc… "

Détermination à partir d'un même échantillon

→  bien spécifier les conditions

→  plan expériences

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Fidélité, reproductibilité
Reproductibility
  " La reproductibilité exprime la variabilité inter
laboratoires (études collaboratives)
habituellement appliquées à la standardisation
de la méthodologie"

  Déterminations à partir d’un même échantillon

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Fidélité, expression Precision

  Écart-type s (standard deviation)

  Variance s2

  Coefficient de variation, s/m*100 ( relative

standard deviation) %

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Intervalle de validité Range

  "Intervalle compris entre la concentration

(quantité ) la plus élevée et la plus faible de
l'échantillon dans lequel il a été démontré
que la méthode d'analyse présente une
fidélité, une exactitude et une linéarité
satisfaisante."

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Limite de détection Detection Limit

  " La limite de détection d'une méthode d'analyse

est la plus petite quantité d’analyte qui peut être
détectée mais pas nécessairement quantifiée
comme une valeur exacte"

  Exprimée en quantité injectée ng, µg

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Limite de détection Detection Limit

  Évaluation visuelle
  Évaluation  signal/bruit

  Évaluation  pente et écart-type

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Limite de détection Detection Limit

  Exemple méthode CLHP

  Masse ou concentration d’analyte qui donne un
rapport S/B = 3
  Bruit pic à pic

  Vérifiée dans matrice par injection à la

concentration retenue comme LD

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Limite de quantification
Quantification Limit

  "Quantité la plus faible d’analyte dans un

échantillon qui peut être déterminée
quantitativement avec une fidélité et une
exactitude appropriée"

  Exprimée en ng ou µg

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Limite de quantification
Quantification Limit

  Évaluation visuelle
  Évaluation  signal/bruit

  Évaluation  pente et écart-type

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Limite de quantification
Quantification Limit

  Évaluée : quantité ou concentration d’analyte S/

B = 10
  Vérifiée en injectant des solutions de conc. =LQ

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Robustesse Robustness

  "Capacité du protocole de rester non affectée par des

variations faibles mais délibérément introduites dans
les paramètres de la méthode; fournit une indication
sur sa fiabilité dans des conditions normales
d’utilisation"

  Variations faibles : modifications contrôlées des

conditions d'application (changements délibérés mais
limités  facteurs indépendants)
   étude de l'effet de chaque facteur sur le résultat de
l'analyse

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Robustesse Robustness

  Vérifiée par approche multivariée ou univariée (plan

d'expériences)

  Permet de fixer les limites des tests de conformité

  Donne une idée sur variations entre jours, entre
laboratoires  étape préliminaire avant de transférer les
méthodes, avant les études collaboratives

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Robustesse Robustness

  Exemples de facteurs
  Temps d'extraction
  Temps d' agitation
  CLHP
  pH de la phase mobile
  Composition de la phase mobile
  Débit
  Colonne
  Température ….
  Permet de fixer les limites des tests de
conformité

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Stabilité des solutions

  Vérifiée sur solutions étalons et échantillons

  Vérifiée par comparaison des facteurs de
réponse

  Exemple méthode CLHP

  Solution « vieillie »
  Solution « fraîche »

  Temps > 16h (injecteur automatique)

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Conclusion

  Validation initiale
  Pas de règles
  Recommandations; lignes directrices

  Pas de protocole figé

  Adaptation à l'usage, aux exigences

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Conclusion

  Routine
  Validation in situ : confirmation validation initiale
applicable ( suivi des paramètres, CQ,…)

  Tests de conformité HPLC

  Paramètres chromatographiques Tr, Rs, N
  Répétabilité injections successives (n = 6)

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 TEST PARAMETRE CRITERE D’ ACCEPTATION
Identification Spécificité Test garantissant l’identité de l’analyte

Tests quantitatifs Exactitude/TR 95 à 105 % qté théorique

majeurs Répétabilité Doit être prouvée
Fidélité intermédiaire RSD ≤ 3 %
Linéarité R2 ≥ 0,98 ou R ≥ 0,99
Spécificité Rs satisfaisante entre les pics PA et pdts de
dégradation connus; évaluation de l’interférence du
placebo

Robustesse Doit être démontrée

Dosage de faibles Exactitude/TR 70 à 130 % de la qté tolérée

conc. (pdts de Répétabilité RSD ≤ 10 %
dégradation,
Linéarité R2 ≥ 0,95 ou R ≥ 0,97
impuretés)
Spécificité Rs satisfaisante entre pics PA et pdts de
dégradation connus; évaluation de l’interférence du
placebo
LD Pour tests limites uniquement
Doit être démontrée
LQ

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Quelques livres
  Validation and Qualification in Analytical Laboratories – L. Huber
– Interpharm / CRC 1999
  L'assurance qualité dans les laboratoires agro-alimentaires et
pharmaceutiques – M. Feinberg, coordonnateur – Ed TEC&DOC
2001
  Analytical method validation and instrument performance
verification – Ed Chung Chow Chan, H. Lam, Y.C. Lee, X.M.
Zhang – John Wiley&Sons, 2004
  Validation of chromatography data systems – Meeting business
and regulatory requirements – R.D. McDowall – Ed Royal
Society of Chemistry, 2005
  Method validation in pharmaceutical analysis – a guide to best
practice – Ed J. Ermer and J.H. McB. Miller – Wiley- VCH, 2005
  ……

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