TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO

Instituto Tecnológico de Jiquilpan

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE JIQUILPAN

“ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL AGUA POR

MÉTODO DE NMP Y POR FILTRACIÓN POR
MEMBRANA”.

REPORTE DE PRÁCTICA
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS
Ingeniería Bioquímica

ALUMNOS
César Ismael García Alcántara
Grecia Vanessa Serrano Buenrostro
Jonathan Peña Oceguera
Jose Luis Silva Esquivias
José Sebastián Gutiérrez Soria
José Luis Silva Esquivias
Luis Octavio Viveros Pérez
PROFESOR: KARLA GABRIELA VARGAS
JIQUILPAN, MICH.,ABRIL DEL 2018
INDICE

1. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 3
1.1 Objetivo General................................................................................................................................3
1.2 Objetivos específicos ........................................................................................................................3
2. MARCO TEÓRICO ............................................................................................................... 3
3. MATERIALES Y EQUIPO.................................................................................................... 5
4 METODOLOGÍA.................................................................................................................... 6
4.1 Técnica de tubos múltiples o Número más probable, NMP ......................................................6
4.2 Técnica de la membrana filtrante, MF o FM .................................................................................7
4.3 Prueba confirmativa para E.colli .....................................................................................................8
4.4 Identificacion de E. colli mediante pruebas IMViC .......................................................................8
5. RESULTADOS ANALISIS E INTEPRETACIÓN ................................................................ 9
5.1 Membrana filtrante ............................................................................................................................9
5.2 TÉCNICA NÚMERO MÁS PROBABLE .........................................................................................9
6. OBERVACIONES .............................................................................................................. 14
7. CONCLUSIÓN.................................................................................................................... 14
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 15
PRACTICA NO 2. – ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL AGUA POR MÉTODO DE NMP
Y POR FILTRACIÓN POR MEMBRANA

1. OBJETIVOS

1.1 Objetivo General

Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua mediante el recuento de mesófilos aerobios
y la búsqueda de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y Echerichia coli.
Organizar e interpretar resultados.

1.2 Objetivos específicos

 Determinar la cantidad de coliformes totales y fecales por el método de NMP en una
muestra de agua.
 Determinar la calidad microbiológica de muestras de agua por el método de filtración
por membrana.

2. MARCO TEÓRICO

Método de filtración por membrana.

Para la detección de coliformes totales y coliformes fecales (E.coli) es utilizado el método
de filtración por membrana, el cual es un método altamente reproducible, puede usarse para
analizar volúmenes de muestra relativamente grande y se obtienen resultados en menor
tiempo que con el NMP. Sin embargo, no puede aplicarse a cualquier tipo de muestra y tiene
sus limitaciones también se encuentra éntrelos métodos standards.

Fundamento del método filtración por membrana:

La muestra de agua se hace pasar mediante vacío por un filtro de celulosa de
0.45 micras de tamaño de poro, para que queden retenidas en él, las bacterias de tipo
coliformes y las mesofilas. El filtro es colocado en un medio de cultivo específico para lo que
se desea determinar en la muestra (coliformes totales, coliformes fecales y microorganismos
mesófilos), incubando a 35 grados centígrados más o menos dos grados durante 18 a 20
horas.

3
Características del filtro de membrana:
Se debe utilizar filtro de membrana con un diámetro de poro que permita una completa
retención de las bacterias coliformes. Se debe tener en cuenta que estos filtros estén libres
de químicos susceptibles a inhibir el crecimiento y desarrollo bacteriano, que posean una
velocidad de filtración satisfactoria.
Ventajas y desventajas del método de filtración por membrana:

El método de filtración por membrana es un método ágil y poco dispendioso. La lectura de

resultados se da en un mejor tiempo (24 horas) a comparación del método NMP, además
se puede utilizar en pruebas de campo, empleando accesorios adecuados, el análisis se
dificulta en muestras de aguas muy turbias o con abundante carga bacteriana. Este
inconveniente es posible remediarlo, haciendo diluciones de la muestra o haciendo inóculos
muy pequeños de acuerdo con el tipo de muestra a analizar

Método de número más probable.

EL METODO DE NUMERO MAS PROBABLE (NMP) es una estrategia eficiente de
estimación de densidades poblacionales especialmente cuando una evaluación cuantitativa
de células individuales no es factible. La técnica se basa en la determinación de presencia
o ausencia (pos o neg) en réplicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de
microorganismos presentes en muestras de suelo u otros ambientes. Por lo tanto, un
requisito importante de este método es la necesidad de poder reconocer un atributo
particular de la población(es) en el medio de crecimiento a utilizarse. El estimado de
densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en diluciones
seriadas y el uso de una tabla probabilística. Algunas de las ventajas del NMP son: (i) la
capacidad de estimar tamaños poblacionales basados en atributos relacionados a un
proceso (selectividad); por ejemplo se puede determinar la densidad poblacional de
organismos que pueden nodular leguminosas en una muestra de suelo usando el método
de infección de plantas, (ii) provee una recuperación uniforme de las poblaciones
microbianas de suelos diversificados, (iii) determina sólo organismos vivos y activos
metabólicamente, y (iv) suele ser más rápido e igual de confiable que los métodos
tradicionales de esparcimiento en platos de cultivo, entre otros.

4
Pruebas bioquimicas.
Las pruebas bioquímicas permiten determinar las características metabólicas de las
bacterias de objeto de identificación. Algunas son rápidas, ya que evalúan la presencia de
una enzima preformada y su lectura varía entre unos segundos hasta unas pocas horas.
Otras pruebas requieren para su lectura el crecimiento del microorganismo con una
incubación previa de 18 a 48 horas.
IMVIC
El IMVIC se compone de cuatro pruebas: Indol, Rojo de metilo, Voges-Proskauer y Citrato.
Su finalidad es identificar un organismo del grupo de los coliformes.
Indol: La prueba del indol estudia la capacidad de degradar el triptófano con
producción de Indol y metabolitos indólicos.
Rojo de metilo: Estudia la fermentación ácido mixto con producción de ácidos estables
en el tiempo.
Voges-Proskauer: Estudia la fermentación butanodiólica con formación de un
metabolito intermediario neutro.
Citrato: Estudia la capacidad de utilizar el citrato como única fuente de carbono.
Enzimáticas.

3. MATERIALES Y EQUIPO

Tabla 1 - Material y equipo a necesitar para realizar las diferentes técnicas.

MATERIAL EQUIPO REACTIVOS
Charolas para pesar Balanza Caldo lauril sulfato de
triptosa
Gradilla Incubadoras, 25 y 37°C Caldo verdes bilis
brillante
Mechero Autoclave Caldo EC
Parilla Agar PDA
Membrana filtrante
Agitador magnético
Probeta
Vasos de precipitado
Tubos de ensaye
Matraz erlenmeyer
Matraz quitosato
Cajas Petri

5
 Micropipeta
Pipeta

4 METODOLOGÍA

Primeramente, para la toma de muestras se debe considerar que los frascos deben ser
estériles, (brindados por el laboratorio), las muestras serán según cada equipo lo considere,
en este caso agua para consumo humano marca TECO, agua potable del cuarto de
intendencia del edificio C del ITJ, y agua de la tarja número 1 del laboratorio de Bioquímica
del ITJ sección G-02 (análisis microbiológicos). Una vez recolectada la muestra considerar
las condiciones de manejo y de transporte, como lo son no abrirla ni calentarla.

4.1 Técnica de tubos múltiples o Número más probable, NMP

1. Preparar caldo lauril sulfato de triptosa CLST 2X (50ml), 1X (100ml), caldo verde bilis
brillante (140ml) y caldo EC (50ml). prepararlos según las especificaciones de
etiqueta y esterilizar a 15 PSI por 15 min a 121°C.
2. Primeramente se lleva a cabo la etapa presuntiva, para ello se verterán 10 ml de
CLST 2X en cinco tubos de ensaye, y 10 ml de CLST 1X en 10 tubos más.
3. Para la inoculación directa de la muestra, en la primer serie de tubos, CLST 2X, verter
10ml, en cinco de los tubos con CLST 1X verter 1ml de muestra en cada uno, y en
los otros cinco de CLST 1X colocar 0.1ml. NOTA, los tubos deben ser de Durham o
campana de fermentación.
4. Incubar de a 35°C por un periodo de 24 a 48 hrs, para proceder a encontrar el número
más probable de coniformes totales en la muestra. En esta técnica utilizamos el agua
tomada del cuarto de intendencia del edificio C.
5. Consideraremos positivos aquellos tubos que tengan formación de gas o grumos así
como cambio de coloración en el caldo.
6. Una vez pasado el tiempo de incubación e identificados los tubos positivos, se busca
la combinación numérica en la tabla NMP y se reporta.
7. La siguiente es la etapa confirmativa, para ello, de los tubos positivos se toman y
transfieren de 2 a 3 asadas en caldo lactosa verde bilis brillante, y se incuba a

6
 condiciones iguales que la determinación anterior, pasando las 48 horas se toman
como positivos tubos con gas y se reporta de igual forma usando la tabla del NMP.
8. En última instancia se hace la prueba confirmativa de coliformes fecales, para ello
igual, de la serie de tubos positivos anteriores se transfieren de 2 a 3 asadas y se
incuba a 44°C por 24 hr, tomando como positivos aquellos con formación de gas.

Esta técnica puede admitir variaciones, razón por la cual los resultados deben ser
reportados con precaución.
4.2 Técnica de la membrana filtrante, MF o FM
1. Preparar, según especificaciones del medio, agar ENDO, EMB Y PDA, 14 ml de cada
uno, esterilizarlo junto con 6 cajas Petri chicas.
2. Una vez esterilizados los medios y las cajas, verter en dos de ellas 7 ml de ENDO,
en otras dos, siete de EMB, y en otras dos 7 ml de PDA, en cada una-
3. Para este caso trabajaremos dos muestras, una será la de agua potable del cuarto
de intendencia del edificio C, y la otra será la de agua de una tarja del laboratorio de
bioquímica.
4. Para la técnica de membrana filtrante es necesario montar un equipo de filtrado en
condiciones estériles conectado a un bomba de vacío o succión, para facilitar el paso
de la muestra a través de la membrana de micro poros.
5. Una vez preparados los utensilios del equipo de filtrado (matraz quitasato), colocar
una membrana estéril sobre el centro del portafiltro, y asegurar el material con una
pinza.
6. Hacer pasar sobre la membrana 100ml de muestra, y retirarla en condiciones
estériles para incubarla en la caja con el medio ya solidificado. Cuidar que la parte
cuadriculada no quede viendo al agar.
7. Repetir así para cada muestra 2 veces hasta tener una membrana para ENDO, y otra
para EMB por cada muestra. 4 filtraciones en total.
8. En el caso de PDA se sembrara por estría masiva con asa bacteriológica tomando
asadas directamente de la muestra.
9. Incubar, ENDO y EMB a 35°C y PDA a 25°C
10. Reportar pasadas las 48hrs, como UFC especificando el medio, el tiempo y
temperatura de incubación así como la muestra a la cual pertenece el resultado.

7
4.3 Prueba confirmativa para E.colli
1. De los tubos de EC que resultaron positivos tomar una azada y sembrar por estría
cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento.
2. Incubar de forma invertida de 18 a 24 horas a 35°C
3. Seleccionar de cada placa dos colonias que presenten morfología con centro negro,
planas y sin brillo metálico, si no se presentan así tomar de las más parecidas a estas
características para sembrarlas en ACE y luego observar al microscopio para realizar
las pruebas de morfología y luego pruebas bioquímicas.
4. Incubar de 18 a 24 horas a 35°C

4.4 Identificacion de E. colli mediante pruebas IMViC

A partir de las cajas de ACE, seleccionar una colonia y re suspenderla en 2mL de solución
salina isotónica para realizar las siguientes pruebas bioquímicas.
a) Producción de indol: tomar una azada de la solución bacteriana e inocular un tubo
con caldo de triptona, incubar a 35°C por 24 horas. Finalizada la incubación,
adicionar entre 0.2 y 0.3 mL del reactivo de Kovacs o Ehrlich. La presencia de una
coloración roja en la superficie del tubo se considera como positiva para la
presencia de indol.
b) Producción de ácidos mixtos (prueba del rojo de metilo): tomar una asada de la
suspensión bacteriana e inocular un tubo que contenga caldo rojo de metilo
Vogues-Proskauer, incubar a 35°C por 48 horas. Finalizada la incubación
adicionar 5 gotas de rojo de metilo se consideran negativo o positivo cuando se
desarrolla un color amarillo o rojo respectivamente.
c) Producción de metabolitos neutros, (Vogues-Proskauer, VP): tomar una asada
de la solución bacteriana e inocular un tubo que contenga caldo RM-VP, incubar
a 35°C por 48 horas, finalizada la incubación adicionar o.6mL de KOH 40% (VP1)
agitar y añadir 0.2mL de solución alfa-naftol (VP2), y agitar. Dejar reposar
destapado durante diez minutos; se considera una prueba positiva cuando se
desarrolla un color rosa en la superficie.
d) Utilización de citrato: tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un
tubo que contenga caldo citrato de Kosser o agar citrato de Simmons, incubar a

8
 35°C por 96 horas, el desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad en el
agar citrato de Kosser se considera una prueba positiva.

5. RESULTADOS ANALISIS E INTEPRETACIÓN

5.1 Membrana filtrante

Muestra 1: agua tarja de laboratorio

Muestra 2: agua de baño

Muestra ADP EMB ENDO

1 10 INCONTABLE NO SE
REALIZO
2 NO SE INCONTABLE INCONTABLE
REALIZO

Nótese que las muestra no realizadas, fueron debido a que no hubo crecimiento.

Fig. 5. Membrana filtrante

En la figura 5 se pueden observar
las cajas en las que se realizó
membrana filtrante y no sé qué
poner a 48 horas

5.2 Técnica número más probable

5.2.1 Etapa presuntiva
De acuerdo a la metodología, se realizaron 3 series de 5 tubos con caldo lauril sulfato de
sodio, los cuales fueron inoculados con diferentes concentraciones de muestra directa
(obtenida de un galón de los intendentes del edificio C del Instituto Tecnológico de
Jiquilpan), los resultados se presentan en la siguiente tabla:

9
Tabla 2. Resultados etapa presuntiva
Serie de tubos Número de tubos positivos
Con 10 ml de muestra 5
Con 1 ml de muestra 5
Con 0.1 ml de muestra 4

Como se puede observar, 14 de los 15 tubos en total, fueron positivos, por lo cual, de
acuerdo a la tabla de NMP para 100 ml de muestra cuando se utilizan 5 porciones en cada
una de 3 diluciones con series gométricas, tenemos que el número más probable para la
muestra es:
1600 NMP coliformes totales/100 ml de muestra de agua potable obtenida de un galón de
los intendentes del edificio C del instituto tecnológico de Jiquilpan en caldo lauril sulfato de
sodio a las 48 horas y con una temperatura de incubación de 35 ± 2 °C.

Fig. 1.- En la figura 1 se pueden

observar los tubos en los cuales se
colocaron 10 ml de muestra, en
estos se puede apreciar que se
obtuvieron los 5 resultados
positivos para coliformes totales en
CLST a las 48 horas de incubación
y con una temperatura de 35 ± 2 °C.

10
 Fig. 2.- En la figura 2 se pueden
observar los tubos a los cuales
se le agrego 1 ml de muestra, al
igual que como ocurrió con la
figura número 1 se pueden
observar 5 positivos para
coliformes totales en CLST a las
48 horas de incubación y con
una temperatura de 35 ± 2 °C.

Fig. 3.- En la figura 3 se pueden

observar los tubos a los cuales
se le agregaron 0.1 ml de
muestra, para los cuales se
obtuvieron 4 resultados positivos
para coliformes totales en CLST
a las 48 horas de incubación y
con una temperatura de 35 ± 2
°C

5.2.2 Etapa confirmativa

Los 14 tubos positivos fueron transferidos a caldo verde bilis brillante por medio de asadas,
2 asadas para los 10 tubos con 10 y 1 ml de muestra y 3 asadas para los 4 tubos con 0.1
ml de muestra.
En ésta etapa, los 14 tubos inoculados fueron positivos, presentando formación de gas o
formación de precipitados y turbidez en el medio.

11
 Fig. 4.- En la figura 4 podemos
observar los tubos de caldo
verde bilis brillante inoculados
con los tubos positivos de CLST
con 10 ml de muestra. Como se
observa, todos fueron positivos,
al haber cambio de coloración,
formación de gas, precipitados o
turbidez.

Al ser todos los tubos positivos, de la tabla de NMP para 100 ml de muestra cuando se
utilizan 5 porciones en cada una de 3 diluciones con series geométricas, nos resultó un NMP
de:
1600 NMP coliformes fecales/100 ml de muestra de agua potable obtenida de un galón de
los intendentes del edificio C del instituto tecnológico de Jiquilpan en Caldo verde bilis
brillante a las 48 horas y con una temperatura de incubación de 45 ± 0.5 °C.

5.2.3 Etapa confirmativa de E. coli

Finalmente, como solo se contaban con 5 tubos preparados con caldo E. coli, se transfirieron
por asadas el medio de CBVB de los tubos con mayor concentración, los cuales fueron los
que inicialmente se inocularon con 10 ml de muestra en CLST.
En todos los tubos, hubo presencia de precipitados y turbidez, por lo cual, serán sometidos
a pruebas IMVIC para confirmar en su totalidad la presencia de E. coli en la muestra.

12
 Fig. 6.- En la figura se pueden
observar los tubos a los cuales se le
realizaran las pruebas IMViC para
confirmación de E. Coli.

Fig. 7.- Pruebas IMViC para

confirmacion de E. coli.

En la figura 7 podemos observar los tubos con las pruebas IMViC realizadas, de
izquierda a derecha se tiene la prueba de indol, rojo de metilo, Vogues Proskauer y
citratos.

13
 Prueba de Indol: En la prueba de indol se puede observar que es negativo, ya que
no se detecta la presencia de indol indicando que no existe hidrolisis de triptófano.

Prueba de rojo de metilo: en la prueba de rojo de metilo se obtuvo un valor positivo,

esto indica que hubo una fermentación acido-mixta y por lo tanto una reducción de
pH, dicha reducción se detecta con el rojo de metilo.

Prueba de Vogues Proskauer: En esta prueba se obtuvo un valor negativo, por lo

tanto, indica que no hay una fermentación butanodioica y por ende no se detecta la
presencia de acetoína.

La prueba de consumo de citratos arroja un valor positivo, se puede detectar

turbidez y alcalinización del medio.
Al obtener los valores -,+,-,+ podemos concluir que la bacteria no es E. coli puesto
que para E. coli debe ser -,+,-,-, entonces la bacteria que está presente puede ser
Salmonella y Citrobacter.

6. OBERVACIONES

7. CONCLUSIÓN

El agua es uno de los recursos más importantes en la mayoría de las industrias, por lo cual,
la calidad de la misma es un indicador de la calidad del proceso y del producto final de la
mayoría de las industrias principalmente las que tienen enfoque alimenticio.

Ya que el agua es usada en los procesos de limpieza, sanitización, tratamientos térmicos e

incluso en la elaboración directa de los productos, puede ser in importante factor de
contaminación en distintos puntos del proceso.

Debido a la anterior, se comprende la importancia de las pruebas de análisis para el agua,

y poder de esta manera, determinar su calidad microbiológica, para, así, realizar

14
correcciones en el proceso mejorando los tratamientos de aguas, mediante adición de
químicos como cloro u otras alternativas. Finalmente, una mala calidad microbiológica del
agua, también, nos puede indicar que la procedencia del agua utilizada a nivel industrial,
laboratorio, e incluso a nivel casero para consumo cotidiano, es cuestionable, por lo cual,
se debe tomar en consideración, cambiarla.

8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 Armando Cervantez Sandoval. (2013). Atlas de pruebas bioquimicas para identificar

bacterias. 23/04/2018, de UNAM Sitio web:
https://microbitos.files.wordpress.com/2010/06/atlasmicrobiologia1.pdf
 Istituto de salud pública. (2008). Metodo de filtracion de membrana. 23/04/2018, de
Gobierno de Chile Sitio web:
http://www.ispch.cl/lab_amb/doc/microbiologia_alimentos/PRT-009.pdf
 Laboratorio de aguas. (2013). Método para la determinación de bacterias coliformes,
coliformes fecales y Escherichia coli por la técnica de diluciones en tubo múltiple
(número más probable o NMP). 23/04/2018, de UNAM Sitio web:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Analisis_Agua_NMP_22309.pdf
 Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. . (2009).
Método para la determinación de bacterias coliformes, coliformes fecales y
Escherichia coli por la técnica de diluciones en tubo múltiple (Número más Probable
o NMP) . 23/04/2018, de Facultad de Química, UNAM Sitio web:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Colif-tot-fecales-Ecoli-
NMP_6529.pdf

15