INSTITUTO POLITÉCNICO

NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

INGENIERÍA BIOQUÍMICA

LABORATORIO DE METODOS DE ANALISIS

PRACTICA: VERIFICACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO
DE UN ESPECTROFOTÓMETRO.
ALUMNO: SALVADOR HERNANDEZ JUAN

GRUPO: 4IM2 SECCION: 3

PROFESOR: FRANCISCO CARMELO FERNÁNDEZ LÓPEZ

OBJETIVOS
 Evaluar el rendimiento instrumental de un espectrofotómetro
 Verificar la exactitud de la escala de longitud de onda, la presencia de
radiación dispersa, el ancho de banda, la exactitud fotométrica, la
proporcionalidad de respuesta y el rendimiento global del instrumento.

FUNDAMENTO
La obtención de resultados confiables empleando métodos espectrofotométricos,
requiere en primer lugar, verificar que el instrumento de medición está funcionando
correctamente.
La revisión del rendimiento de los espectrofotómetros UV – VIS es indispensable en
el control de calidad. Para llevar a cabo este tipo de comprobaciones es común el
empleo de substancias estándar, cuyas propiedades espectrales han sido
estudiadas cuidadosamente, Posteriormente, se evalúa el funcionamiento del
instrumento en función de los resultados obtenidos del análisis de estos estándares.
Aunque no se han definido claramente cuáles son los parámetros que deben
valorarse para asegurar un funcionamiento optimo, algunos fabricantes y usuarios
han acordado evaluar los criterios que se describen a continuación:
Exactitud en la escala de la longitud de onda.
• En condiciones normales de operación, la mayoría de los instrumentos
mantendrá por un tiempo indefinido una correspondencia entre la radiación
que atraviesa una muestra y el valor de longitud de onda señalado en el
indicador respectivo, sin embargo hay situaciones que es necesario
verificarlo.
• La absorbancia de un cromóforo es medida a la longitud de onda de máxima
absortividad. Si la longitud de onda de calibración de un instrumento cambia,
la absorbancia cambia. La magnitud del error depende de la localización
relativa del punto en el espectro y además del tipo de espectro si es ancho o
estrecho.
Luz dispersa
• Luz dispersa, luz parásita, luz espuria hace referencia a toda la radiación no
contemplada en el control del monocromador, que cruza por la rendija de
salida sin haber pasado a través de la muestra, produciéndose así una
alteración en las estimaciones de absorbancia.
• La radiación parásita se suma al haz transmitido que es captado por el
detector. Con altas concentraciones el error es significativo ya que se
producirán desviaciones negativas a la Ley de Beer.
 • La radiación parásita puede originarse de múltiples maneras: reflexiones
dentro del instrumento, polvo acumulado sobre las lentes, espejos sucios o
corroídos o rallados, grietas o una abertura en el gabinete.
• Dispersión por partículas de polvo.
Puede aumentar por el uso de lámparas y/o detectores inapropiados por tener mejor
respuesta a un rango distinto al de interés
• Métodos para detectar radiación parásita:
1. Filtros de corte rápido
2. Soluciones
Estos materiales tienen una alta transmisión en una parte del espectro pero
súbitamente se vuelven opacos (absorben la mayor parte de la radiación) a partir
de una longitud de onda límite.
Si la cantidad de luz transmitida en presencia de estos filtros se incrementa más
allá del 1% se considera la presencia de luz dispersa.
Exactitud fotométrica
Se define como la exactitud en la medida de Absorbancia, o del % de Transmitancia
en la escala de un espectrofotómetro.
La exactitud en los valores de absorbancia es fundamental cuando no se trabajan
estándares.
Un estándar de absorbancia debe tener una absorbancia constante y estable a una
determinada longitud de onda, ser insensible al ancho de banda.
Métodos empleados:
 Filtro de vidrio neutro que proporciona transmitancias o absorbancias
constantes en un intervalo de longitud de onda.
 Soluciones
Dicromato de potasio
Sulfato de cobalto amónico
Ancho de banda
Denota la fracción de longitudes de onda que cruzan la rendija de salida y producen
una lectura del 50% T alrededor de la longitud de onda de máxima transmitancia.
Algunos espectrofotómetros permiten modificar el ancho de banda, otros lo tienen
fijo, sin embargo es conveniente verificarlo ya que la acumulación de polvo en las
ranuras del monocromador puede provocar su reducción
Muchas desviaciones negativas de la ley de Beer puede deberse al uso de
instrumentos con un ancho de banda muy amplio.
Proporcionalidad o linealidad fotométrica
Es la capacidad de un sistema fotométrico para dar una relación lineal entre la
potencia radiante incidente a su detector y la lectura. Es deseable una relación lineal
entre ambas magnitudes.
La linealidad instrumental es un prerrequisito para la exactitud fotométrica, así como
para la exactitud analítica.
Se pueden utilizar soluciones que sigan la ley de Beer.
 Oxihemoglobina
 Sulfato de cobalto amónico
 Sulfato de cobre.

Una respuesta no lineal entre absorbancia y concentración indica:

-Falla en la fuente de radiación o en el monocromador.
-Falla en el detector
-Radiación dispersa
RESULTADOS
A) Exactitud de la escala de longitud de onda

A.1) Método de filtro de tierras raras (Didimio)

Tabla No..1 Espectro de transmisión del filtro de didimio

Longitud de onda (nm.) %T Longitud de onda (nm.) %T

400 43.5 500 52

410 53.5 510 40
420 55.5 520 29
430 59 530 34
 440 46 540 50
450 47.2 550 65
460 47 560 54
470 44.5 570 30
480 49.5 580 9
490 57.2 590 7

Espectro de transmisión del filtro de didimio

%T

70

60

50

40

30

20

10

0
380 430 480 530 580 630

λ (nm)

Grafica No. 1 Espectro de transmisión del filtro de didimio

Observar el espectro obtenido y señalar aquellas longitudes de onda donde se

presentaron picos y valles.
Maximos minimos (nm)
(nm)
420 440
490 470
550 520
¿Coincidieron los máximos y/o mínimos con las longitudes de onda informadas por
el fabricante? ¿En qué longitudes de onda no fue así?
Todos los máximos, dos de los valles también coincidieron, pero uno de éstos no
coincidió que fue el de 440 nm y deberia ser a 400 nm.
Método de la solución de estándar (NiSO46H2O al 20%)
a) Informe los valores de %T de la solución de NiSO46H2O al 20%
Tabla 2. Espectro de transmisión de la solución de NiSO4 (6H2O) al 20%.
Longitud de onda (nm) %T Longitud de onda (nm) %T

380 3 490 83.5

390 3.5 500 87
400 3.8 510 86
410 4.5 520 83
420 8 530 79
430 19 540 75.7
440 31.5 550 72
450 42 560 66
460 54 570 59.2
470 67 580 51
480 76 590 41.5
 Espectro de transmición de la solución de NiSO46H2O al 20%
%T 100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
350 400 450 500 550 600 650

λ (nm)

Grafica No. 2 Espectro de transmisión de la solución de NiSO4 (6H2O) al 20%.

Verificar la longitud de onda en la que se obtuvo el valor máximo de %T

Fue la de 500 nm
Describe ventajas y desventajas de los métodos empleados en la práctica para
estimar la exactitud de la escala de longitud de onda
Filtro de didimio, ventajas: es preciso y exacto, de rápida determinación,
Solución de NiSO4: es de fácil acceso y preparación.
Desventaja: Para el equipo que se utilizó al ser muy antiguo el filtro es costoso y
difícil de conseguir si se llegara a dañar.

Proporcionalidad fotométrica
Tabla 3. Proporcionalidad entre A y λ para el NiSO4 (6H2O) al 20%.
Longitud de onda (nm) A

530 0.1023
540 0.1209
550 0.1426
 560 0.1804
570 0.2276

A=2-log%T= 2-log79= 0.1023

Grafica A vs. λ (NiSO4 (6H2O) al 20%.)

0.25
A

y = 0.0031x - 1.5508
R² = 0.9607
0.2

0.15

0.1

0.05

0
525 530 535 540 545 550 555 560 565 570 575
λ (nm)

Gráfica 3: Absorbancia contra longitud de onda de NiSO4 (6H2O) al 20%.

Ordenada al origen: -1.5508

Pendiente= 0.0031
r2=0.9607
r= 0.9801
¿Qué se puede concluir respecto a la proporcionalidad fotométrica en este intervalo
de longitudes de onda?
Se cumple la proporcionalidad fotométrica en el intervalo de onda de 530nm y
560nm.
¿Qué relación existe entre la absorbancia y la longitud de onda en ese intervalo de
longitudes de onda?
La absorbancia es directamente proporcional a la longitud de onda
C) luz dispersa
Escribir los valores de %T obtenidos con los filtros de luz dispersa y la solución de
NiSO4 (6H2O) al 20%.
%T a 400nm=4%
%T a 450nm=1.5%
%T a 500nm=1%
¿Qué puede concluir respecto al instrumento que evaluó?
Hay presencia de luz dispersa en el espectrofotómetro que se utilizó ya que los
valores experimentales obtenidos son mas altos que los valores de referencia a
excepción
D) Ancho de banda.
Escribir los datos de %T obtenidos con la solución de NiSO4 (6H2O)
%T a 410nm= 86%
¿Qué puede concluir respecto al ancho de banda del instrumento?
No se presentan problemas con el monocromador del espectrofotómetro.
¿Qué ocurre si él %T disminuye?
Aumenta la absorbancia de la sustancia por lo que podría haber partículas de polvo
en el monocromador y este polvo obstruye la salida de la luz.

E) Exactitud fotométrica.
MÉTODO DEL FILTRO DE TRANSMISIÓN.
Datos obtenidos de %T obtenido con el filtro de vidrio neutro.
%T a 530nm= 86%
¿Qué puede concluir sobre la exactitud fotométrica del instrumento?
Dado que el valor permitido va de 85% a 93%, 86% que fe el valor obtenido entra
en el rango y el instrumento no presenta problema en cuanto exactitud fotométrica.
¿Qué otros métodos se utilizan comúnmente para verificar la exactitud fotométrica
en el UV-visible?
Se utilizan soluciones estándar de dicromato de potasio, para el espectro UV y de
sulfato de cobre, para el espectro visible.
¿Qué puede ocurrir con la exactitud fotométrica si la escala de longitud de onda está
mal calibrada?
No se ve afectada puesto que el filtro da valores de absorbancia o transmitancia
constantes en un intervalo determinado de longitudes de onda.

MÉTODO DE LA SOLUCIÓN DE ESTANDAR DE NiSO4 (6H2O) AL 20%.

Tabla No. 4 Exactitud fotométrica. Método del NiSO4 (6H2O) al 20%.
Longitud de onda. 400nm 500nm
Parámetro.
Absorbancia esperada. 1.45 0.083
Tolerancia aceptada. 1.4-1.6 0.03-0.13
Absorbancia medida. 1.45 0.06

Con base en el resultado obtenido, discuta si el espectrofotómetro tiene exactitud

fotométrica.
Si, ya que la absorbancia medida se encuentra dentro del límite de tolerancia de la
absorbancia esperada.

F) Intervalo dinámico lineal de concentración.

Tabla 6. Intervalo dinámico lineal de la concentración.
Tubo. Concentración de NiSO4(6H2O) A400
a a´ Serie a Serie b
1 1´ 0M 0 0
2 2´ 9.5x10-3M 0.072 0.07
 3 3´ 0.0285M 0.15 0.155
4 4´ 0.0665M 0.3 0.32
5 5´ 0.1045M 0.47 0.475
6 6´ 0.1425M 0.61 0.615
7 7´ 0.152M 0.67 0.68
8 8´ 0.171M 0.74 0.74
9 9´ 0.1805M 0.77 0.76
10 10´ 0.19M 0.8 0.8

C1V1=C2V2
0.19𝑀∗0.2𝑚𝐿
𝐶2 = =9.5x10-3 M
4𝑚𝐿

Curva de calibración del NiSO4

0.9
A

0.8 y = 4.0426x + 0.0427

0.7 R² = 0.9979
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.05 0.1 0.15 0.2

concentracion [M]

Gráfica 4. Curva de calibración de NiSO4 (6H2O).

El intervalo dinámico lineal de concentración es el intervalo de concentraciones en

el que se observa una respuesta lineal entre la absorbancia y la concentración
¿Cómo es el intervalo dinámico lineal con respecto al señalado por el profesor?
El intervalo dinámico lineal señalado va desde 0M hasta 0.19M lo cual corresponde
a lo que se reporta en la gráfica.
¿Qué puede indicar que el intervalo sea menor al esperado?
 Un error al realizar la curva tipo o algún defecto el monocromador, fuente de
radiación o detector.
Tabla 7. Resumen de los resultados de evaluación del funcionamiento del
espectrofotómetro.

Parámetro estudiado Valores de Valores Conclusión Parte del

referencia experimental instrumento a
es evaluar
Exactitud de la escala Se cumplen los tres
de longitud de onda máximos, mientras
que en cuestión de
1. Filtro de didimio
los mínimos dos de
Máximos (λ, nm) 420 nm 420 nm ellos se cumplen ,
pero no el de 400
490 nm 490 nm nm diferido a
550 nm 550 nm 420nm. Por lo que
no establece que
Mínimos (λ, nm) 400nm 440nm haya un error
470 nm 470 nm considerable en el
monocromador.
520 nm 520 nm
2. Solución de Monocromado
NiSO4·6H2O al 20% r.

Máximos (λ, nm) 500 nm 490 nm El máximo no

cumple, el mínimo
Mínimos (λ, nm) 390-400 nm 400 nm sí.
Proporcionalidad Como r=0.959 y se Evalúa la
Fotométrica acerca a 1, además capacidad de
la pendiente es muy respuesta
Datos de regresión de m= 0 m= 0.0031
cercana a 0 lineal del
530 a 570 nm
podemos decir que instrumento.
R=1 r = 0.9801 se cumple linealidad
fotométrica.
Luz Dispersa Como los valores de Monocromado
%T son cercanos a r.
%T a 400 nm (Solución de 0-1%T 2%
cero no hay
NiSO4·6H2O al 20%) Espejos
presencia de luz
sucios.
%T a 450 nm 0 dispersa.
%T a 500 nm 0 Grietas.
Apertura en el
gabinete.
Ancho de Banda 86% Como el valor
obtenido por el
espectrofotómetro
solo difiere en 0.9%
al valor máximo
reportado en el
%T a 510 nm 84 ± 3 86% espectro de Monocromado
absorción el r.
monocromador no
presenta problemas
para este
espectrofotómetro
Exactitud fotométrica La escala del
espectrofotómetro
1. Método del filtro de
es exacta ya que el
vidrio neutro
valor obtenido entra
%T a 530 nm 84%-93% 86% dentro del rango
permitido.

2. Método de la solución Detector.

de NiSO4·6H2O al 20%
Absorbancia a 400 nm 1.5- 2 1.5 Entra en el intervalo,
no hay error en
exactitud.
Absorbancia a 500 nm 0.04- 0.06 0.06 No cumple con el
intervalo
establecido.
Intervalo dinámico
Lineal de Concentración
Se presenta una Monocromado
Datos de regresión lineal m= 0 m= 0.01 relación lineal por lo r
que existe una
r= 1 r= 0.9993 Fuente de
buena codificación
radiación
por parte del lector.
Intervalo de 0.0M – 0 M –0.19M
Detector.
concentración 0.19M
DISCUSIÓN:
Para evaluar la exactitud de la escala de longitud de onda se construyeron espectros
de transmisión que posteriormente también fueron útiles para determinar otros
parámetros como el ancho de banda. Además, se evaluó la proporcionalidad
fotométrica obteniendo un valor de r=0.9801 por lo que se obtuvo una relación lineal
entre la respuesta de mi equipo y la energía radiante absorbida

En la determinación de la exactitud fotométrica se observó que los valores

experimentales coinsidian con los de referencia.
En cuanto al ancho de banda, se supondría que el valor de transmitancia se leyó en
510nm porque son los valores a donde está referido el máximo de transmitancia, no
se presentan problemas con el monocromador del instrumento ya que el limite eran
más menos 3% y nuestra lectura fue de 86%.
La mayor dificultad a la que nos enfrentamos fue que el espectrofotómetro al ser
análogo, la escala no presentaba decimales para los valores de transmitancia y
absorbancia lo que dificultó un poco decidir el valor adecuado para cada lectura.
CONCUSIONES:
-No existen errores significativos en cuanto a la exactitud de la escala de longitud
de onda.
- No hay presencia de luz dispersa en el espectrofotómetro.
- El monocromador no presenta fallas en el espectrofotómetro evaluado.
- Existe buena codificación por parte del detector.
- El detector se encuentra en buenas condiciones.
- Hay una relación lineal entre la respuesta de mi equipo y la energía radiante
absorbida

BIBLIOGRAFIA:
 Anónimo, guía para la verificación de espectrofotómetros uv-visible utilizados
en el análisis de suelo y agua, recuperado de:
https://inta.gob.ar/sites/default/files/script-tmp-
guia_espectrofotmetros_uv.pdf (23/09/18)
 Skoog. Principios de Análisis Instrumental. Ed. Mac Graw Hill. 2002.
Pp.182, 201.

• Whitten, K.W., Davis, R. E., Peck, M.L. Química General Editorial Cengage
Learning 8va Edición. Mexico DF. Pp 1058.