 Siendo escasas las moléculas autofluorecentes, su aplicación más difundida es

para revelar una fluorescencia agregada, como en la detección de antígenos o

anticuerpos. También se puede inyectar moléculas fluorescentes específicas
en un animal o directamente en células y usarlas como marcadores.
 Fluorocromos: Pueden usarse directamente, aprovechando la propiedad de
unirse a determinadas moléculas u orgánulos. Pero lo más habitual es que
estos colorantes se empleen conjugados a otras moléculas, como anticuerpos,
que son capaces de unirse de modo específico a estructuras concretas de la
célula. Algunos colorantes denominados fluorocromos tienen la propiedad de
ser excitados (pasar a un nivel superior de energía) cuando absorben luz
ultravioleta (luz de longitud de onda corta).
 Los objetos fluorescentes aparecen brillantemente iluminados contra un
fondo oscuro, según el color del colorante usado.
 Fuente luminosa (lámpara de mercurio o halógena): Debe emitir la mayor
cantidad de luz ultravioleta en el límite del espectro visible, que atraviesan el
material de la preparación de la misma forma en que lo hace un microscopio
óptico común
 Objetivos: Suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiación ultra-
violeta.
 Filtros: Retienen la radiación ultra-violeta, peligrosa para el ojo humano,
dejando pasar solamente la radiación visible, que no es peligrosa. Existen un
gran número de juegos de filtros de excitación y de emisión para los diferentes
fluorocromos:
 *El de excitación: Ubicada entre la fuente de luz y el preparado. Permite el
paso de ondas de luz con longitud que caiga en el rango azul con el fin que el
preparado sea alcanzado exclusivamente por la luz azul y produzca emisión de
luz fluorescente.
 *El de barrera: Ubicada antes del ocular para prevenir daños retinianos que
podrían ser causados por rayos ultravioleta que escapan el espejo dicrómico.
Corta completamente la luz de excitación no deseada, es decir selecciona la
longitud de onda de emisión del fluorocromo.
 *Espejo Dicroico: Permite la separación de la luz de excitación y la
fluorescencia.
 Posicionado en 45° respecto al eje óptico, la longitud de onda más corta es
reflejada y la longitud de onda más larga lo atraviesa.
 Este microscopio es similar al microscopio convencional, a excepción de que la
luz incidente que procede de una potente fuente atraviesa un primer filtro que
selecciona la longitud de onda capaz de excitar al fluorocromo.
 Otra diferencia radica en que la luz de iluminación (excitación) no está
involucrada en la formación de la imagen. En este sentido la microscopía de
 fluorescencia difiere de la microscopía normal en la cual la imagen es formada
por la luz de iluminación
 FUNDAMENTO FISICO
 La luz de una fuente de longitud de onda múltiple se mueve a través de un filtro
excitador que solo permite que pase la radiación excitada de la longitud de
onda deseada. Esta radiación es reflejada por el filtro dicromático y enfocada
por la lente del objetivo sobre la muestra, las moléculas fluorescentes de la
muestra se excitan y emiten luz (por fluorescencia) de una longitud de onda
específica y mayor. Esta luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa
a través del filtro dicromático y no se refleja. Un filtro de barrera final bloquea
toda la luz residual con la frecuencia de la radiación de excitación. Ejemplo:
 1. Primer filtro de excitación: selecciona la luz de la longitud de onda incidente.
En el esquema está seleccionando luz de longitud de onda entre 450 y 490 nm
(azul)
 2. Espejo dicroico: Refleja la luz de ciertas longitudes de onda y de dejar pasar
otras. En este caso refleja luz de longitud de onda menos de 510 nm (por ello
refleja la luz incidente azul) y deja pasar la luz de longitud de onda superior a
510 nm, dejando pasar la luz verde emitida por el fluorocromo .
 3. Segundo filtro de barrera: Es el filtro que selecciona la luz de longitud de
onda fluorescente. En este caso deja pasar la luz de longitud de onda 520 a
560 nm.
 Entre otros aspectos o fundamentos, importantes a considerar tenemos:
 *El largo de onda de la fluorescencia (emisión) es generalmente más largo que
el largo de onda de la luz excitadora
 *Mientras más larga sea la longitud de onda, más baja es la energía de la luz.
Por lo tanto la energía de la fluorescencia es mas baja que la luz absorbida.
 *La intensidad de la fluorescencia es generalmente mucho más baja que la de
la luz de excitación
 *La fluorescencia se desvanece.
 *Cada substancia posee un espectro de fluorescencia característico.
 APLICACIONES
 1. Autofluorescencia: Detecta la fluorescencia emitida por moleculas de la
muestra misma.
 2.Fluorescencia inducida: Partes específicas de la muestra pueden ser
observadas selectivamente, mediante métodos de tinción. Ej:substancias
específicas como organelos celulares, proteínas, anticuerpos, DNA, RNA, etc.
 3. Sobre objetos bastante más pequeños que la limitación del poder de
resolución, siempre que su emisión de luz sea lo suficientemente intensa. Ej:
molécula de DNA, un virus.
 Es una variación del microscopio de luz ultravioleta en el que los objetos
son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda.
 Fluorescencia: Propiedad de una sustancia de emitir luz al ser expuesta a
radiaciones electromagnéticas.
 Sirve para detectar proteínas en específico en una célula o téjido
 Se usa fluoresceína y rodamina. Colorantes para la microscopía de
fluorescencia.
 permite alcanzar altos niveles de sensibilidad y resolución.
 La fluorescencia es un fenómeno de luminiscencia; propiedad que tienen
ciertos elementos químicos denominados fluoróforos o fluorocromos de emitir
luz visible cuando sobre ellos incide una radiación intensa; en otras palabras,
absorben una luz de longitud de onda determinada, por ejemplo, luz ultravioleta
o luz monocromática azul y posteriormente emiten otra luz de una mayor
longitud de onda de un color, verde, rojo y amarillo. Es un fenómeno de
luminiscencia de corta vida, emitida simultáneamente por la excitación.
 Marcaje de moléculas en células y tejidos para su caracterización e
identificación.
 Estudio de células normales y patológicas.
 Estudio inmunológicos.
 Mineralogía.
 Los lentes suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiación UV
 Existen algunas sustancias que poseen fluorescencia propia, ala que se
denomina
 fluorescencia primaria
 , Por ejemplo de estas que tienen: la clorofila, las porfirinas, algunas vitaminas,
ceras y aceites de inmersión (soloque contengan di felino policromado BCB).
 Actualmente se conoce una gran variedad de fluorocromos y, entre los mas
usados se encuentran: laauramina, la rodamina, el isotiocianato, fluoresceína,
la criflavina y el naranja de acridina

 °
 Fuente de luz,
 la luz emitida por la fuente debe tener la suficiente radiación de aquellas
longitudes de ondarequeridas para la excitación de los fluorocromos.
Generalmente se usa una fuente de mercurio a alta presión(HBO50). Cuando
se quiere excitar con la luz azul, se usa una lámpara incandescente potente de
alógeno(ejemplo Hal 100w).
 °
 Filtro de excitación.
 El filtro de excitación debe permitir el paso de la radiación necesaria o útil para
el métodousado y retener todas aquellas longitudes de onda de la emisión de
la fuente de luz, que son útiles para laexcitación.
 °
 Filtro supresor selectivo o filtro barrera.
 Este retiene la luz de excitación de longitud de onda corta (UV) queno es
absorbida por el espécimen y que podría llegar a los ojos del observador y
ocasionarle daño

https://microscopiosonline.com/microscopio-de-fluorescencia/

LEER BIEN ESTO

LUZ ULTRAVIOLETA
 ASDAD
 La imagen en el microscopio de luz ultravioleta depende de la absorción de esa
luz por las moléculas de la muestra. La fuente de luz ultravioleta tiene una
longitud de onda de 200 nm, por lo tanto puede alcanzar una resolución de 100
nm. La microscopia ultravioleta no es muy diferente del funcionamiento de un
espectrofotómetro pero sus resultados son registrados en fotografías. La
muestra no se puede observar directamente a través del ocular porque la luz
ultravioleta puede dañar la retina. El método sirve para detectar ácidos
nucleicos, proteínas que contienen determinados aminoácidos.
 El microscopio de luz ultravioleta utiliza el rango ultravioleta del espectro
luminoso en lugar del rango visible, bien para aumentar la resolución con una
longitud de onda menor o para mejorar el detalle absorbiendo selectivamente
distintas longitudes de onda de la banda ultravioleta. Dado que el vidrio no
transmite las longitudes de onda más cortas de la luz ultravioleta, los
elementos ópticos de estos microscopios están hechos con cuarzo, fluorita o
sistemas de espejos iluminados. Además, dado que la radiación ultravioleta es
invisible, la imagen se muestra con fosforescencia (véase Luminiscencia), en
fotografía o con un escáner electrónico. El microscopio de luz ultravioleta se
utiliza en la investigación científica.

 La microscopia ULTRAVIOLETA utiliza la luz UV como la fuente para el

microscopio, bastante que luz visible. La luz UV tiene una longitud de onda
entre 180 y 400 nanómetro, que es menos que la longitud de onda de la luz
visible (400-700 nanómetro).
 La potencia de la resolución de un microscopio es directamente proporcional a
la longitud de onda de la luz. Esto significa que es posible observar objetos
 más pequeños con una fuente de luz que tenga una longitud de onda más
pequeña.
 Temprano en el siglo XX, dos científicos de Alemania nombraron agosto Köhler
y Moritz von Rohr, era el primer para desarrollar microscopia ULTRAVIOLETA.
Utilizaron el concepto de la longitud de onda más corta de la luz UV para
ampliar la posibilidad de crear un microscopio con más de alta resolución una
microscopia óptica que tradicional.
 La iluminación se produce por unas lámparas de mercurio. No usa filtros y se
observa en placas fotográficas.
 Este no es un dispositivo para observar directamente la muestra con la vista,
sino que sus resultados se obtienen a través de fotografías.
 Hay dos ventajas principales del uso del microscopio ultravioleta:
 -Resolución de la imagen mejorada
 -Aumento creciente del contraste

 Función y uso del microscopio de luz ultravioleta:

 Se puede decir que este microscopio tiene diversas funciones y una de ellas es
detectar moléculas que tienen la capacidad de ser auto-fluorescentes. Un
ejemplo puede ser la vitamina A

 USO

 Farmacéutica y Biología
 -Localización de cristales de proteínas
 -Control de calidad farmacéutico
 -Formacion de imágenes de dispersión de ingrediente activo
 -Análisis de contaminantes

 Semiconductores y pantallas
 -La investigación de materiales
 -Desarrollo de dispositivos de microfluidos
 - Imágenes de ultra-alta resolución
 -Localización de los contaminantes microscópicos en los dispositivos

 Geología
 - Análisis de petróleo
 -Imágenes de minerales

 Arte
 -Identificación del tinte sobre textiles
 -Imágenes de capa transparente en las pinturas

 Aplicación
 Esta técnica tiene diversas aplicaciones en diagnostico e investigación. Se ha
utilizado en estudios bacteriológicos, virales, parasitológicos. Se ha utilizado en
el estudio de la distribución intracelular de las moléculas.

 Beneficios
 Utiliza el rango ultravioleta del espectro luminoso en lugar del rango visible,
bien para aumentar la resolución con una longitud de onda menor o para
mejorar el detalle absorbiendo selectivamente distintas longitudes de onda de
la banda ultravioleta. Debido a que el vidrio no transmite las longitudes de onda
más cortas de la luz ultravioleta, los elementos ópticos de estos microscopios
están hechos de cuarzo, fuorita.
 Los elementos ópticos se componen de cuarzo y fluorita ya que el vidrio no
puede utilizarse debido a que no transmite la luz ultravioleta.
 La fuente de luz es una lámpara de arco de mercurio aunque también puede
ser xenón.
 Es muy utilizado en ciencia forense para analizar drogas, ADN y estudios de
evidencias en general.

 La luz ultravioleta es absorbida por algunos componentes celulares como los
conocidísimos ácidos nucleicos además, es posible “teñir” las células con
sustancias que sean sensibles a dicha luz. Las mediciones se obtienen gracias
a las longitudes de onda específicas que se utilizan para iluminar la muestra. El
ADN y el ARN se pueden cuantificar por medio de mediciones
espectrofotométricas.
 La imagen se capta en un escáner electrónico
 Sirve para ver cuantificación de ADN, ARN, ver bacterias, visualizar morfología
celular
 Igual a la estructura de un microscopio de fluorescencia tiene fuente de luz,
filtros, objetivos y espejos especiales.
 Lamparas de arco de Xe o Hg
 Todos los elementos ópticos del microscopio, incluyendo las láminas y
cubreobjetos están fabricados de cuarzo o fluorita; no pueden ser de vidrio
puesto que este material no transmite luz ultravioleta.
