Primer informe de la ulceración de la piel causada por Photobacterium damselae subsp.

damselae en pez cebra negro cultivado en jaula (Sebastes schlegeli)

En julio de 2016 y agosto de 2017, hubo dos brotes graves de úlceras cutáneas graves en el pez
roca (Sebastes schlegeli), que se cultivaron en redes en alta mar alrededor de la isla Daqing, China.
Una bacteria patógena fue aislada de las lesiones cutáneas de peces enfermos. Dicho aislamiento
se identificó como Photobacterium damselae subsp. Damselae a través de la observación
morfológica, pruebas fisiológicas y bioquímicas, así como la secuenciación del gen gyrB. La prueba
de desafío artificial confirmó que esta cepa tenía una fuerte patogenicidad para el pez roca negro
y podía causar graves úlceras en la piel. Los síntomas fueron consistentes con los de los peces
infectados naturalmente. Su LD50 de 14 días en para el pez roca negro fue de 8,78 × 102 ufc / g de
peso corporal.

El pez roca negro, Sebastes schlegeli, es un teleósteo vivíparo y rocoso. Peces pertenecientes a
Actinopterygii, Scorpaeniformes, Scorpaenidae, Sebastes (Mori et al., 2003). Generalmente habita
en aguas templadas cercanas a la costa. del noroeste del Océano Pacífico, principalmente alrededor
de las costas de China, Japón y corea. Como importante recurso pesquero marino, la investigación
sobre la cría artificial y la cría de rábano negro se ha iniciado muy a principios de China, Japón y
Corea (Kusakari, 1991; Boehlert et al., 1986; Hyun y Rho, 1996). Debido a su rápido crecimiento, sus
características térmicas y su hibernación natural en agua de mar fría, el pez roca negro se ha
convertido en una de las principales especies de peces domésticos para redes marinas. cultura en
el norte de China (Feng, 2003; Ge, 2006). Isla Daqin, el condado de Changdao, provincia de
Shandong, es la zona de piscicultura más grande de redes de agua de mar en el norte de China. Hay
alrededor de 400 anti-ondas. jaulas de red alrededor de la isla Daqin, y el pez roca negro es el pez
principal especies cultivadas allí. Durante los últimos 20 años de desarrollo, el la escala de la
piscicultura en jaulas netas se ha expandido continuamente. Sin embargo, la aparición de
enfermedades se ha vuelto más frecuente, seriamenteafectando la tasa de supervivencia de los
peces marinos cultivados en esta área. Desde julio de 2016 hasta agosto de 2017, llevamos a cabo
una investigación epidemiológica continua para el pez roca negro en una jaula de red específica del
sitio cerca de la isla Daqin, y se detectaron dos brotes de enfermedades a gran escala en julio de
2016 y agosto de 2017. Los principales síntomas de los peces enfermos. Fueron aletas rojizas,
hiperemia en la base de la aleta y úlceras en la piel. Nosotros colectamos Los peces enfermos,
aislaron una cepa bacteriana patógena de ellos, y realizó una prueba de infección artificial para
confirmar su patogenicidad. Finalmente, esta cepa fue identificada como Photobacterium damselae
subsp. damselae En conjunto, nuestros hallazgos proporcionaron información útil para comprender
la ulceración de la piel de peces de roca negros cultivados en redes marinas.

Materiales y métodos

2.1. Investigación epidemiológica y experimental de peces.

Los peces experimentales fueron recolectados de la misma jaula de red cerca de Isla Daqin,
condado de Changdao, provincia de Shandong. La isla de Daqin era ubicado en medio del estrecho
de Bohai, que estaba a más de 50 km. lejos de la costa continental. La red-jaula para la maricultura
en este área era una gran jaula anti-ola con una circunferencia de 40 m y una Profundidad de 7 m
(fig. 1). Cada jaula contenía aproximadamente 30,000 peces de roca negros con un peso corporal
de 50 a 150 g. Desde julio de 2016 hasta agosto de 2017, Cinco peces fueron recolectados al azar
una vez al mes para un chequeo de salud.

Cuando ocurrió la enfermedad, los peces sintomáticos fueron recolectados como

muestras Todos estos peces recolectados fueron transportados a laboratorio con

Oxigenante para mantenerlos vivos. La temperatura se mantuvo a aproximadamente 20ºC

durante el transporte. En cada tiempo de muestreo

punto, la temperatura del agua en superior (0,5 m), media (3,5 m) y

partes del fondo (7 m) de la jaula de red se midieron simultáneamente.

Los peces utilizados en el experimento de infección artificial para verificar bacterias.

patogenicidad fueron adquiridos de una granja de cría en tierra en

Ciudad de Weihai, provincia de Shandong, con un peso corporal de 37,1 ± 5,0 g.

Fueron criados artificialmente en un sistema de cultivo de agua de mar en interiores.

2.2. Aislamiento de bacterias patógenas.

En el laboratorio, los peces fueron examinados primero por microscopía de luz para verificar si
había parásitos u hongos en la superficie del cuerpo, lesiones y branquias. A continuación, los
peces fueron anestesiados y disecados por manipulación aséptica. La piel ulcerada, el intestino, el
hígado y el riñón se cortaron y homogeneizada con solución de NaCl esterilizada (1,5%), que luego
se cultivado en caldo de soja tríptico (TSB) y sales biliares de citrato de tiosulfato. Placa de medio
de agar con sacarosa (TCBS) que contiene 1,5% de NaCl usando método de inoculación por rayas.
Todas las placas se incubaron a 28 ° C de 24 ha 36 h para observar la morfología de la colonia. Las
colonias individuales más grandes con formas idénticas se consideraron bacterias dominantes.
Uno de ellos fueron seleccionados para la cultura de purificación.

2.3. Verificación de patogenicidad bacteriana.

Las bacterias dominantes aisladas fueron inoculadas en agar TSB.

medio que contiene 1,5% de NaCl y se cultiva a 28 ° C durante 24 h. Culto

Las colonias se lavaron usando una solución esterilizada de NaCl (1.5%) para preparar

suspensión bacteriana. Las bacterias viables (1.9 x 109 ufc / ml) en la suspensión se confirmaron
mediante turbidimetría y gradiente de McFarland

Conteo de placa de dilución. La suspensión bacteriana se diluyó respectivamente a 1,9 x 108.

, 1.9 × 107

, 1.9 × 106

, 1.9 × 105 y 1.9 × 104 cfu /

mL para prueba de infección artificial.

Se cultivaron un total de 240 peces de roca negra en un sistema de cultivo experimental de

interior durante 2 semanas, y se confirmó su estado de salud.

Posteriormente, se dividieron en ocho grupos, incluidos seis grupos experimentales, un grupo de

control negativo y un control en blanco.

Grupo, con 30 peces en cada grupo. Los grupos experimentales se inyectaron con 0,1 ml de
suspensión bacteriana a diferentes concentraciones en

El músculo negro, el grupo de control negativo fue inyectado con 1.5%.

solución estéril de NaCl, y no se administró ninguna inyección en el control en blanco

grupo. La prueba de infección artificial se llevó a cabo durante 14 días, y la

Se observaron regularmente la vitalidad y mortalidad de cada grupo. Si enfermo

O peces muertos aparecieron en los grupos experimentales, fueron recogidos

para aislar las bacterias. Las bacterias aisladas fueron identificadas por el gen gyrB.

secuenciación El LD50 de las cepas identificadas se calculó usando

Método recortado de Spearman-Karber (Hamilton et al., 1977).

2.4. Identificación de cepas bacterianas patógenas.

Las bacterias aisladas de cada muestra fueron identificadas a través de gyrB.

Secuenciación y alineación de genes. Los cebadores del gen gyrB fueron los siguientes: UP-1, 5'-
GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA (C / T) GCAGGGTTG

CAA (A / G) TTCGA-3 ′ y UP-2r, 5′-AGCAGTAGGGGATGTGGGATGTG

GGGCCATGAC (A / G) TCGGTCCGT-3 '. Una colonia individual fue recogida en

50 μL de agua desionizada. Después de una vibración uniforme, se colocó en un metal.

baño e incubado a 99 ° C durante 10 min, seguido de centrifugación a

12,000 rpm durante 1–2 min. El sobrenadante fue recogido y utilizado como PCR.

modelo. La PCR se realizó en un sistema de reacción de 50 μL que consiste en

2 μL de plantilla de ADN, 5 μL 10 × tampón de PCR, 4 μL de dNTP (2,5 mmol / L),

0.5 μL de ADN Taq enzima (5 U / μL), 0.8 μL cada uno hacia adelante y hacia atrás

Imprimaciones (10 μmol / L) y 36.9 μL de agua desionizada estéril. Brevemente, despues

una etapa de desnaturalización inicial a 94 ° C durante 5 min, las amplificaciones fueron

llevado a cabo con 30 ciclos a una temperatura de fusión de 94 ° C durante 1 minuto,

una temperatura de recocido de 55 ° C durante 1 min, y una temperatura de extensión a 72 ° C
durante 1 min. Finalmente, se realizó una etapa de alargamiento adicional a 72 ° C durante 10 min,
seguido de preservación a 4 ° C. La PCR

El producto se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1,0% y se recuperó mediante un kit de

recuperación de ADN en gel de agarosa. El producto recuperado fue

mezclado con la Solución I, se colocó en un baño de metal y se incubó a 16 ° C durante más de 6 h

usando un vehículo pMD18-T para la ligadura. El producto ligado.

se transformó en la célula competente DH-5α y se secuenció por Shanghai

Bioingeniería Co., Ltd. Los resultados de la secuenciación se analizaron en la base de datos del
NCBI. Estas cepas con alta homología de secuencia fueron seleccionadas para

Construcción del árbol filogenético por Mega 6.0 usando la unión de vecinos.

método.

2.5. Caracterización morfológica y fenotípica de las bacterias aisladas.

son

La cepa patógena aislada se inoculó en medio de agar TSB.

Contiene 1,5% de NaCl para evaluar las características morfológicas de

colonias Se seleccionó una colonia individual para la tinción de Gram. Mientras tanto, el

Las colonias individuales se trataron con glutaraldehído al 2,5% para evaluar

Morfología de las bacterias mediante microscopio electrónico de transmisión.

Características fisiológicas y bioquímicas de las cepas bacterianas.

Se identificaron por la reacción bioquímica bacteriana del microtubo comprado.

de Qingdao Haibo Biological Technology Co., Ltd.

La hemólisis de la cepa se probó en medio de agar TSB suplementado con NaCl al 1.5% y sangre de
oveja desfibrinada estéril al 5%. los

Se sumergió una suspensión bacteriana de 1,0 x 108 ufc / ml en un hisopo de algodón para

Mancha en medio de agar sangre. El círculo hemolítico se observó después de

Incubación a 28 ° C durante 24 h.