BILIRRUBINAS (B)

T. Haydée Zúñiga Cáceres

 BILIRRUBINA
Pigmento biliar amarillo naranja formado a partir de la
degradación de:
 Hb de GRs destruidos en bazo, hígado y M.O. 70-90 %

 Hemoproteínas no Hbnicas (Mioglobina, Citocromos

P450, Catalasas, peroxidasas) en hígado: 20-25 %
 Eritropoyesis ineficaz: destrucción prematura de GR

Al exponerla a la luz se forma fotobilirrubina y

ciclobilirrubina (+ solubles).
ICTERICIA indica un increm. en la conc sang. de B.

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La Hb se rompe en 2 partes:
 GLOBINA: Se degrada en aa y se reutiliza

 HEM: anillo que se abre para dar:

 Fe libre q es transport como transferrina

 4 núcleos pirrol, sustrato a partir del cual se forma

la bilirrubina

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 CO Fe

HEMO BILIVERDINA
Hemooxigenasa
microsómica

BILIVERDINA BILIRRUBINA
Biliverdina reductasa
citoplasmática

 Aves, peces y reptiles excretan biliverdina.

 Mamíferos excretan bilirrubina, excepto conejo y nutria.

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Captación de la B x el hígado
En el plasma
B-Alb. x enlaces no covalentes. Se disoc de la Alb. p
entrar al hepatocito y une a proteínas intracelulares y
se conjuga: B-Glucuronato
.Desplazan a la B de la Alb.:
Aumento de B no conj.:
 Agentes de contraste
radiográfico  Kernicterus
 Sulfamidas  An hemolíticas
 Salicilatos
 Furosemida

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Formación de diglucorónido de B
(Conjugación)

Bilirrubina

Glucuroniltransferasa Ácido glucurónico 2

de B UDP

2 UDP

Diglucurónido de B
B. Conjugada o directa

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Diglucuronato de Bilirrubina

Excreción de B
en bilis
Se transporta
mediante gradiente de
conc. dependiente de
energía hacia los
canalículos biliares y
luego a la bilis.

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 La B es transportada x la albúmina.
 Ác. grasos libres, sulfonamidas, salicilatos,
ampicilina impiden la fijación.
 Aum. de B en la sangre, puede atravesar barrera
hematoencefálica y producir daño al Sist. Nerv.
 Requiere conc. muy elevadas o una
hipoalbuminemia.
 B puede unirse irreversiblemente a albúmina
formando γ-bilirrubina o bil-alb. No es eliminada x
riñón, causando elevados niveles de bilirrubina
persistentes.

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 La B es transportada x la albúmina.
 En el hígado, se separa de la alb. y atraviesa memb.
sinusoidal
 En el retículo se conjuga formando complejos:
compuestos mono y diconjugados con el ácido
glucurónico.

 B conjugada ó “directa” y
 B no conjugada ó “indirecta”.

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 Bilirrubina directa

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 Bilirrubina directa
Diazo ácido
Fundamento:
La mayoría de métodos utilizados para det. bilirrubina
utilizan ác. sulfanílico diazotizado, formándose
azobilirrubina coloreada.
En medio acuoso sólo reacciona la B conjugada o
directa. En pcia. de ác.. sulfanílico diazotizado, los
glucurónidos de bilirrubina y la bilirrubina-delta
reaccionan, formándose azobilirrubina que en pH ácido
pta un pico de absorción a 560 ηm.
La azobilirrubina formada es medida entre 540 y 600
ηm, siendo la intensidad del color formado directam.
proporcional a la cantidad de B directa pte en la
muestra.

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Muestras:
Utilizar suero o plasma libre de hemólisis.
Realizar el ensayo dentro de las 2 horas, en
caso contrario refrigerar la muestra entre 2 y 8
°C., ó congelar a -20 °C. para períodos más
largos. Mantener protegidas de la luz.

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Procedimiento
MP Bl react
Muestra 0.1 mL -
React. trabajo 1 1 mL
H2O dest - 0.1 mL
Mezclar e incubar exactamente 3 min. a
temp. amb. ó 1 min a 37 ºC llevando a 0
con el Bl de reactivo

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 BILIRRUBINA TOTAL Y
BILIRRUBINA DIRECTA

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Significación Clínica

La bilirrubina, compuesto de degrad. de la Hb, es cap-

tada x el hígado p. su conjugación y excreción en la
bilis. Las alteraciones hepatocelulares u obstruccio-
nes biliares pueden provocar hiperbilirrubinemias.
La eritroblastosis fetal o an. hemolítica del RN es una
patología provocada por incompatibilidad materno-
fetal en la que se produce una destrucción excesiva
de GRs. Esto resulta en un severo aum. de la B sérica
con el consecuente riesgo de difusión del pigmento al
SNC, x lo q la determ. de bilirrubina en estos RN
resulta súmamente importante.

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Fundamentos del método
La B reacciona con el ác. sulfanílico diazotado
produciendo un pigmento color rojo-violáceo
(azobilirrubina) que se mide a 530 nm.
B conjugada (directa) reacciona directamente con el
diazorreactivo.
B no conjugada (indirecta) requiere la pcia de un
desarrollador ó acelerador (Reactivo A: Benzoato de
cafeína ó metanol), q posibilite su reacción.
B total (conjugada + no conjugada) pte. en la muestra,
debe agregarse benzoato de cafeína al medio de
reacción.

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 Reactivos Provistos

A. Reactivo A: sol. acuosa de benzoato de

cafeína 0,13 mol/L, tamponada y
estabilizada.
B. Reactivo B: sol. de ácido sulfanílico 29
mmol/L y ácido clorhídrico 0,17 mol/L.
C. Reactivo C: sol. de nitrito de sodio 0,07
mol/L.

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Instrucciones para su uso

Reactivo A: listo p usar.

Reactivo B: listo p usar.
Diazorreactivo: de acuerdo al volumen de
trabajo, mezclar:
1 parte de Reactivo C (NO2Na) con
21 partes de Reactivo B (Ác. Sulfanílico).
Rotular y fechar.

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Procedimiento
Bl BD BT
Muestra (suero) 200 200 200 μL
Agua dest 2.5 2.5 mL -
React A - - 2.5 mL
React B 200 μL - -
Diazo React - 200 200 μL

Mezclar inmediata. c/tubo x inversión.

Llevar a “0” con agua dest. y leer a 530 ηm:
BD luego de 5 min exactos y
B.T. a los 15 min.

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 PROCEDIMIENTO
En 6 tubos (1, B1, 2, B2, 3, B3) colocar:
Conc
Tubo St React A Agua Diazo R React B
(mg/L)
1 50 µL 2.6 mL --- 0.2 mL --- 25
B1 50 µL --- 2.6 mL --- 0.2 mL ---

2 100 µL 2.6 mL --- 0.2 mL --- 50

B2 100 µL --- 2.6 --- 0.2 mL ---

3 200 µL 2.6 mL --- 0.2 mL --- 100

B3 200 µL --- 2.6 --- 0.2 mL ---

Al agregar el Diazo R, mezclar inmediatam. c/tubo x inversión.

A los 5 min., leer a 530 ηm, llevando a cero con agua dest.

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 BI = BT - BD

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VALORES DE REFERENCIA

Bilirrubina en suero o plasma

- Adultos:
Directa: hasta 2 mg/L
Total: hasta 10 mg/L

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 Gracias a la HPLC se distinguen 3
alteraciones en el metabolismo de la B:
 Hiperbilirrubinemia no conjugada pura
(Sinds. de Gilbert y Crigler-Najjar)
 Hiperbilirrubinemia predominantemente
conjugada (enf. hepatocelulares o en la
obstrucción hepática)
 Hiperproducción de bilirrubina
(hemólisis y eritropoyesis ineficaz)

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 ICTERICIAS
 Pre Hepáticas: Hemolíticas: Congénitas
Adquiridas
Trast. familiares en el metabolismo de las B
(disenzimáicas)
a) Defecto de captación. Sind. de Gilbert
b) Def. de conjugación Ict. Neonatales
Enf. de Clijer Najjar
c) Def. de excreción Enf. de Dubin Johnson
Enf. de Rotor

 Hepáticas: Ict. Hepatocelulares: Agudas Hepatitis viral,

drogas
Crónicas: Cirrosis
 Post Hepáticas Extrahepáticas (Quirúrgicas)
ó Colestásicas Intrahepáticas (Médicas)

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 BILIRRUBINA DIRECTA (Diazo ácido)
M.P. Bl. R.
Suero (mL) 0.1 ---

Reactivo trabajo (mL) 1.0 1.0

Agua destilada (mL) --- 0.1

Mezclar e incubar EXACTAMENTE 3 min. a temp. amb. (20 a 25

°C) ó 1 min. a 37 °C, llevando a cero el instrumento con el
blanco reactivo.
Δ Αbs. = (Abs. Muestra) – (Abs. Blanco)

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Cálculos:

FACTOR = Conc. Standard o Calibrador

Δ Αbs. Standard o Calibrador

Conc. B.D. (mg/dL) = Factor x Δ Αbs. Muestra

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 BILIRRUBINA TOTAL (DMSO)
M.P. Calibrador Blanco react
Suero (mL) 0.1
CALIBRADOR (mL) --- 0.1
React. Trab. (mL) 1.0 1.0 1.0
Agua dest. (mL) --- 0.1
Mezclar e incubar 10 min. a temp. amb. (20 a 25 °C) ó 6 min a
37 °C , llevando a 0 con el Bl react. El color resultante es
estable por 30 min.

Δ Αbs. = (Abs. Muestra) – (Abs. Blanco)

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Cálculos:

FACTOR = Conc. Standard o Calibrador

Δ Αbs. Standard o Calibrador

Conc. B.T. (mg/dL) = Factor x Δ Αbs. Muestra

B.I. = B.T. - B.D.

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