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Introducción.

Un método rápido y preciso para la estimación


La cuantificación de proteínas es una parte de la concentración de las proteínas es un
esencial de cualquier trabajo de laboratorio que ensayo originalmente descrito por Bradford,
involucre extracción, purificación o análisis de este método se basa en la unión de un tinte a la
proteínas. La cuantificación de proteínas es a proteína. Este método cuenta con un alto
veces necesaria para el aislamiento, separación coeficiente de extinción molar, lo que se traduce
y análisis por cromatografía o técnicas en que la sustancia absorbe la luz de una forma
inmunoquímicas y electroforéticas. muy eficiente a la longitud de onda adecuada
Dependiendo de la precisión requerida y del (Walker, J., 2002).
porcentaje de pureza de la proteína de interés, Debido a que las proteínas difieren en su
diferentes métodos serán apropiados para composición de aminoácidos cada una
determinar la concentración de la proteína responde de manera diferente a cada tipo de
(Hayworth, D., 2010). método de cuantificación. Para lograr una alta
En general para la cuantificación de proteínas eficiencia en la estimación de la concentración
se pueden emplear numerosos métodos. Es total de alguna proteína en muestras
necesario decir que la selección del método desconocidas es esencial incluir una curva de
debe ser cuidadosa ya que en muchas calibración la cual indicará en cierto margen de
ocasiones la presencia de sustancias que correlación una concentración a partir de esta
interfieren genera un ruido al momento de la curva fabricada a partir de estándares de
cuantificación. Entre los distintos métodos se concentraciones conocidas (Hayworth, D.,
pueden nombrar los siguientes: métodos 2010).
espectrométricos, métodos químicos como la Objetivo.
técnica de Kjeldahl mediante el cual se Realizar y comprender el fundamento de una
determina el contenido de nitrógeno o el método técnica de cuantificación de proteínas
de Biuret que se basa en la reacción de las (Bradford) y calcular la concentración de una
muestra problema.
proteínas con sulfato de cobre que absorbe la Metodología.
luz a una determinada longitud de onda, ente Se inició el procedimiento con la realización de
otros métodos (Santiago, S., 2005). una curva de calibración a concentraciones de
0.1, 0.2, 0.3, 0.4 mg/mL en 1 mL, esta curva fue
a partir de una solución con una concentración que en lugar de los 100 µL de solución, se
de 4 mg/mL. Una vez hechas las soluciones de añadió esta cantidad de agua destilada, esto
la curva de calibración se tomó de cada una 100 para usar como blanco. Después se leyó en el
µL y se le adicionó 1 mL de reactivo de Bradford espectrofotómetro a una absorbancia de 595
y se incubo por 5 minutos a temperatura nm.
ambiente, este último proceso se repitió solo
Resultados.
A continuación se muestra la tabla No. 1 en la cual se observan los resultados obtenidos, los cuales
incluyen la absorbancia dada en cada concentración de la muestra, así como su promedio.
En la gráfica No. 1 se muestra la curva de calibración con los promedios de absorbancia obtenidos por
cada equipo, además muestra el coeficiente de correlación y la ecuación de la recta con la cual se
obtuvo la concentración de la muestra problema.
Concentración (mg/mL) Equipo No. Equipo No. 2 Equipo No. 3 Equipo No. 4 Promedio
1
Absorbancia a 595 nm.
0.1 0.41 - - 0.19 0.3
0.2 1.019 0.971 0.386 0.53 0.7265
0.3 1.026 0.756 0.756 0.847 0.84625
0.4 1.444 0.987 0.833 1.002 1.0665
Tabla No. 1.- Resultados en absorbancia de la curva de calibración.

Gráfica No. 1.- Curva de calibración, ecuación de la recta, y coeficiente de correlación.


La ecuación obtenida de la gráfica No. 1 se y verde las cuales absorben a una longitud de
despejó para obtener: onda de 470 y 650 nm respectivamente. En
𝑦 − 0.13 contraste la forma anicónica es el azul, el cual
𝑥=
2.4193 se une a la proteína, este azul absorbe a 595
En esta ecuación se sustituye Y por la
nm, con lo cual se entiende que se cuantifica el
absorbancia de la muestra problema que en
azul de este colorante. El colorante aparece
este caso fue:
cuando se una a residuos de arginina y lisina en
- Muestra problema No. 1 = 0.769.
la proteína, esta unión es un enlace iónico o
- Muestra problema No. 2 = 0.212.
salino, dado que la arginina y lisina son
Y se obtuvo una concentración de:
aminoácidos cargados de forma positiva
- Concentración real de problema No. 1 =
(cationes) y el colorante está cargado de forma
0.264125 mg/mL.
negativa (anión).
- Concentración real de problema No. 2 =
Además Stephenson menciona que la
0.03389 mg/mL.
intensidad de absorción depende del contenido
Discusión.
de aminoácidos básicos y aromáticos. Las
Los resultados de la curva de calibración
interferencias o no existen o son mínimas por
muestran mucha variación, es por eso que se
cationes tanto sodio como potasio y
decidió sacar un promedio y graficar a partir de
carbohidratos como la sacarosa. Otras
este. Los dos datos faltantes en la
sustancias que interfieren en el ensayo son los
concentración de 0.1 de los equipos 2 y 3
agentes fuertemente alcalinos (fácilmente
reflejan la variación de los datos, estos
solucionable con la utilización de buffers). Los
resultados pueden deberse a ciertos factores
únicos componentes encontrados que dan una
sin embargo los demás datos demuestran que
excesiva interferencia en el color del ensayo,
la mencionada variación no fue causada solo
son altas concentraciones de detergentes como
por algún factor si no que fueron varios factores
el SDS, Triton X-100, etc.
los que congeniaron para que estos resultados
Conclusión.
se dieran de esta manera.
Se cumplió con los objetivos propuestos para la
Según Kruger, N. (2002) la reacción para el
práctica dado que se logró realizar la técnica de
ensayo de Bradford se da entre el colorante
cuantificación de Bradford y además mediante
Coomasie Blue g250 y la proteína. Menciona
la realización de este reporte se logró
también que diversos estudios dicen que el
comprender el fundamento de esta técnica.
colorante libre puede existir en 4 diferentes
Además mediante los datos obtenidos en la
formas iónicas cuyos pKa son 1.15, 1.82 y 12.4.
práctica se logró calcular la concentración de
De las tres formas cargadas del colorante se
una muestra problema a partir de una curva de
encuentran las catiónicas que son de color rojo
calibración. Debido a los resultados tan
variables obtenidos se puede decir que la overview. United Kingdon: University of
manera en que se aplicó el método no es Oxford.

buena, pero dada la investigación bibliográfica • Stephenson, F. (2008). Measuring


protein concentration by colorimetric
que indica que el método tiene un alto
assay. Calculation for molecular biology
coeficiente de extinción lo cual es
and biotechnology.
imprescindible para aumentar la sensibilidad en
la medición de proteínas y que la unión
colorante-proteína es un proceso muy rápido,
dos minutos, y el complejo permanece estable
durante un tiempo relativamente largo, una
hora, haciendo de este un proceso muy rápido,
y que no requiere un tiempo crítico para el
ensayo, además de que es un método muy
reproducible se puede llegar a la conclusión de
que el método de Bradford es un método muy
recomendable para la cuantificación de
proteínas, siempre y cuando se lleve de una
manera correcta.
Bibliografía.
• Hayworth, D. (2010). Assays methods.
Overview of protein assays methods.
U.S.: Thermo Scientific Pierce.
• Santiago, S. (2005). Separación y
determinación de proteínas.
Contribución a la determinación de la
fracción de metales traza ligados a las
proteínas similares a las metaloproteínas
en muestras de mejillón. España:
Universidad de Santiago de Compostela.
• Walker, J. (2002). The protein
quantitation. The protein protocols
handbook. New Yersey: University of
Hertfordshire.
• Kruger, N. (2002). Sample preparation
for protein assays. Protein methods