DEFENSAS ANTIMICROBIANAS

DE PLANTAS SUPERIORES:
“Un caso de aplicación”

GIFUJ Julio Armando Pedrozo Pérez

Profesor Asociado
Departamento de Química
Pontificia Universidad Javeriana
Bogotá – Colombia
2003
CULTIVO DE PAPA

(Guasca – Cundi.)
 FLORICULTURA

El cultivo de plantas ornamentales se ha convertido en Colombia,

en una de las industrias de mayor crecimiento, debido a la gran
demanda internacional de flores de excelente calidad y sanidad.

Constituye uno de los rubros de mayor importancia de la econo-

mía nacional, generando divisas comparables a las producidas
en años precedentes por el petróleo o el café.
 FLORICULTURA EN COLOMBIA

Colombia posee una combinación única de condiciones topográficas

y de temperatura, que permiten la producción intensiva de más de 30
tipos de flores cultivadas en invernadero, desde rosas, pompones,
crisantemos, astromelias, girasoles y claveles, hasta las más
exóticas, como heliconias y el “ave del paraíso”.
FITOPATÓGENOS

Hongos Fitopatógenos
Alternaria
Aspergillus
Rhizoctonia
Colletotrichum
Sphaerotheca
Fusarium
Botrytis

Bacterias Fitopatógenas
Pseudomonas
CONTROL QUÍMICO
AGRICULTURA ORGÁNICA
 SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS

1. SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS CONSTITUTIVAS

☼ INHIBIDORES
☼ POSINHIBIDORES

2. FITOALEXINAS
ECOSISTEMA PARÁMO

Páramo de Guasca (Guasca – Cundi.)

VEGETACIÓN DEL SUBPÁRAMO
 PROYECTO

ESTUDIO QUÍMICO Y EVALUACIÓN DE LA

ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA Y ANTIBACTERIANA
DE PLANTAS AUTÓCTONAS DE PÁRAMOS
COLOMBIANOS
Investigadores:
Rubén Darío Torrenegra Guerrero
Julio Armando Pedrozo Pérez

COLCIENCIAS/U. JAVERIANA, código 1203-05-394-95, CT-128-97

 TEST BIOAUTOGRÁFICO
Medio de cultivo + Medio de cultico +
Microorganismo Cromatograma invertido
Cromatogramas

Refrigeración / 18 horas

Incubación Retirar CCD

Zonas de inhibición
Comparación de resultados
con duplicado de CCD
Medición de Rf y zonas de
inhibición
Especies vegetales A.AB A.AF
Dipolostephium phylicoides - -
Diplostephyum revolutum - -
Senecio formosus b,c b,c
Senecio pampae b.c b,c
Pentacalia corymbosa - b,c
Pentacalia ledifolia - b,c
Pentacalia pulchella - b,c
Bejaria aestuans - -
Gaultheria anastomosans b -
Pernettya prostrata - -
Vaccinium floribundum - -
Cavendishia cordifolia - -
Lupinus paniculatus - -
Calamagrostis effusa - -
Baccharis tricuneata - -
Espeletia grandiflora a,b -
Espeletia argentea a,b -
Espeletiopsis corymbosa a,b -
Ageratina vacciniaefolia a,b b
Ageratina fastigiata a,b b
Ageratina tinifolia a,b b
Pentacalia corymbosa (Benth.)Cuatr.
(Guasgüín- Huasgüín)
Pentacalia ledifolia (H.B.K)Cuatr.
(Guasgüín- Huasgüín)
 EXTRACCIÓN DEL VEGETAL
Extracto:
Sustancias de la superficie foliar

200 g de hojas frescas se lavaron por 3 min en CHCl3

(5 ml/g); el solvente fue removido por filtración y
concentrado al vacío; el residuo obtenido se trató con
Me2CO y enfrió a 4 ºC durante 12 h. El flóculo fue
removido por filtración y, el filtrado resultante, fue
concentrado y secado al ambiente.

El extracto se guardó en nevera a 4ºC para

evaluarle luego su acción antifúngica
EXTRACCIÓN CON PETRÓLEO

• El material vegetal, previamente lavado con CHCl3,

fue secado al ambiente y luego pulverizado.

• A 600 g, se le extrajo con éter de petróleo durante

72 h, al cabo de las cuales fue filtrado y
concentrado al vacío.

• El extracto se trató con Me2CO y, después de 12

h de reposo se filtró a mínimo volumen y se secó
al ambiente.

El extracto se guardó en nevera a 4 ºC, para evaluar

luego su acción antifúngica.
EXTRACCIÓN CON ETANOL

• El material desengrasado se extrajo por

percolación en frío con EtOH 96% v-v.

• El extracto resultante se trató con agua, se

filtró y al filtrado obtenido se le fraccionó L/L
con CHCl3 y luego con AcOEt.

Las fracciones se concentraron, se secaron al

ambiente y se guardaron a 4 ºC para evaluarles,
posteriormente, su acción antifúngica.
MÉTODO DE CRECIMIENTO
RADIAL EN PDA

Extracto vegetal Medio de cultivo

Inóculo
Incubación / 6 días

Medición de los diámetros

de las colonias
 CIM EN mg/ml DE EXTRACTOS DE ESPECIES
DE PENTACALIA, ANTE HONGOS FILAMENTOSOS
Extractos F. solani A. solani R. solani C. gloeosp. T. viride
1h-Pc 1,9 2,0 2,0 2,0 2,4
2h-Pc 2,0 2,2 2,5 2,4 2,6
2f-Pc 2,1 2,4 2,4 2,4 2,6
2r-Pc 2,2 2,4 2,4 2,4 2,6
3h-Pc 1,9 2,2 2,1 2,1 2,5
3f-Pc 2,1 2,4 2,3 2,1 2,5
3r-Pc 2,2 2,4 2,3 2,3 2,5
1h-Pl 1,9 2,0 2,0 2,0 2,3
2h-Pl 2,0 2,2 2,3 2,4 2,6
2f-Pl 2,2 2,4 2,4 2,4 2,6
2r-Pl 2,4 2,4 2,4 2,4 2,6
3h-Pl 2,0 2,2 2,1 2,1 2,5
3f-Pl 2,1 2,4 2,4 2,1 2,5
3r-Pl 2,4 2,4 2,3 2,3 2,5
 EXTRACTO DE MAYOR
ACCION ANTIFÚNGICA

Procedimiento:

Se extrajeron 800 g de hojas frescas por maceración en frío con

CHCl3, durante 8 días; el material se extrajo una segunda vez
durante 2 días más. Los extractos se mezclaron, se concentraron
y se trataron con Me2CO. Los filtrados se concentraron, se redi-
solvieron en mezclas hidroalcohólicas y se extrajeron L/L con
CHCl3.
Estos extractos se rotularon como FCA y se guardaron en nevera
a 4 ºC.
 CIM EN mg/ml DE LA FCA DE ESPECIES
DE PENTACALIA, ANTE
HONGOS FITOPATOGENOS

Extractos F. solani A.solani R. solani C. gloeosp. T.viride

FCA-Pc 1,1 1,1 1,1 1,1 1,2

FCA-Pl 1,2 1,2 1,2 1,2 1,3
RECONOCIMIENTO DE PROBLEMAS
FITOPATÓGENOS
Sphaerotheca pannosa var. rosae (Ascomicetes)

Parásito obligado

Causante del mildeo polvoso en el fruto del du-

rasno, fresa y mora; es la enfermedad de mayor
severidad y diseminación en cultivos de rosa en
invernadero y en campo abierto.
La forma más corriente es la asexual, designada
como Oidium leucoconium.

La forma sexual presenta cleiostecios globosos con unos peque-

ños apéndices miceloides de color café; contienen 8 ascosporas.

Las esporas asexuales (conidias) son producidas en gran número y

son prácticamente responsables de la propagación y diseminación
de la especie.
 Mildeo polvoso del rosal
Los síntomas tempranos son un leve levan-
tamiento, como una ampolla, a menudo, en
áreas rojas en la superficie de la hoja.
El micelio (con conidióforos) aparece como
manchas discretas en la superficie de las
hojas jóvenes, las cuales se vuelven curva-
das, deformes y, comúnmente, se recubren
de un polvo blanco llamado.

Ataca las espinas en su base; a los tallos en las partes más tiernas;
a las hojas jóvenes en toda su superficie; a las flores en los pedún-
culos, en sépalos y receptáculos, especialmente cuando la flor aún
no está abierta.

El daño reduce el crecimiento de la hoja, el valor estético de la

planta, la eficiencia en la fotosíntesis y, por consiguiente, el desa-
rrollo.
 BIENSAYO in vivo PARA HONGOS
PARÁSITOS OBLIGADOS
Invernadero: dividido en naves de aproximadamente 1.000 m2 y, confor-
mada cada una por 15 a 20 camas. Sólo se utilizaron 6 de estas camas,
cada una conteniendo 280 plantas en periodo de floración. Éstas camas
fueron distribuidas según un diseño de bloques al azar con aleatoriza-
ción restringida
Evaluación: la evaluación del daño del hongo sobre las plantas se rea-
lizó de acuerdo a una escala de calificación, correspondiente a porcen-
tajes de ataque entre 0 y 50%.
Aspersión: se utilizó una bomba de presión constante, previamente de-
sinfectada y calibrada. Se utilizó el método de aplicación en escuadra.
Muestras experimentales: se utilizaron soluciones acuosas de extrac-
tos de especies de Pentacalia, adicionando un adherente especial
(Pegal 0,5%).
Análisis: se realizó la prueba de “t” y el análisis de varianza (ANOVA)
que permite comparar más de dos medias poblacionales.
APLICACIÓN DE LA
FRACCIÓN ACTIVA
MÉTODOS DE SEPARACIÓN E
IDENTIFICACIÓN
MÉTODOS DE SEPARACIÓN
•|Cromatografía en capa delgada preparativa
• Fraccionamiento sobre lecho de sílica
• Cromatografía en columna flash
• Cromatografía en columna de sílica
• Cromatografía en columna de sephadex

MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN
• Espectrofotometría ultravioleta
• Espectrometría de masas
• Resonancia Magnética Nuclear
CUMARINAS DE LA SUPERFICIE FOLIAR
FITOPATÓGENOS

Hongos Fitopatógenos
Alternaria
Aspergillus
Rhizoctonia
Colletotrichum
Sphaerotheca
Fusarium
Botrytis

Bacterias Fitopatógenas
Pseudomonas
 SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS

1. SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS CONSTITUTIVAS

☼ INHIBIDORES
☼ POSINHIBIDORES

2. FITOALEXINAS
ECOSISTEMA PARÁMO

Páramo de Guasca (Guasca – Cundi.)

VEGETACIÓN DEL SUBPÁRAMO
Especies vegetales A.AB A.AF
Dipolostephium phylicoides - -
Diplostephyum revolutum - -
Senecio formosus b,c b,c
Senecio pampae b.c b,c
Pentacalia corymbosa - b,c
Pentacalia ledifolia - b,c
Pentacalia pulchella - b,c
Bejaria aestuans - -
Gaultheria anastomosans b -
Pernettya prostrata - -
Vaccinium floribundum - -
Cavendishia cordifolia - -
Lupinus paniculatus - -
Calamagrostis effusa - -
Baccharis tricuneata - -
Espeletia grandiflora a,b -
Espeletia argentea a,b -
Espeletiopsis corymbosa a,b -
Ageratina vacciniaefolia a,b b
Ageratina fastigiata a,b b
Ageratina tinifolia a,b b
Pentacalia corymbosa (Benth.)Cuatr.
(Guasgüín- Huasgüín)
 EXTRACCIÓN DEL VEGETAL
Extracto:
Sustancias de la superficie foliar

200 g de hojas frescas se lavaron por 3 min en CHCl3

(5 ml/g); el solvente fue removido por filtración y
concentrado al vacío; el residuo obtenido se trató con
Me2CO y enfrió a 4 ºC durante 12 h. El flóculo fue
removido por filtración y, el filtrado resultante, fue
concentrado y secado al ambiente.

El extracto se guardó en nevera a 4ºC para

evaluarle luego su acción antifúngica
EXTRACCIÓN CON PETRÓLEO

• El material vegetal, previamente lavado con CHCl3,

fue secado al ambiente y luego pulverizado.

• A 600 g, se le extrajo con éter de petróleo durante

72 h, al cabo de las cuales fue filtrado y
concentrado al vacío.

• El extracto se trató con Me2CO y, después de 12

h de reposo se filtró a mínimo volumen y se secó
al ambiente.

El extracto se guardó en nevera a 4 ºC, para evaluar

luego su acción antifúngica.
EXTRACCIÓN CON ETANOL

• El material desengrasado se extrajo por

percolación en frío con EtOH 96% v-v.

• El extracto resultante se trató con agua, se

filtró y al filtrado obtenido se le fraccionó L/L
con CHCl3 y luego con AcOEt.

Las fracciones se concentraron, se secaron al

ambiente y se guardaron a 4 ºC para evaluarles,
posteriormente, su acción antifúngica.
 CIM EN mg/ml DE EXTRACTOS DE ESPECIES
DE PENTACALIA, ANTE HONGOS FILAMENTOSOS
Extractos F. solani A. solani R. solani C. gloeosp. T. viride
1h-Pc 1,9 2,0 2,0 2,0 2,4
2h-Pc 2,0 2,2 2,5 2,4 2,6
2f-Pc 2,1 2,4 2,4 2,4 2,6
2r-Pc 2,2 2,4 2,4 2,4 2,6
3h-Pc 1,9 2,2 2,1 2,1 2,5
3f-Pc 2,1 2,4 2,3 2,1 2,5
3r-Pc 2,2 2,4 2,3 2,3 2,5
1h-Pl 1,9 2,0 2,0 2,0 2,3
2h-Pl 2,0 2,2 2,3 2,4 2,6
2f-Pl 2,2 2,4 2,4 2,4 2,6
2r-Pl 2,4 2,4 2,4 2,4 2,6
3h-Pl 2,0 2,2 2,1 2,1 2,5
3f-Pl 2,1 2,4 2,4 2,1 2,5
3r-Pl 2,4 2,4 2,3 2,3 2,5
 EXTRACTO DE MAYOR
ACCION ANTIFÚNGICA

Procedimiento:

Se extrajeron 800 g de hojas frescas por maceración en frío con

CHCl3, durante 8 días; el material se extrajo una segunda vez
durante 2 días más. Los extractos se mezclaron, se concentraron
y se trataron con Me2CO. Los filtrados se concentraron, se redi-
solvieron en mezclas hidroalcohólicas y se extrajeron L/L con
CHCl3.
Estos extractos se rotularon como FCA y se guardaron en nevera
a 4 ºC.
 CIM EN mg/ml DE LA FCA DE ESPECIES
DE PENTACALIA, ANTE
HONGOS FITOPATOGENOS

Extractos F. solani A.solani R. solani C. gloeosp. T.viride

FCA-Pc 1,1 1,1 1,1 1,1 1,2

FCA-Pl 1,2 1,2 1,2 1,2 1,3
MÉTODOS DE SEPARACIÓN E
IDENTIFICACIÓN
MÉTODOS DE SEPARACIÓN
•|Cromatografía en capa delgada preparativa
• Fraccionamiento sobre lecho de sílica
• Cromatografía en columna flash
• Cromatografía en columna de sílica
• Cromatografía en columna de sephadex

MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN
• Espectrofotometría ultravioleta
• Espectrometría de masas
• Resonancia Magnética Nuclear
CUMARINAS DE LA SUPERFICIE FOLIAR
CUMARINAS DE LA SUPERFICIE FOLIAR

CH3O CH3O

HO O O O O O

Escopoletina 7-O-geranilescopoletina
FITOQUINOLES DE LA SUPERFICIE FOLIAR
 QUINOLES DE PENTACALIA

O O

4 4
5 3 5 3
2
O 2
O
6 6
1 1
CH3 CH2.CH3
HO 7
8 O HO 7
8 O

Jacaranona Etiljacaranona

(1-hidroxi-4-oxo-2,5-ciclohexandienil) acetato ...

JACARANONA
MÉTODO DE CRECIMIENTO RADIAL
Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum
 SUSTANCIAS ANTIFUNGICAS

Sustancias CIM en μg/ml

F.oxysporum B.cinerea

Escopoletina 120 120

7-geraniloxilescopoletina 90 90
Jacaranona 660 650
Metiljacaranona 650 650
INDUCCIÓN DE ESCOPOLETINA
PATÓGENO PLANTA BIBLIOGRAFÍA

Virus del mosaico Tabaco Best, 1944

Virus Tomate Andreae, 1948
Virus Papa Uritani, 1953
Ceratostomella
Papa Hoshiya, 1958
fimbriata
Helicobasidium Papa Fang, 1988
mompa
Phytophthora Papa Hofer, 1984
infectans
Pseudomonas Tabaco Paxton, 1944
solanacearum

También se ha encontrado ser inducidas por

nemátodos e insectos
 JACARANONA
Marcada acción citotóxica y antitumoral
* Activo a 2 mg/kg sobre el sistema leucemia linfocítica P338
* Solamente acción citotóxica marginal (ED50) a niveles de
2,1 μg/ml)
Acción inhibidora del crecimiento de
Spodoptera litura (Lepidoptera)

Concentraciones inferiores a 1000 ppm

Mecanismos: como reactivos electrofílicos están implicados

con intermediarios de la fosforilación oxidativa y en reac-
ciones de eliminación. Pueden sufrir ataques nucleofílicos
posiblemente por constituyentes celulares con grupo-S de
una enzima clave.
 PENTACALIOSIDOS
O
3''
4''
5'' 2''
1''
6'' OH
H 2''' O
H C
1''' O H 11
6' 5 4
10
H H H CH3O 3
O 6
HO 4' 2
5' 1
HO 3' 2' OH O 7 8
9 O O
H 1'
H H
 ASIGNACIONES DE LAS SEÑALES DEL
ESPECTRO 1HNMR DE PENTACALIÓSIDO A

O δ 6,32
H
H δ 7,52
H
H OH
H O
δ 7,05
δ 3,10 H C δ 5,14 H H δ 7,68
δ 3,23 δ 3,73
O H δ 4,74
CH3O
δ 4,14H H δ 4,40 H δ 6,37
HO
HO
O O O
HO OH H
HH δ 4,34 H δ 7,59
δ 4,38 δ 5,73

(1-hidroxi-4-oxo-2,5-ciclohexandienil) acetato de 6’-escopolinilo

 ASIGNACIONES DE LAS SEÑALES DEL
ESPECTRO 1HNMR DE PENTACALIÓSIDO B
O H δ 2,35; 2,95
H
H H
δ 2,14; 2,31
H H
H
OH
H H O
δ 7,05
δ 3,10 H C δ 5,14
δ 3,23 δ 3,73
H H δ 7,68
O H δ 4,74
δ
CH3O
δ 4,14H H 4,40 H δ 6,37
HO
HO
O O O
HO OH H
HH δ 4,34 H δ 7,59
δ 4,38 δ 5,73

(1-hidroxi-4-oxo-ciclohexanil) acetato de 6’-escopolinilo

 CONCLUSIONES

1. Sobre la superficie foliar de Pentacalia corymbosa

existen sustancias “protectoras” contra hongos e
insectos.
2. Estas sustancias mostraron estructuras de tipo
cumarínico y quinólico.
3. Las cumarinas aisladas fueron la escopoletina y
la 7-O-geranilescopoletina.
4. Los quinoles aislados fueron la jacaranona y la
etiljacaranona.
 AGRADECIMIENTOS

• PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

• COLCIENCIAS

• UNIVERSIDAD DE STRATHCLYDE
(Glasgow – Escocia)

• INSTITUTO DE INMUNOLOGIA
(Bogotá – Colombia)