Milieux de culture : classification, composition et préparation

I. Introduction :
La plupart des techniques bactériologiques : isolement, identification, conservation, numération des
bactéries, nécessitent l’utilisation de milieux de culture.
Les microorganismes exigent pour leur nutrition et croissance des éléments nutritifs et énergétiques
qui leurs sont fournis par des milieux de culture.
Le bactériologiste doit choisir les milieux adaptés aux recherches envisagées et aux exigences des
bactéries en cause.

II. Définition :
Un milieu de culture est un mélange de substances utilisées comme nutriments pour la croissance et
la multiplication des microorganismes.
La concentration en nutriments doit permettre une croissance optimale :
- Ni trop faible : la bactérie cultive mal.
- Ni trop forte : milieux toxique.
La composition du milieu varie à l’infini. Elle est choisie en fonction du but à attendre et des besoins
de la bactérie.

III. Qualités exigibles d’un milieu de culture :

Certaines qualités sont indispensables a un milieu pour favoriser le développement bactérien ;elles
concernent :
1) La composition : les milieux de culture doivent contenir quantitativement et qualitativement
les aliments exigés pour la croissance et l’entretien des microorganismes et assimilables par
eux :
 Aliments essentiels azotés et carbonés.
 Eléments minéraux : macroéléments (S,P Mg, Na, Cl… ) et oligoéléments (Cu,Zn,Mn)
 Facteurs de croissance (métabolites essentiels que la bactérie est incapables de synthétiser).
 Facteurs stimulants ou facteurs de départ dont la présence accélère le rythme de la multiplication
bactérienne ou permet l’adaptation à un milieu artificiel d’une bactérie isolée d’un milieu naturel.
 Tampons : phosphates, acétates, citrates.
 Agents sélectifs, gélifiants.. ..
2) Le PH : en général les bactéries ne se développent qu’à un PH voisin de la neutralité (7 à
7,6) ;certains d’entre elles exigent ou supportent un PH particulier (applications à leur
isolement ou leur identification).
3) L’isotonie : elle correspond pour la plupart des milieux à celle d’une solution de Nacl à 9 %0 .
4) Le potentiel redox : les bactérie sont des exigences strictes,en rapport avec leur type
respiratoire.
5) Le taux d’humidité ; l’eau est nécessaire au métabolisme bactérien ; les milieux doivent en
contenir une quantité suffisante.

IV. Classification des milieux de culture :

A. Classification d’après l’utilisation :
C’est le mode de classification le plus souvent adopté, on distingue 4 types principaux de milieux :
1. Milieux usuels dits «de base»: bien que d’emploi aussi général que possible, ils ne peuvent permettre
la culture de toutes les bactéries.il n’existe pas de milieux de culture universel ;le choix d’un milieu
usuel est en général fonction de l’habitat naturel des bactéries à isoler :
-milieux à base d’extraits de viande (culture des germes commensaux et pathogènes de l’homme et
des animaux).
-milieux à base de lait,d’extraits végétaux utilisées en bacteriologie alimentaire,…
2. Milieux d’isolement :
Ils peuvent être , suivant les techniques envisagées et les bactéries en cause :
-les milieux de base précédemment cités
-des milieux enrichis de produits biologiques
-Des milieux électifs ou sélectifs de la destinés à favoriser la croissance d’une ou plusieurs espèces
bactériennes particulières.
 Un milieu électif est un milieu sur lequel on observe une culture abondante et rapide de certaines
bactéries , alors que la plupart des espèces s’y développent peu et lentement.
 Un milieu sélectif est un milieu qui ne permet la croissance que d’une espèce bactérienne ou d’un
groupe d’espèces bactériennes, la croissance des autres batteries est entravée ou inhibée.

L’effet sélectif est obtenu en jouant sur les facteurs physico-chimiques, pression osmotique, PH.. par
l’action bactériostatique ou bactéricide de certaines substances : sels minéraux, substances
colorantes, ATB …ou en apportant au milieu, comme source unique de carbone et d’energie,un
composé organique qui n’est pas assimilé par les autres espèces ou genres bactériens.
Exemple : milieu loeffler a base de sérum coagulé pr corynébacterium diphteriae.
3. Milieux d’identification :
Ils permettent par la mise en évidence des caractères biochimiques des bactéries, de résoudre les
problèmes d’identification différentielle qui se posent entre des espèces ou des genres voisins :
Milieu viande-foie, MEVAG, Clark et Lubs , mannitol-mobilité, TSI, KIA, citrate de Simmons, Moller et
Falkow, Ferguson, king A et B…
4. Milieux de conservation :
Ce sont des milieux pauvres qui maintiennent les bactéries dans un état de vie ralentie.
5. milieux d’enrichissement : permettent l’obtention d’une multiplication importante des rares
bactéries présentes dans un prélèvement pauci microbien. (cœur-cervelle, milieu liquide de
Chapman et bouillon Giolitti-cantoni pour s.aureus, Muller-Kaufmann pour salmonelles, rappaport
pour yersinia, TGY pour anaérobies… .)
6. Milieux de transport : milieu Amies pour neisseria, Cary Blair pour gram- et anaérobies, Stuart pour
pathogènes exigeants ; neisseia,haemophilus…
7. Milieux pour antibiogramme : MH, MH au sang, HTM…

B. Classement selon la consistance :

- liquides - solides ou gélifiés - semi-liquides ou faiblement gélosés
C. Classement d’après la composition :
1. Milieux naturels ou empiriques :
De composition complexe, mal définie, ils peuvent être :
-d’origine animale ; lait, sérum, bouillon et gélose nutritifs..
-d’origine végétale : peptone de soja, pomme de terre, eau de levure….
2. Milieux synthétiques :
 Ce sont des solutions de corps chimiques purs dans l’eau distillée, leur composition constante est
donc strictement définie et peut être théoriquement adaptée aux exigences nutritives de chaque
espèce bactérienne. Ces milieux sont utilisés :
-pour l’étude des exigences nutritives et des besoins en facteurs de croissance des bactéries .
-pour la mise en évidence des propriétés métaboliques particulières,(=milieux d’id).
-pour le dosage microbiologique de vitamines, d’acides aminés …

3. Milieux semi-synthétiques :
Ils contiennent, outre des substances chimiques de nature et proportions déterminées, des produits
d’origine naturelle aussi définis que possible, la plupart des milieux utilisés actuellement sont des
milieux semi-synthétiques.

D. Classement d’après le mode de stérilisation :

Cette classification, la plus ancienne, reposait surtout à l’origine sur la présence ou l’absence d’une
albumine coagulable par la chaleur et distinguait les milieux albumineux (non autoclavables) et les
milieux albumineux (autoclavables), certains milieux utilisés actuellement (ex=urée) contiennent des
substances hydrolysables par la chaleur, ce qui empêche leurs stérilisation à l’autoclave.ils sont
stérilisés par filtration sur membrane.

V. Préparation des milieux de culture :

A. Mode général de préparation :

Pour se procurer les milieux de culture qui lui sont nécessaires , le bactériologiste à le choix entre
diverses possibilités ,choix tenant compte :
-de l’équipement du laboratoire en personnel et en matériel
-du rythme d’utilisation
-Du prix de revient
-de la nature du milieu
-des possibilités d’approvisionnement.
Sont actuellement commercialisés :

1) Des milieux « prêts à l’emploi », conditionnés en boites de pétri (milieu pré coulé) ou en tubes
2) Des milieux « prêts à l’emploi », non conditionnés sous leurs formes définitives, mais en flacons de
30ml à 1L ; le cout est moins élevé que précédemment, les délais de conservations des milieux plus
longs, mais il faut prévoir un service de préparation plus important et surtout des possibilités de
stockage.
3) Des milieux déshydratés qui réunissent un grand nombre d’avantages ; conservation aisée, prix de
revient avantageux, préparation simplifiée peut être confiée à une personne moins spécialisée.

B. Constituants fondamentaux :

1) Macérations et extraits de viande :

En laissant séjourner dans l’eau des tissus animaux (muscles, foie, etc.) on obtient une solution riche
en sels minéraux vitamines hydrosolubles, protéines peu dégradées et glucides.

L’extraction aqueuse peut se faire :

 -à froid : c’une macération
-à chaud (100) : décoction, ou infusion
2) Extraits de levure :
Les extraits de levure, commercialisées sous forme déshydratée, sont préparés à partir de levures de
boulangerie ou de brasserie qui ont été :
-soit autolysées à 50° en présence d’une solution hypertonique de chlorure de sodium.
-soit hydrolysées à 75° en milieu acide.
Les extraits de levure sont très utilisés comme source d’acides aminés et de vitamines hydrosolubles ;
ils remplacent souvent actuellement les extraits de viande ou leur apportant un complément
vitaminique.ces milieux à base d’extraits de levure supportent mal les autoclavages prolongés à haute
température .
3) Peptones
4) Agar-agar, ou gélose (nutritive) :
Définition : l’agar-agar est un extrait desséché d’algues rouges récoltés dans les mers du japon ou de
nouvelle –Zélande ; ce mucilage est capable d’absorber et gélifier 300 à 500 fois son poids d’eau
Chimiquement l’agar est un poly galactoside constitué de molécules « entremêlées » ; 90 % environ
de galactose sous forme D et 10% sous forme L .
L’agar à la propriété de gélifier, de solidifier les milieux liquides dans lesquels on l’incorpore.
5) Produits biologiques utilisés en bactériologie :
Ces produits sont en général incorporés aux milieux de base, mais ils sont parfois utilisés seuls.
ils ne sont pas autoclavables. Ils doivent être exempts d’antibiotique.
 Sang : la saignée doit être effectuée, quel que soit l’animal choisi, le matin à jeun (pour éviter la
bactériémie post prandial) et dans des conditions d’asepsies parfaites.
Le sang pourra être utilisé :
-pour enrichir certains milieux de culture : gélose au sang cuit, au sang laqué ;
-pour étudier le pouvoir hémolytique des bactéries.
-pou préparer l’extrait globulaire.
 Sérum :le sérum en soi est un mauvais milieu pour la plupart des bactéries, mais :
-il favorise la culture des souches sérophiles
-il entre dans la composition de milieu à usage particuliers (loeffler).
- n’être que peu acidifiant, de ne pas renfermer d’enzymes pouvant fausser certains réactions
d’identification.
 Bile de bœuf :la bile a une action sélective vis-à-vis de salmonella dont elle favorisé la culture, alors
qu’elle joue un rôle inhibiteur pour la croissance de nombreuses espèces bactériennes. Elle est
également utilisé pour l’identification de streptococcus du groupe D et S.pneumoniae.
 Gélatine : est obtenue par hydrolyse ménagée de certains tissus (peau , os …)riches en collagène .doit
être secondairement purifié et décolorée. Utilisée pour l’étude du pouvoir protéolytique des
bactéries.
 Œuf : utilisée pour la recherche de la lécithinase. Comme constituant de certains milieux d’isolement
(loewenstein-jensen)
 Lait : est utilisé comme constituant :
- Des milieux destinés à la culture des bactéries lactiques (bactériologie alimentaire)
- De certains milieux d’identification classiques : étude de la digestion de la caséine ….
 Pomme de terre : utilisé comme :
- Milieu d’identification
- Milieu pour la culture de bacille tuberculeux.
 C. Techniques général de préparation des milieux :
 Préparation à partir des ingrédients de base :
 Lecture et interprétation de la formule de base : on doit vérifier
- Qu’aucun des constituants n’a été oublié
- Que la nature et la qualité des produits correspondent à celles indiquées sur le formulaire
- Que les proportions de chaque constituant correspondent à la quantité totale de milieu prévu ont
été bien calculées.
 Pesée
 Dissolution : à chaud ou à froid .l’ordre dans lequel les ingrédients doivent être mélangés
peut être important. Les milieux gélosés doivent être agités jusqu'à dissolution complète des
composants.(ne jamais utiliser de matériel en cuivre ou en aluminium)
 Ajustement du PH :il est indispensable d’ajuster le PH avant la stérilisation. Une variation,
même légère, peut modifier et parfois même inhiber la culture des bactéries
La mesure du PH se fait par méthode colorimétrique soit en utilisant des papiers indicateurs,
soit en utilisant des réactifs colorés en solution.
 Filtration, répartition (tubes, flacons) et bouchage( coton, capsules métalliques…).
 Stérilisation : elle se fait dans la majorité des cas à l’autoclave.les conditions d’autoclavage
(durée et température à sont indiquées pur chaque formule de préparation.
Contrôle de stérilité :les milieux sont maintenus pendant 48h à l’étuve à 37°a vant leur
utilisation .
 Stockage.
 Préparation à partir de milieux déshydratés :
 Si le milieu renferme de la gélose, attendre 5min en agitant de temps en temps, avant de le
porter à ébullition. Tous les milieux contenant de la gélose doivent macérer quelques
minutes dans l’eau distillée froide pour permettre à la gélose de s’hydrater .
 Mettre la quantité de poudre désirée dans la moitié de volume d’eau distillée nécessaire
selon les proportions indiquées sur l’étiquette ;
 Mélanger soigneusement, puis ajouter le reste d’eau en rinçant les parois du récipient,
chauffer jusqu'à dissolution complète. Maintenir l’ébullition le moins longtemps possible
 Laisser refroidir à 50-60° et bien agiter avant de distribuer dans d’autres récipients.ne jamais
agiter une gélose bouillante.
 Stérilisation et conservation.

VI. Principaux milieux utilisés en bactériologie :

A. Milieux nutritifs ordinaires :
1) Eau peptonée : c’est un milieu liquide qui permet la croissance des bactéries sans
exigences particulières. Utilisé également pour la recherche d’indole et l’étude des
fermentations sucrées.
Formule : eau distillée (1L), peptone trypsique (15g), Nacl (5g)

2) Bouillon nutritifs ou bouillon peptoné

Formule : macération de viande (1L), peptone trypsique (15g),Nacl ou Kcl (5g)
- croissance des bactéries a partir d’un inoculum faible.
3) Gélose nutritive : cette gélose n’est qu’un bouillon nutritif solidifié par addition
d’agar-agar.
4) Variantes de la gélose nutritive :
-gélose molle à 3 à 4%0 g d’agar
- gélose sans peptone - gélose peptone de gélatine sans Nacl
 B. Milieux de base actuels :
Ces milieux d’isolement enrichis ou non, permettent d’avoir une croissance de plus en plus rapide

1) Milieux à base de peptones trypsiques de caséine et papainiques de soja :

Commercialisés sous les appellations de Trypticase-soja, Trypt-caséine-soja, … ces milieux
permettent :
-la culture de microorganismes exigeants avec un temps de latence très diminué :streptococcus,
pasteurella, listeria, brucella, anaérobies strictes.
-base pour gélose au sang
- test de lyse par la bile possible en 6hà8h (streptococcus pneumoniae)

2) Milieux contenant de l’amidon :

L’amidon joue un rôle protecteur que nutritif : il neutralise les substances toxiques contenues dans les
milieux ou élaborées au cours de la cultural et auxquelles sont sensibles certaines bactéries fragiles .
 Milieux columbia :
Ces milieux, mis au point pour l’isolement du streptocoque, constituent aujourd’hui des milieux de
base de grande valeur. Par addition de sang, agents sélectifs ou de produits accélérateurs de
croissance ,il est possible de préparer différents milieux spéciaux pour la culture, l’isolement et
l’identification des germes dans les prvts de gorge, crachats, pus. ..
Les zones d’hémolyses sont particulièrement nettes sur gélose Columbia
Ce milieu peut servir de base pour la mev de toxine par c .diphteriae
Le bouillon Columbia est un excellent bouillon d’hémoculture
- mélange de peptones+amidon+ Nacl ± agar.

 Milieu de Mueller-Hinton :
- Infusion de viande de bœuf+hydrolysat de caséine+amidon+glucose.
-Etude de la sensibilité aux ATB et au composé vibriostatique O129.
-isolement de neisseria pathogènes après adjonction éventuelle d’ascite ou de sang et d’un mélange
VCN ou VCF.

3) Milieu cœur-cervelle :
- infusion de cervelle de veau+ cœur de bœuf+peptone de gélatine + Nacl +phosphate
di sodique+glucose.
-le bouillon cc est un excellent bouillon d’hémoculture

4) Milieux enrichis de produits biologiques :

Bouillon et gélose peuvent être enrichis par addition de 5à 10% de sang, de sérum, liquide d’ascite ou
d’extrait globulaire ces substances peuvent être indispensables à la vie de certaines bactéries
 Gélose au sang frais :
- milieu de base : tryticase soja, Columbia+ sang défibriné de mouton ou de cheval
- milieu d’isolement riche
- hémolyse β : totale, hémolyse α partielle.

 Gélose au sang cuit :

En portant le sang à une température voisine de 75°, on neutralise des inhibiteurs naturels auxquels
certains bactéries peuvent être sensible de plus des facteurs de croissance sont libères dans le milieu
grâce au chauffage. la GSC présente l’inconvénient de ne pas pouvoir servir évidemment a l’étude de
l’hémolyse
 Gélose chocolat :
Un milieu dont la composition est proche de celle du MH, dans lequel a été incorpore avant
autoclavage 1% d’hémoglobine
L’ajout d’un mélange poly vitaminique avant répartition et après refroidissement permet d’obtenir
des milieux supplémentés (polyvitex ,vitox)
 Supplément G : 15 a 20% (sérum de cheval, extrait de levure, extrait globulaire, glucose)
 Adjuvant stérile GC (fractions de levures, glucose, bicarbonate de sodium)
 Supplément XV 1%
Gélose chocolat +mélange d’ATB =milieu Thayer et martin (neisseria pathogenes)
 Autres milieux :
-la gélose-ascite
La gélosé-sérum
La gélosé à l’extrait globulaire

C. Milieux sélectifs :
1. Pour Entérobactéries :
 Gélose Drigalski :
 Isolement des bactéries gram négatives non exigeantes
 Milieu contenant du lactose (purification des entérobactéries lac+,sac - )
 Le cristal violet et le desoxycholate de Na contenus dans ce milieu inhibent la plupart des
bactéries gram positives.
 Inhibition partielle de l’envahissement par les proteus.
 Gélose MacConkey :
 Ce milieu permet d’éliminer la flore secondaire des produits poly-microbiens grâce à l’action
de 2 inhibiteurs : le cristal violet et les sels biliaires qui permettent la sélection des
entérobactéries.
 Milieu contenant du lactose
 L’utilisation de ce milieu est recommandée pour isoler et dénombrer les entérobactéries
dans les eaux, le lait, les matières alimentaires, les urines. ..
 Milieu Hektoen :
 milieu de choix pour l’isolement des salmonelles, shigelles et autres bactéries pathogènes.
 la présence d’extrait de levures et de sucres, la qualité des peptones favorisent la croissance
des salmonelles et shigelles même fragiles : des sels biliaire assurent le pouvoir sélectif en
limitant le développement des coliformes et de proteus
 indicateurs colorés : bleu de bromothymol et fuschine acide
 Milieu contenant du lactose, saccharose, thiosulfate et citrate de fer ( H2S).

 Gélose SS (salmonelles-shigelles) :
 inhibiteurs des grams + : sels biliaires, vert brillant
 concentration élevée en citrate de Na ce qui rend difficile la croissance des autres grams-

 Gélose desoxycholate- citrate –lactose : ( même principe que SS )

 Gélose au vert brillant :
 Isolement des salmonelles autres que thyphi

 Milieu de Wilson blair :

 Au sulfite de bismuth + vert brillant
 Isolement des salmonelle .

 Milieu CIN (cefsulodine Irgasan Novobiocine ) :

 Isolement de Yersinia entercolitica
 Le cristal violet, les sels biliaires et l’irgasan inhibent les bactéries gram+ , alors que la
cefsulodine et la novobiocine inhibent la plupart des gram - .

 Milieu EMB : (Eosine bleu de méthylène)

 Isolement des BGN
 Desoxycholate lactosé :
 Dénombrement des coliformes en bactériologie alimentaire

 TTC Tergitol :
 Dénombrement des coliformes en bactériologie des eaux
 Tergitol : sélection des coliformes+ inhibition de l’envahissement par le proteus
 TTC : chlorure de triphényltétrazolium qui permet de mettre en évidence le pouvoir
réducteur des bactéries.

 Bouillon lactosé au vert brillant :

 Dénombrement des coliformes dans le lait et les aliments
 Test de confirmation de E.coli à 44° par fermentation du lactose (trouble), production de
gaz

 Milieu de Schubert :
 Pour coliformes et confirmation de E.coli à 44° par fermentation du lactose (trouble),
production de gaz et production d’indole partir de tryptophane contenu dans le milieu.

2. Pour Pseudomonas :
 Gélose au cétrimide :
 milieu pauvre contenant un antiseptique « cétrimide »+ acide nalidixique
 Favorise la production de pigments par P.aeruginosa.

3. Pour Campylobacter :
 Gélose de Karmali :
 Columbia+ charbon activé +Hémine +pyruvate de Na+ CFP+ Vanco+cycloheximide
 Gélose de skirrow :
 gélose au sang de cheval +triméthoprime+polymyxine B +Vanco
 Milieu de Butzler :
 bacitracine, cycloheximide, CS, CF et novobiocine

4. Pour Vibrio :
 TCBS (thiosulfate citrate bleu de bromothymol et saccharose)
 forte concentration en bile et en citrate +PH élevé = élimination de nombreuses bactéries
 GNAB : gélose nutritive alcaline et biliée

5. Pour staphylococcus et micrococcus :

 Milieu Chapman :
 Croissance des germes halophiles (fortes concentration en Nacl)
  Fermentation du mannitol= virage au jaune du rouge de phenol
 Milieu de Baird Parker :
 contient une base nutritive riche+ accélérateurs de croissance : pyruvate de Na et glycocolle
+ 2 inhibiteurs : chlorure de Li et tellurite de K
 Milieux de Vogel-Johnson :
 Mêmes inhibiteurs que Baird Parker, forte concentration en glycocolle, contient du mannitol
+rouge de phénol

6. Pour streptococcus :
 Gélose au sang + azide de Na (inhibe les gram-) == strpto D et B
 Gélose au sang + acide nalidixique+colistine
 Gélose bile esculine (strepto D)
 Milieu de Slanetz et Bartley ( pour strepto D)
7. Pour neisseria :
 Milieu Thayer et Martin :
 gélose chocolat+supplément riche en vitamines+CS+nystatine+vancomycine
8. Pour brucella :
 Milieu de Farrell :
 TSA +vanco+ bacitracine +polymyxine +nystatine.
9. Pour Bordetella :
 Bordet-Gengou
10. Pour corynébateriun diphteriae :
 Milieu de Tinsdale :
 Tellurite : inhibition de la croissance de la flore secondaire
 Cystéine et thiosulfate : formation d’H2S
11. Pour anaérobies :
 Gélose TSN :
-pour anaérobies sulfito-réducteurs
 Columbia + acide nalidixique +colistine
 Gélose Schaedler + 5% sang de mouton :
 Croissance des BGN anaérobies en particulier : bacteroides et prevotella
 Milieu sélectif bacteroides bile esculine :
 Pour bacteroides du groupe fragilis et B . Wadsworthia
 Milieu au cristal violet-érythromycine :
 pour fusobacterium
12. Pour Mycobactéries :
 Lowenstein-jensen : milieu gélosé à l’œuf coagulé =vert de malachite comme inhibiteur

D. Milieux d’enrichissement :
 Milieu cœur cervelle
 Milieu liquide de Chapman pour Staphylocoques
 Milieu de Rothe (azide de Na) pour streptocoques
 Milieu de Litskey (azide de Na+ cristal violet) pour streptocoques
 Bouillon Giolitti- Cantoni : bouillon d’enrichissement anaérobie pour S .aureus
 Todd-Hewitt pour streptocoques
 Milieu Muller Kaufmann pour salmonelles (bouillon au tétrathionate qui inhibe la
croissance des coliformes et autres bacterie de la flore intestinale.
 Bouillon de Leifson pour salmonelles (au sélénite qui inhibe la croissance des
coliformes et Entérocoques dans les 12 premiers heurs)
VII. Conclusion :
Un milieu de culture doit apporter les éléments nutritifs nécessaires à la croissance bactérienne.
Comme les besoins nutritionnels des microorganismes et les conditions de leurs développent sont
variés, il n’existe aucun milieu universel sur lequel tout les microbes sont capables de se multiplier.
Le choix du milieu adéquat repose sur la connaissance de l’habitat naturel et de la physiologie
alimentaire du germe à cultiver ou à identifier.