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Nutrition

 Définition
Nutrition bactérienne: c’est l'analyse des besoins élémentaires, énergétiques et
spécifiques nécessaires au fonctionnement et à la croissance de la bactérie,
ainsi que des facteurs physico-chimiques susceptibles de les influencer.

I) Les besoins élémentaires

L’eau : L'eau représente 80 à 90 p. cent du poids cellulaire. Il entre dans la


composition de tous les milieux de culture. C’est une source d’H2 et d’O2

Le carbone : c’est un des éléments les plus abondant de la bactérie ; il doit être
fourni en quantité suffisante.
• autotrophes.
• Les batéries capables de se développer avec le C02 comme seule
source de carbone
• hétérotrophes.
• Les bactéries qui exigent comme source de carbone des composés
organiques préalablement élaborés (l’acide acétique, l’acide
lactique, des sucres divers, …)
L'azote : les substances azotées entrent dans la des protéines bactériennes.
L’azote peut être fixé par la bactérie :
 Sous forme d’azote moléculaire, c.à.d la forme la plus simple
Ex : Rhizobium- Azotobacter et certains Clostridiums
 Sous forme de composés inorganiques :
ex : nitrites (Nitrobacter), sous forme de sels d’ammonium
(Nitrosomonas).
 Sous forme de composés organiques: dont les groupements aminés
représentent la source d’azote
Phosphore
Le phosphore est nécessaire en tant que constituant des acides nucléiques et
de l'ATP. Les sources peuvent être minérales ou organiques.
Soufre
Le soufre entre dans la composition des acides aminés, des protéines. Les
sources de soufre peuvent être minérales (S, SO , thiosulfates, etc.) ou
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organiques.
L’O2 et l’H2 : sont apportés par l’eau et par l’air atmosphérique
- En plus faible quantité sont apportés les éléments minéraux

 Certaines interviennent dans l’équilibre physico-chimique de la


cellule : Na, K, Mg et Cl
 D’autres constituent les enzymes ou les coenzymes : Fer des
cytochromes.
A l’état de traces, souvent apportés par l’eau : on les appelle les oligo-éléments
car ils sont indispensables en quantité infime : Ce sont Ca, Mg, Co, Cu, Mn
II) Les besoins énergétiques :

Ils couvrent les dépenses engagées dans les processus catabolisme et de


biosynthèse.
III) Substances spécifiques :

 Ces substances sont nommées facteurs de croissance. Ce sont des


vitamines, des acides aminés et des bases puriques et pyrimidiques.
 Les bactéries qui doivent trouver ces facteurs de croissance dans leur
alimentation auxotrophes.
 Les bactéries qui n'ont pas besoin de tels facteurs
prototrophes.

Classe du besoin Nature du besoin Type trophique

Rayonnement lumineux Phototrophe


Source d'énergie
Oxydation de composés organiques ou Chimiotrophe
inorganiques
Minéral Lithotrophe
Donneur d'électrons
Organique Organotrophe

Composé minéral Autotrophe


Source de carbone
Composé organique Hétérotrophe

Non nécessaires Prototrophe

Facteurs de croissance
Nécessaires Auxotrophe

 Les bactéries d’intéret médical sont chimio organotrophes et


peuvent être auxotrophes ou prototrophe.
3. Les facteurs influençant la croissance :

a)La Température
- les bactéries mésophiles dont la croissance est possible de 10 à 45°C mais
ayant une température optimale de croissance comprise entre 30 et 37°C et
parmi lesquelles se trouvent la plupart des bactéries d’intérêt médical,
- les bactéries psychrophiles poussant de -15 à 20°C (optimum : 5-10°C)
(exemple : Listeria monocytogenes, agent de la listériose, dont la croissance est
optimale à la température des réfrigérateurs),
- les bactéries psychrotropes températures de croissance proches de 0°C avec
optimum de croissance proche des bactéries mésophiles. Ex. (: Pseudomonas)
- les bactéries thermophiles poussent de 45 à 70°C,
- les bactéries hyperthermophiles pouvant croître à des températures > à 80°C.
Le pH :
 Neutrophiles :bactéries se développent à pH compris entre 6 et 8 (exemple
: Escherichia coli)
 Alcalinophiles bactéries développent préférentiellement à pH alcalin
(>8) (exemple : Pseudomonas).
 Acidophiles dont la croissance est optimale à pH acide (<6) (exemple :
Lactobacillus).
La pression osmotique : les bactéries ont une bonne tolérance générale au sel.
Certaines bactéries dites halophiles nécessitent du chlorure de sodium
(NaCl) pour leur croissance ; d’autres sont dites halotolérantes.
La pression mécanique ou hydrostatique : les bactéries ont une bonne tolérance
générale à la pression ; certaines espèces vivants dans les grands fonds
marins supportent une pression très importantes et sont dites barophiles.
L’oxygène moléculaire
1. Les bactéries aérobies strictes (exemple : Pseudomonas) nécessitant une
teneur en oxygène moléculaire suffisante pour pouvoir se multiplier,
 2. Les bactéries micro-aérophiles (exemple : Campylobacter) se
développant uniquement lorsque la teneur en oxygène moléculaire est
réduite,
 3. Les bactéries aéro-anaérobies facultatives (exemple : Escherichia
coli) dont la croissance n’est pas affectée par la concentration en oxygène
moléculaire,
 4. Les bactéries anaérobies strictes ne se développant qu’en absence
d’oxygène
Milieux de culture
 Un milieu de culture est une préparation au sein de laquelle des micro-
organismes peuvent se multiplier. Il doit donc satisfaire les exigences
nutritives du micro-organisme étudié ce qui implique :
La composition de base de ces milieux comprend :
• des substrats nutritifs : acides aminés, peptides, bases nucléiques, sucres, …,
• un système tampon assurant la constance du pH
• des sels minéraux,
• des vitamines,
• d’autres facteurs de croissance pour certaines bactéries dites exigeantes : sang,
protéines, hémoglobine,vitamines supplémentaires.
On distingue différents critères de classification

1- la composition chimique : permet de distinguer les milieux en 3


groupes
 - Naturels ou complexes : à base d’extraits de matière organique,
afin d’apporter tous les nutriments nécessaires y compris les
facteurs de croissance
 - Semi-synthétiques : milieu synthétique auquel on rajoute de
l’extrait de levure comme source de facteurs de croissance
 - synthétiques : qui possède une composition chimique bien
définie. ex : Citrate de Simmons
2- La consistance : distingue les milieux en 3 groupes, en fonction de la
concentration en Agar du milieu :
 -milieu liquide : ex bouillon de BGT bouillon gélose tamponé
,flacon d’hémoculture
 milieu solide ou gélosé: ex gélose au sang

 -milieu semi-liquide ou faiblement gélosé : ex milieu Mannitol-


mobilité
 milieu semi-liquide ou faiblement gélosé : ex milieu Mannitol-
mobilité
 les milieux d’identification ex milieu TSI
 -les milieux de conservation
 -les milieux de transport ex milieu TGV

La croissance bactérienne

Définition : C’est l’accroissement ordonné de tous les composants


d’un organisme
 chez les organismes unicellulaires (bactéries, levures), elle aboutit à une
augmentation du nombre d’individus
 La bactérie se multiplie par fission binaire : la bactérie grandit puis se
divise en deux cellules filles séparées par un septum de division formé par
la paroi cellulaire. Durant la division, l'ADN se duplique ainsi que les
autres constituants. Divers systèmes enzymatiques de synthèse et de
dégradation participent à la division cellulaire.
 La croissance bactérienne est caractérisée par :
 le temps de génération : le temps requis pour un dédoublement du
nombre de bactéries. Ex E.coli : TG=20mn, M.tuberculosis=20h
 le taux de croissance comme le nombre de divisions par unité de
temps heure (ex : 3 pour E.coli)
 Au cours de la croissance, le milieu s’appauvrit en éléments nutritifs
disponibles et s’enrichit en produits du catabolisme, souvent toxiques
 Des modifications y surviennent, touchant le PH, le potentiel redox, la
pression osmotique.

a- Dénombrement direct des bactéries : les bactéries sont considérées


comme des particules que l’on dénombre à l’état frais ou après coloration
a-1- Numération totale : on utilise pour cela :
L’examen au microscope à l’aide d’une cellule hématimétique : on compte
toutes les bactéries.
a-Dénombrement direct des bactéries:
1-Numération totale:
 Examen au microscope à l’aide d’une cellule hématimétrique.
 Mesure automatisée avec un compteur de particules. La mesure
automatisée avec un compteur de particules, des bactéries en suspension
dans une solution d’électrolyte : on compte aussi bien les bactéries que
des particules de même taille
 La méthode d’épi fluorescence : les bactéries sont colorées par un
flurochrome.
 Cette coloration permet le comptage de toutes les cellules bactériennes
(bactéries totales) sans distinction les vivantes et les mortes.
 Méthode d’épi fluorescence :
Echantillon
filtration
coloration/acridine-orange
lumière bleue

Dénombrement Bactérien par


Microscope à épifluorescence.
a-2- Numération des cellules viables
 Les bactéries cultivables forment des colonies sur un milieu de culture
approprié : on utilise la culture en boites de pétri.
 Inconvénient : plusieurs cellules agglomérées peuvent ne donner
qu’une seule colonie.
 De nombreuses cellules isolées ne forment pas nécessairement
de colonie.

 On peut utiliser la technique de filtration sur membrane, qui concentre les


bactéries présentes en faible quantité dans un échantillon liquide (ex :
Colimétrie des eaux
 On peut utiliser la technique de filtration sur membrane, qui concentre les
bactéries présentes en faible quantité dans un échantillon liquide (ex :
Colimétrie des eaux

b-2- Mesure de la densité optique (DO)


On évalué la DO du milieu de croissance en fonction du temps, à une longueur
d’onde donnée. En utilisant la loi qui définit les relations existant entre les
intensités d’un faisceau lumineux avant et après la traversée d’une culture
bactérienne, on peut évaluer la croissance bactérienne en déterminant la densité
optique de la culture bactérienne.

b-3- Technique de la Cytométrie en flux : Elle consiste à mesurer un ou


plusieurs paramètres spécifiques d’une cellule isolée, entrainée par un flux
liquide. Cette technique est couramment appliquée en hématologie .Elle est
encore en cours d’évaluation en microbiologie
C- Marqueurs chimiques : Il s’agit de dosage des protéines, DNA, ATP,
peptidoglycane
La croissance d'une bactérie s'étudie en milieu liquide. Il existe 6 phases dont
l'ensemble constitue la courbe de croissance
les applications de l’étude de la croissance bactérienne :

5-1 Application au dénombrement bactérien


Le dénombrement des bactéries par unité de volume d’échantillon analysé se fait
après culture et permet d’apprécier la quantité de bactéries viables.
L’ensemencement d’un volume défini d’échantillon sur milieu de culture gélosé
permettra, après dénombrement des colonies bactériennes obtenues après
incubation, de calculer les bactéries présentes dans l’échantillon analysé. Le
résultat est exprimé en Unités Formant Colonie par millilitre (UFC/ml).
5.3. Application à l’identification bactérienne
L’identification des bactéries repose sur l’étude de leur croissance en
présence de divers substrats ou étude du métabolisme bactérien, on peut
ainsi étudier le métabolisme protéique ou le métabolisme glucidique des
bactéries par exemple. La combinaison des différents résultats obtenus
permet de définir le profil métabolique de la bactérie analysée ce qui permet
de l’identifier
5-3. Application à la détermination de la sensibilité / résistance bactérienne
aux antibiotiques
L’étude de la croissance bactérienne en présence de différents antibiotiques
permet de définir pour chaque bactérie analysée un profil de sensibilité
/résistance aux différentes molécules antibiotiques.
1.Métabolisme biochimique bactérien
 Objectif: L'étude du métabolisme bactérien permet de définir des
caractères d'identification biochimique qui représentent des critères
essentiels dans la classification (ou Taxonomie) bactérienne.
 1- Définition : Il est défini comme l'ensemble des transformations
chimiques (réactions de biosynthèse et de dégradation), qui assurent
l'élaboration des constituants bactériens et leur fonctionnement.
Il comprend des réactions:
 De dégradation de substrats (catabolisme)
 De biosynthèse de substrats (anabolisme).
Ces deux types de réactions nécessitent l’intervention de catalyseurs qui sont des
enzymes.
 Les réactions cataboliques: permettent à la bactérie de convertir les
aliments ( Protéines , Lipides , Polysaccharides) en molécules organiques
simples ou métabolites intermédiaires + énergie.
 Les réactions anaboliques: C’est la biosynthèse à partir de ces molécules
simples de macromolécules intervenant dans la structure et le
fonctionnement bactérien .
L’énergie utilisée dans ces biosynthèses provient du catabolisme.
2.Métabolisme énergétique
d’une bactérie chimioorganotrophes est constitué d’une suite de réactions
REDOX partant d’un substrat organique . avec libération d’énergie.
Le composé organique peut être:
 Un hydrate de carbone ( surtout le glucose+++) source la plus importante
d’énergie
 Un acide aminé
 Un acide gras
 Un alcane
 Une base purique ou pyrimidique
L’énergie produite au cours du catabolisme par le biais de réactions
EXERGONIQUES est emmagasinée dans des molécules d’ATP grâce à des
réactions dites ENDERGONIQUES (absorbent l’énergie) ou immédiatement
consommée dans une réaction qui nécessite de l’ATP, Pour éviter toute perte
d’énergie sous forme de chaleur.
a-La respiration
b-La fermentation
A-La respiration (lieu membrane cytoplasmique) C’est la
consommation d’oxygène moléculaire, elle correspond à une série de
transfert d’électrons jusqu'à un accepteur final qui est l’oxygène
moléculaire (O2) et a une synthèse concomitante d’ATP.
L’acide pyruvique sera transformé en Acétyl coa par décarboxylation
oxydative, on a 2 étapes :
Cycle de Krebs :
 La chaîne respiratoire :
C’est une chaîne cytochromique de transfert des électrons à laquelle sont
associées des phosphorylations oxydative, avec libération d’une grande
quantité d’énergie
Les composants de la chaîne sont :
NAD - Flavoproteines (FMN et FAD) - coenzymes -Cytochromes
 B-Fermentation et voies fermentaires :
(cytoplasmique)
 Elle a lieu en anaérobiose.
 C’est un processus d’oxydoréduction, mais les accepteurs finals
d’électrons sont des composés organiques.
 L’énergie est produite par Phosphorylation au niveau du substrat. Elle est
nettement moindre que la respiration.
 C'est le type de fermentation le plus répandu chez les bactéries.
 Elle peut se présenter sous 2 formes possibles:
Fermentation acides mixtes : caractéristique des bactéries dites
« VP - » « RM + »
 les produit finaux de cette fermentation sont : l’ethanol et différents acides
: acide lactique, méthanoïque , acétique et succinique (d'où son nom !)
(ex.: Escherichia coli, Salmonella, . . . ).
2)- Fermentation butanediolique : Caractéristique des bactéries dites «VP + »
 Le produit final de cette voie est le 2,3-butanediol (produit neutre)

/- Fermentation alcoolique réalisée par:


 Les levures (fabrication de vin, bière et pain).
 Les champignons.
 Les cellules végétales.
Fermentation lactique : On distingue 3 modèles:
 Fermentation Homolactique : retrouvée chez les Streptocoques : C'est une
fermentation sans production de gaz et s'accompagnant d'une diminution
importante du PH du milieu.
 Fermentation Hétérolactique: retrouvée chez les Lactobacilles, Comprend
une production importante de CO2 et un PH bas.
NB: à la base de fabrication de yaourt et fromages
 Fermentation Aceto-lactique: retrouvée chez des bactéries du genre
Bifidobacterium, s'accompagne de la production d'un mélange d'acide
lactique et acétique.
/- Fermentations des bactéries anaérobies strictes : (fermentation butyrique
des Clostridies)
 Elle se caractérise par une odeur nauséabonde due au butyrate.
Glucose ——> 2 Acétate + 3 Butyrate + 8 CO2 + H2
 EXPLORATION DU METABOLISME BIOCHIMIQUE:
*Le but de toute analyse bactériologique que ce soit d'un prélèvement
pathologique ou autre est l'identification du ou des germes qui s'y trouvent
On ne doit entamer l'identification d'une bactérie que si l'on a une souche à
l'état pur, c'est-à-dire constituée par un seul clone bactérien.
Toutes étude biochimique effectuée sur un mélange de germes n'a aucune
valeur.
*Nous Ne pouvons en pratique courante étudier tous les caractères d'une
bactérie, il faut se limiter aux caractères principaux qui permettent une
identification rapide et sure.
Rapport des bactéries avec l'oxygène:
Étude du type respiratoire

On distingue essentiellement 4 types de bactéries en fonction de leur rapport


avec l'oxygène de l'air :
- aérobie strictes.
- micro aérophiles.
- apéro- anaérobie facultatives.
- anaérobies strictes.
Le milieu d'étude type est de la gélose viande foie (V.F).
- au moment de l'emploi, régénérer le milieu en plaçant les tubes 15 mn au bain-
marie bouillant pour en chasser l'O2.
- refroidir a 45-50 C puis inoculer a laide de pipette pasteur, préalablement
trempée dons une culture en milieu liquide jusque au fond du tube puis
remonter en décrivant des tours de spires très serrés.
-Incuber a 37C pendant 18 à 24h.
3 enzymes respiratoires sont couramment recherchées
-Oxydase.
-Catalase
-Nitrate réductase
Les derniers stades de la respiration cellulaire oxydative fait intervenir les
cytochromes dont seul le dernier maillon, le cytochrome oxydase réagit
directement avec l'oxygène.
Touts les germe aérobies et aérobies facultatifs possèdent une cytochrome
oxydase, Toutefois sa mise en évidence par la technique utilisée n'est possible
que si le germe possède en même temps le cytochrome.
-l'indicateur employé est la N. dimethyl-para phenylene diamine qui est
oxydée et donne une semi quinine colorée en rouge.

Technique:
Prendre un disque de papier buvard déjà imprégné du réactif ; l'imbiber d'un peu
d'eau physiologique à l'aide d'une pipette pasteur fermée ou de l'anse de
platine , prendre un peu de culture à partir d'une culture en milieu solide, la
déposer sur le disque :
Cette enzyme dégrade l' H2O2
Elle est capable de décomposer l'eau oxygénée selon la réaction
Technique :
-Déposer une goutte d'eau oxygénée sur une lame
-Prélever dans la zone d'asepsie une colonie à l'anse de platine
-Déposer la colonie dans la goutte d'eau oxygénée.
Si la bactérie possède une catalase, on aura un dégagement d' O2 sous forme de
bulle donc :

Au cours de ce test, on recherche la production d’une enzyme :la nitrate-


réductase par la bactérie. Cette étude va donc consister à mettre en évidence
le métabolite nitrite ou la disparition des nitrates initiaux.
La réduction des nitrates par la nitrate réductase se traduit par la production de
nitrites. Parfois, certaines bactéries peuvent poursuivre cette réduction ,
jusqu’à une dénitrification.

On utilise un milieu synthétique contenant des sources de carbone et d'azote bien


définie. On ensemence la bactérie à étudier sur ces milieux.
-s'il y a culture bactéries utilise le substrat étudié comme source
d'énergie
-s'il y a absence de culture bactéries n'a pas pu synthétisé ses
métabolites essentiels à partir du substrat étudié
Le milieu utilisé est le milieu de citrate de Simmons( source d'azote est le
phosphate d'ammonium et la source de carbone est le citrate de sodium,
l'indicateur de coloration est le bleu de bromothymol, le milieu est vert) .
Le milieu doit être ensemencé à partir d'une culture prélève sur gélose.
Lecture:
S'il y a culture, l'acide citrique (triacide) est transformé en diacide par
décarboxylation oxydative ce qui entraîne une élévation du PH et donc
virage de l'indicateur dans la zone de culture.
III- 1-METABOLISME DES GLUCIDES :
a) Étude des différents sucres:
Différents milieux peuvent être utilisés , il sont additionnés du ou des sucres à
étudier +un indicateur de PH coloré, il existe des milieux :
-liquides: eau peptonée ou bouillon nutritif +sucre +indicateur, ces milieux sont
ensemencés avec quelques gouttes de suspension
-solides, ce sont des milieux dont la composition varie avec les exigences des
germes.
L'ensemencement se fait en surface
Lecture: après 18h d'incubation, une réaction positive se traduit par une
coloration jaune et une réaction négative par une coloration rouge( si
l'indicateur est du rouge de phénol)
b) Étude de la voie d'attaque des glucides
les bactérie attaquent les sucres soit par vois
Oxydative
Fermentaire
Ou les 2 à la fois
Le milieu utilisé: MEVAG qui contient le sucre a étudier + rouge de phénol, le
milieu se présente en culot. Au moment de l'emploi régénérer les deux tubes,
laisser refroidir puis pour chaque souche ensemencer deux tubes solidifiés
par piqûre centrale à partir d'un bouillon
Mettre en évidence le rôle de l'O2 en recouvrant un des deux milieux glucosés
avec de la vaseline stérile fondue. Incuber à 37°c pendant 18-24h.
c) détermination de la voie fermentaire:
La mise en évidence de la voie fermentaire empruntée par un germe est très
importante pour son diagnostic, les deux voies que l'on recherche le plus
souvent sont:
-voie des acides mixtes : mise en évidence par le test RM (rouge de méthyle)
-voie butylène-glycol : mise en évidence par la réaction de Voges Proskauer
(V.P)
Le milieu utilisé est le milieu de Clark et Lubs qui est ensemencé et incubé à 37°
pendant 24h. Après incubation on repartit le milieu dans deux tubes,
Dans le premier tube on ajoute quelque goutte de RM (rouge de Méthyle)
- Dans le 2eme tube on ajoute une goutte d'alpha naphtol (VP1) et 2 gouttes de
KOH (VP2)
d) Etude des enzymes intervenant dans la dégradation des sucres:
L'enzyme la plus couramment recherchée est la Beta-Galactosidase responsable
de la dégradation du lactose
Principe : certaines bactéries"lactose –négatif"- ne possèdent pas toutes les
enzymes nécessaires à la dégradation du lactose et notamment lactose-
perméase.
Ces germes sont cependant potentiellement capable d'hydrolyser le lactose ou
un galactoside artificiel Ortho-Nitro-Phényl-Galactopyranoside (ONPG) ,
l’Ortho-Nitro-Phénol libéré colore le milieu en jaune.
Technique: une anse pleine de culture bactérienne prélevée sur un milieu lactosé
est mise en suspension dans H2O physiologique.
On ajoute des disque de papier buvard imprégnés de réactif.
On incube à 37°c pendant 24 h
Une réaction +( ONPG + ) : coloration jaune: présence d'une Beta-galactosidase
Une réaction – (ONPG - ) : pas de coloration jaune
e) Milieu de diagnostic rapide
Ce sont des milieux sucrés complexes qui permettent une orientation rapide du
diagnostic, en fournissant plusieurs caractères biochimiques.
TSI
Il est composé essentiellement du 3 sucres : glucose, lactose, saccharose,
contient également du sulfate ferreux et des thio-sulfate et du rouge de
phénol, le milieu est donc rouge
On ensemence en stries serrées la pente puis par piqûre central le culot.
Les tubes à vis ne sont pas vissée à font pendant l'incubation
La lecture se fait au bout de 24h d'incubation. Ce milieu permet la recherche de
5 caractères:
- fermentation du glucose
- fermentation du lactose saccharose
- production d'H2S due à la réduction du thiosulfate qui donne des sulfures
de fer noir
- production de gaz
*lecture au niveau du culot:
-fermentation du glucose: virage au jaune s'il y a fermentation
- production de gaz: décollement de la gélose
- production d' H2S : noircissement du milieu
* lecture au niveau de la pente
-lactose- saccharose- : pente rouge
- lactose- saccharose+ :pente jaune
* production de gaz :
KIA: dont la composition est identique à celle du TSI mais il contient que 2
sucres: glucose, lactose, utilisé pour les germes saccharose +
Milieu mannitol mobilité:
- contient du mannitol, nitrates et du rouge de phénol (le milieu est donc rouge)
- Présenté en culot, Avant d'ensemencer régénérer la gélose, pour en chasser
l'oxygéné qui risque de fausser la lecture de la mobilité, laisser refroidir puis
ensemencer par piqûre central jusqu'au font du tube, Incuber à 37°c pendant
24 h
1- Etude de la dégradation des acides aminés (a a

a) Recherche de l'uréase, de la tryptophane désaminase et tryptophanase:


Le milieu utilisé est le milieu de Ferguson qui contient de la tryptophane et
rouge de phénol, le milieu est jaune-orangé
Le milieu est ensemencé richement à l'aide d'une culture prélevée sur TSI
incuber à 37°c pendant 24h
Ce milieu permet la détermination de 3 caractères Urée
TDA
Indole
Recherche de l'uréase: Urée amido-hydrolase:
Urée+ H2O CO2+NH3
HN3 provoque l'alcalinisation du milieu
lecture:
-si le germe produit l'Uréase, le milieu devient alcalin et vire au rouge violacée
- dans le cas contraire, le milieu reste inchangé
Production d'indole ( Tryptophanase):
Certaines bactéries possédant une tryptophanase ,ensemencées en milieu riche
en tryptophanase elles dégradent celui-ci en provoquant la formation
d'indole,
l'indole formé est mis en évidence par para- dimethyl-aminobenzaldehyde en
solution dans l'alcool amylique, en milieu chlorhydrique ( réaction de
Kovacs) qui prend en présence d'indole, une coloration rouge :
après addition du réactif anneau rouge a la surface
- la recherche de l'indole peut se faire aussi en eau peptonée exempt d'indole.
Recherche de la TDA:
les germes possédant cette enzyme, conduisent par désimination oxydative du
tryptophane, a la formation d'acide pyrivique qui est mis en évidence par
coloration brune qu'il donne avec du perchlorure de fer
- Si couleur rouge brun : réaction +
- Si couleur jaune : réaction

2- Recherche des décarboxylases:


Les bactérie dégradent les ( L. lysine, L. ornithine, Ac glutamique, L.arginine)
en empruntant des voies multiples qui, toutes aboutissent pratiquement à la
libération de NH3 ou d'amine alcalin
Le milieu utilisé est le milieu de Moeller- Falkow qui contient l'acide aminé à
étudier, contient également du glucose et du bromocrézol d'ou la coloration
violette du milieu
L’ensemencement ne se fait à partir d'une suspension en eau physiologique à
raison de 3 à4 gouttes
Recouvrir la surface du milieu de quelques gouttes d'huile.
-Dans un 1er temps, les bactéries vont fermenter le glucose, le milieu en
s'acidifiant devient jaune.
-Dans un 2eme temps, si les enzymes bactériennes sont sur les a.a ,il y a
formation de substances fortement alcalines qui font virer au violet
l'indicateur de PH
Lecture: coloration violette: réaction +
coloration jaune : réaction –

Il faut toujours faire en parallèle un témoin sans a.a, celui ci doit être après
incubation jaune. sil n'a pas de virage , la bactérie n'a pas cultivé sur ce
milieu ou n'a pas utilisé le glucose, la réaction est sans valeur: ne peut être
interprétée

3- recherche de la désulfhydrase par mise en évidence de H2S forme


Certains Bactéries attaquent les a a soufrés en produisant de H2S qui est mis en
évidence par formation , en présence des métaux lourds d'un sulfure noir, ou
sur milieu TSI se traduit par une coloration noir.
4- Recherche des enzymes protéolytiques:
La gélatinase est l'enzyme responsable de l'hydrolyse de la gélatine. les bactéries
qui sont pourvues liquéfient la gélatine Plusieurs technique peuvent être
utilisées pour déceler l'hydrolyse de la gélatine. la plus utilisée est la
méthode du film photographique
Principe :
Cette méthode, encore plus simple et plus rapide, consiste à utiliser du film
photographique qui composé d'une couche fine de sels d'argent dans la
gélatine déposée sur un support transparent.
Prendre un film vierge, l'exposer a la lumière et le développer, il est noir.
découper en languettes qui se conservant indéfiniment.
Technique:
Pour rechercher la gélatine, faire une suspension épaisse laiteuse de bactéries
dans 0.5 ml environ d'eau physiologique.
Placer une languette de film dont une partie seulement immergée
Boucher le tube pour éviter l'évaporation et le placer à l'étuve ou ,au bain-marie
à 37°c
Si la culture possède une gelatinase, le support transparent de la part immergée
du film est mis a nu et les sels d'argent tombent au fond du tube.
-recherche des lipases :
Les lipases sont des enzymes qui hydrolysent les esters d'acide gras à longue
chaîne carbonée. . les esters d'acide gras les plus utilisée pour la mis en
évidence de l'existence des lipases, sont les Tween ( esters de sorbitol et
d'acide gras)
Technique: technique de Sierra
L'acide libéré est mis en évidence par précipitation sous forme de sels de
calcium insolubles, ce qui provoque l'opacification du milieu gélosé au tour
des colonies
2- recherche des lecitinase;
les licithinases ou phosphalipases sont des enzymes de dégradation des
lécithines .la lécithine la plus utilisée est celle du jaune d'œuf.
Le milieu utilisé est la gélose nutritive au jaune d'œuf, on ensemence par point,
incuber à 37°c pendant 24h
une réaction + se traduit par l'opacification du milieu