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CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DEL ERGOSTEROL (ERG11) EN


Candida albicans Y RECONOCIMIENTO DE SUS MUTACIONES
ASOCIADAS A LA RESISTENCIA A LOS AZOLES
JOSE DAVID VELANDIA OSORIO1, VALERIA FONSECA LÓPEZ1 & TATIANA HERRERA PADILLA2

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Departamento de Ciencias Biológicas, y 2Departamento de Ingeniería Biomédica, de la Universidad de los Andes,
Bogotá, Colombia

RESUMEN
Candida albicans ha sido fuertemente estudiada últimamente debido a la reciente aparición de cepas
resistentes a los tratamientos tradicionales para tratar las infecciones causadas por esta levadura. El
tratamiento tradicional consiste en la aplicación de antifúngicos para así eliminar al hongo, sin embargo,
este método ya no es totalmente efectivo. Uno de los factores más estudiados para determinar la causa de
la resistencia a los azoles por parte de este hongo es el gen ERG11. Mutaciones no sinónimas sobre este
gen afectan la susceptibilidad de la enzima 14-α-lanosterol desmetilasa (involucrada en la síntesis de
erosterol) al efecto de los azoles. El objetivo de este estudio es analizar la secuencia del gen ERG11 en una
cepa de Candida albicans susceptible a azoles respecto a una resistente para identificar las mutaciones que
podrían causar dicha resistencia. Para lograr esto se inició con la extracción de Candida albicans resistente
a azoles, posteriormente se amplificó el gen ERG11 mediante PCR con el objetivo de evidenciar la
presencia del gen al momento de su visualización en un gel de electroforesis. Se purificó el producto de
PCR para su posterior secuenciación. Finalmente Se analizó de manera bioinformática la secuencia del gen
ERG11 resistente a azoles mediante CLC con una secuencia de una cepa susceptible a azoles consultada en
NCBI. Se encontraron tres mutaciones en el gen ERG11 (P392T; I437V; E517K) de las cuales dos (I437V;
E517K) están asociadas con resistencia a azoles. Hay más genes relacionados con la resistencia a azoles en
Candida albicans (MDR1) que no se tuvieron en cuenta en este artículo.

PALABRAS CLAVES: Candida albicans, azoles, resistencia, enzima 14-α-lanosterol desmetilasa, CLC
Genomics Workbench- CLC bio, ergosterol, mutaciones

INTRODUCCIÓN El fluconazol es un antifúngico del grupo


Candida albicans es un hongo que se puede de los azoles muy usado para el tratamiento de las
encontrar en el cuerpo humano sin presentar patologías causadas por Candida albicans
ningún tipo de efectos patógenos. Sin embargo, (Rautemaa, Richardson, Pfaller, Perheentupa, &
puede provocar infecciones, como lo es la Saxén, 2008). Los azoles interrumpen la síntesis
candidiasis sistemática o superficial, afectando la del ergosterol, el cual es un componente principal
piel, las mucosas y las uñas (Instituto nacional de de las membranas celulares a las cuales les brinda
seguridad de higiene en el trabajo, 2012). Los fluidez, además es importante para el crecimiento
pacientes más susceptibles a Candida albicans y la división celular; sumado a esto los azoles
son las personas con cáncer, trasplantados o con promueven la acumulación de peróxido de
SIDA la infección puede hacerse sistémica hidrógeno capaz de lesionar la estructura del
(candidemia), y puede llegar a ser mortal (He et hongo (Flowers, Colón, Whaley, Schuler &
al., 2015). Rogers, 2015). El gen ERG11 produce una
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enzima llamada 14-α-lanosterol desmetilasa, a un tubo de colección nuevo. Luego de esto, se


necesaria para la biosíntesis de ergosterol, y sobre agregaron 200 uL de DNA Pre-wash buffer a la
ella actúan los azoles bloqueando su sitio activo columna, se centrifugó y se transfirió la columna
(Xiang et al., 2013). con el mismo proceso ya descrito. A
continuación, se añadió ≥50 uL de DNA Elution
En los últimos años se ha descubierto que Buffer y se incubó la muestra de 2 a 5 minutos a
algunas cepas de Candida albicans han temperatura ambiente. Por último, se centrifugó a
descubierto susceptibilidad a la acción de los máxima velocidad durante 30 segundos. La
azoles. Este descubrimiento se logró gracias al elución resultante se almacenó a a ≤20°C.
análisis de cepas del organismo en pacientes con
un tratamiento prolongado de azoles (Rautemaa, PCR (ERG11 Candida albicans)
Richardson, Pfaller, Perheentupa, & Saxén, Se realizó un Master mix de los siguientes
2008). Esta resistencia se puede deber a reactivos en el orden y proporción que se
mutaciones en la secuencia de ERG11, la enzima describirá a continuación. Agua ultrapura 68 uL,
14-α-lanosterol desmetilasa pierde afinidad por buffer de 10X 10uL, cloruro de magnesio
los azoles, por causas como el cambio de su (MgCl2+) 6uL. Además, los reactivos dNTPs,
estructura tridimensional (Xiang et al., 2013). Sin primer Forward 10uM, primer Reverse 10 uM y
embrago, esta no es la única razón de la Taq polimerasa, se añadió 2uL de cada reactivo a
resistencia a azoles de Candida albicans, sino que la master mix y se pipeteó la muestra sin generar
puede deberse también a una regulación positiva burbujas. Por último, se agregó 23 uL a cuatro
en el gen ERG11, que genera más copias de la tubos eppendorf, a dos de ellos se les agregó 2 ul
enzima 14-α-lanosterol desmetilasa o una menor de ADN de Candida albicans, además se realizó
concentración de azoles en el medio intracelular un control negativo con 2 uL de agua ultra pura.
(Sanglard, 2002). Se llevó esta muestra al termociclador con el fin
El objetivo de este estudio es analizar la de poder amplificar la región terminal del gen
secuencia del gen ERG11 en una cepa de Candida ERG11. Al usar este equipo, se tuvo en cuenta que
albicans susceptible a azoles respecto a una durante los 5 primeros minutos la muestra debía
resistente para identificar las mutaciones que estar a 94 °C, luego durante 1 minuto debía estar
podrían causar dicha resistencia. a 58 y en los siguiente dos minutos a 72 °C,
debido a que, se debe cumplir con los tres pasos
. principales en cada ciclo de la PCR, que son:
MATERIALES Y MÉTODOS denaturación, anillaje y elongación en su
respectivo orden.
El procedimiento se llevó a cabo en los
laboratorios de Ciencias biológicas de la Visualización de productos PCR
Universidad de los Andes de Bogotá, Colombia. Para la visualización de los productos de la PCR,
se preparó un gel de agarosa al 1.5%, con 0,75g
Extracción de ADN de Candida albicans de agarosa y 59 mL de TBE 1X. Se calentó hasta
Primero, se agregó 600uL de buffer de lisis y 8 uL que la preparación se disolvió y se agregó 0,5 uL
de proteinasa K. esta mezcla se incubó a 65°C de GelRed®. Posteriormente, se dejó polimerizar
durante un tiempo de 60 minutos, luego de esto se el gel durante 30 min. Acto seguido, se tomó 4 uL
transfirió a una columna Zymo-spin en un tubo de del producto de PCR y se agregaron 3 ul de buffer
colección haciendo uso del Kit Quick-gDNA de carga. Preparación que se sembró en los pozos
MiniPrep Zymo Research. Después, se centrifugó dispuestos. Finalmente, se corrió a 100 voltios por
la muestra a 10.000 rpm y se transfirió la columna
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5º min, para después, visualizar el tamaño de las luego de esto se corrió en un gel de agarosa al
bandas problemas con un transiluminador. 1.5% con GelRed®, se cubrió con buffer de
corrido y se agregaron 5uL de cada muestra en los
Purificación de productos de PCR pozos. El gel se corrió durante 40 minutos a 1000
Para lograr purificar el producto de PCR del gen voltios.
Ergosterol de Candida albicans, secuenciar y
analizar, se utilizó el kit de purificación Wizard Bioinformática
SV gel and PCR Clean-up System; para el cual se Se usó la aplicación CLC Genomics Workbench-
inició mezclando el producto de PCR con la CLC bio, en donde se exportó la carpeta con los
solución de unión a la membrana, en la misma resultados de la secuenciación. Posteriormente, se
cantidad. realizaron las secuencias Trim, Consenso con las
Luego de esto, se insertó la columna en un secuencias Forward –Reverse y Blast. El
tubo eppendorf y se transfirió el producto de PCR. resultado de tradujo a proteínas. Los aminoácidos
Esta muestra se incubó 1 minuto a temperatura de la secuenciación del consenso se compararon
ambiente, posteriormente, se centrifugó a 14000 con una secuencia del gen ERG11 de Candida
rpm durante 1 min. Paso seguido, se adicionó 700 albicans sensible a azoles. La secuencia del gen
uL de wash solution y se centrifugó nuevamente ERG11 de Candida albicans sensible azoles que
a 14000 rpm, se descartó el contenido del tubo y se usó en este artículo se encuentra bajo la
se agregó 500 uL de wash solution y se centrifugó referencia NCBI: GQ202082.2.
nuevamente a la misma velocidad durante 5
minutos. Se repitió el último procedimiento de RESULTADOS
lavado y se centrifugó nuevamente durante 4
minutos, esta serie de lavados y centrifugación Visualización productos PCR
permitieron que se eliminaran las impurezas de Al realizar la metodología anteriormente
PCR tales como primers, dNTPs, MgCl2, Taq mencionada se observó el producto de
polimerasa y aceite mineral, que interfieren con la amplificación de PCR en un gel de electroforesis:
secuenciación, clonación y genotipificación.
Después, como parte del proyecto de
elución .la columna se ensambló en un nuevo
eppendorf de 1,5 ml y se adicionó 50ul de libre de
nucleasas a la columna. Por último, se incubó a
temperatura ambiente por 1 min y se centrifugó a
14000 rpm/ 1 min., se descartó a la columna y se
almacenó la muestra a -20 °C.

Secuenciación y visualización de productos


El método de secuenciación utilizado fue Figura 1 Gel de electroforesis con
productos de amplificación. De izquierda
por terminador fluorescente, usando a derecha el carril 1 corresponde al
dideoxinucleótidos marcados con fluorocromos, control negativo; carril 2 al marcador de
peso molecular; carril 4 a la muestra
gracias a esto fue posible realizar el análisis de problema; el carril 5 al control positivo.
bioinformática. Gel tomado de referencia.

Se adicionó 5uL de ADN y 5uL de


enzimas EcoRI + Pstl y se mezclaron los tubos.
Paso siguiente se incubaron las muestras a 37°C
durante 45 minutos y se almacenaron a -20°C,
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En el gel puede observarse los resultados


esperados para la amplificación del producto de
PCR. En el control negativo puede observarse una
banda en la parte inferior que corresponde a los
dímeros de primers.

Bioinformática

Al realizar el blast con el primer forward G5 se


encontró el siguiente porcentaje de cobertura y de
identidad: 100% de cobertura, un e-value de 3 x
10-23 y un 99% de identidad. El puntaje obtenido
fue de 629 el cual fue identificado como el gen
ERG11 de Candida albicans.

La secuencia consenso hallada entre los


resultados dada por ambos primer G5 fue: Figura 2 Alineamiento de aminoácidos entre secuencia consenso y
secuencia de Candida albicans sensible a azoles

ANÁLISIS Y DISCUSIONES

Mecanismos de resistencia a azoles presentes


Figura 3 Secuencia consenso de Candida albicans en Candida albicans
resistente a azoles
La resistencia de este microorganismo al
Al traducir la secuencia consenso a
antifúngico se explica principalmente mediante
proteína se obtuvo el siguiente resultado:
dos mecanismos: mutaciones moleculares de la
enzima diana del antifúngico, como la alteración
de las enzimas relacionadas en la síntesis de
ergosterol y el segundo por la alteración en las
bombas de expulsión (ATP-binding cassette
(ABC)) y facilitadores mayores. (López-Ávila,
2016). La presencia de antifúngicos provoca una
Figura 4 Secuencia de aminoácidos de secuencia
consenso de Candida albicans resistente a azoles
presión selectiva que deriva en una evolución
acelerada.

Las mutaciones no sinónimas en la


Al usar la herramienta de alineamiento secuencia del gen de la síntesis de ergosteol
para poder comparar la secuencia de aminoácidos ERG11. Estas mutaciones causan sustituciones
de la cepa resistente a azoles y la secuencia aminoacídicas, incrementando la producción de la
sensible a azoles para el gen ERG11 se halló un enzima lanosterol desmitelasa y disminuyendo su
total de 3 mutaciones en el ultimo exón del gen. afinidad por los azoles, por lo que será necesario
Estas mutaciones corresponden a la siguiente aumentar la dosis del antifúngico para que cumpla
posición dentro del gen y al aminoácido cambiado su efecto (Flower et al., 2014). Otro cambio que
producto de la mutación: P392T; I437V; E517K. ocurre al mutar el gen ERG11 que se relaciona
con la tolerancia a los esteroles metilados se debe
a que dicha mutación cambia la concentración de
esteroles en la membrana, dando como resultado
la producción de 14α-methylfecosterol, que
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permite el desarrollo celular (Kontoyiannis, programa CLC, lo que pudo provocar un error en
2000). el alineamiento o en la obtención de la secuencia
consenso.
Lo anterior se logra evidenciar en el alineamiento
de la secuencia de aminoácidos entre la cepa BIBLIOGRAFÍA
resistente a azoles y la sensible en el gen ERG11.
La mutación en el E517K puede darle Instituto nacional de seguridad de higiene en el trabajo.
características fenotípicas a las levaduras que (2012). Candida albicans. Recuperado de
http://www.insht.es/RiesgosBiologicos/Contenidos/Fichas
pueden darle ventajas respecto a las wildtype de agentes biologicos/Fichas/Hongos/Candida albicans.pdf
(Straight et al., 2000).
Flowers, S. A., Colón, B., Whaley, S. G., Schuler, M. A., &
La mutación en I437V se encontró asociada a Rogers, P. D. (2015). Contribution of clinically derived
Candida albicans resistente a azoles (Oliveria et mutations in ERG11 to azole resistance in Candida albicans.
al, 2013). La mutación P392T no fue encontrada Antimicrobial agents and chemotherapy, 59(1), 450-460.
en la bibliografía como causante de resistencia a
los azoles, sin embargo, se encontró que la He, X., Zhao, M., Chen, J., Wu, R., Zhang, J., Cui, R., &
mutación L321F se ha encontrado como asociada Zhang, Y. (2015). Overexpression of both ERG11 and
a la resistencia a los azoles. ABC2 genes might be responsible for itraconazole
resistance in clinical isolates of Candida krusei. PloS one,
CONCLUSIONES 10(8), e0136185.
De las tres mutaciones encontradas en el último
exón del gen ERG11 de Candida albicans: Rautemaa, R., Richardson, M., Pfaller, M., Perheentupa, J.,
P392T; I437V; E517K, se encontró referencias & Saxén, H. (2008). Reduction of fluconazole susceptibility
of Candida albicans in APECED patients due to long-term
bibliográficas respecto a dos mutaciones
use of ketoconazole and miconazole. Scandinavian journal
implicadas en la resistencia a azoles: I437V;
of infectious diseases, 40(11-12), 904-907.
E517K. La mutación P392T no está reportada
como causante de dicha resistencia, por lo que
Sanglard, D. (2002). Clinical relevance of mechanisms of
cabe la posibilidad que pueda estar implicada en antifungal drug resistance in yeasts. Enferm Infecc
la resistencia pero que todavía no esté reportada. Microbiol Clin 20, 462-469.
En este orden de ideas se hace necesaria más
revisiones sobre dicha mutación para poder Xiang, M. J., Liu, J. Y., Ni, P. H., Wang, S., Shi, C., Wei,
clasificarla. Se evidenció que en el gen ERG11 sí B., & Ge, H. L. (2013). Erg11 mutations associated with
hay mutaciones especificas que contribuyen a la azole resistance in clinical isolates of Candida albicans.
resistencia de Candia albicans a los azoles. FEMS yeast research, 13(4), 386-393.

Se ha encontrado que dentro de Candida López-Ávila, K., Dzul-Rosado, K. R., Lugo-Caballero,


albicans el gen ERG11 no es el único responsable C., Arias-León, J. J., & Zavala-Castro, J. E. (2016).
de la resistencia a los azoles. El gen MDR1, que Mecanismos de resistencia antifúngica de los azoles
codifica para la proteína MDR1p, se encuentra en Candida albicans. Una revisión. Revista
dentro de los llamados factores de resistencia biomédica, 27(3).
múltiple o pleiotrópica a fármacos
(PDR:Pleiotropi Drug Resistence). Este grupo de
factores confieren resistencia a múltiples Paul D. Straight, Thomas H. Giddings, Jr., and Mark Winey
medicamentos sin ninguna semejanza estructural (2000). Mps1p Regulates Meiotic Spindle Pole
definida. (Quintero, 2010). Esto significa que el BodyDuplication in Addition to Having Novel Rolesduring
presente estudio no tuvo en cuenta que la Sporulation. Molecular, Cellular, and Developmental-
Biology, Porter Biosciences, University of
resistencia a azoles puede tener causante que
Colorado,Boulder, Colorado 80309.
contribuyen desde sitios ajenos al gen ERG11.

El hecho de que no se encontraran más


Oliveira Carvalho, V., Okay, T., Melhem, M., Walderez
mutaciones respaldadas por la bibliografía pudo Szeszs, M., & del Negro, G. (2013). The new mutation
deberse a un error en la manipulación del L321F in Candida albicans ERG11 gene may be associated
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with fluconazole resistance. Revista Iberoamericana De


Micología, 30(3), 209-212. doi:
10.1016/j.riam.2013.01.001

Gómez Quintero, C. H. (2010). Candida yeast´ s resistance


to fluconazol. Infectio, 14, s172-s180.