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CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DEL ERGOSTEROL (ERG11) EN

Candida albicans Y RECONOCIMIENTO DE SUS MUTACIONES
ASOCIADAS A LA RESISTENCIA A LOS AZOLES
JOSE DAVID VELANDIA OSORIO1, VALERIA FONSECA LÓPEZ1 & TATIANA HERRERA PADILLA2

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Departamento de Ciencias Biológicas, y 2Departamento de Ingeniería Biomédica, de la Universidad de los Andes,
Bogotá, Colombia

RESUMEN
Candida albicans ha sido fuertemente estudiada últimamente debido a la reciente aparición de cepas
resistentes a los tratamientos tradicionales para tratar las infecciones causadas por esta levadura. El
tratamiento tradicional consiste en la aplicación de antifúngicos para así eliminar al hongo, sin embargo,
este método ya no es totalmente efectivo. Uno de los factores más estudiados para determinar la causa de
la resistencia a los azoles por parte de este hongo es el gen ERG11. Mutaciones no sinónimas sobre este
gen afectan la susceptibilidad de la enzima 14-α-lanosterol desmetilasa (involucrada en la síntesis de
erosterol) al efecto de los azoles. El objetivo de este estudio es analizar la secuencia del gen ERG11 en una
cepa de Candida albicans susceptible a azoles respecto a una resistente para identificar las mutaciones que
podrían causar dicha resistencia. Para lograr esto se inició con la extracción de Candida albicans resistente
a azoles, posteriormente se amplificó el gen ERG11 mediante PCR con el objetivo de evidenciar la
presencia del gen al momento de su visualización en un gel de electroforesis. Se purificó el producto de
PCR para su posterior secuenciación. Finalmente Se analizó de manera bioinformática la secuencia del gen
ERG11 resistente a azoles mediante CLC con una secuencia de una cepa susceptible a azoles consultada en
NCBI. Se encontraron tres mutaciones en el gen ERG11 (P392T; I437V; E517K) de las cuales dos (I437V;
E517K) están asociadas con resistencia a azoles. Hay más genes relacionados con la resistencia a azoles en
Candida albicans (MDR1) que no se tuvieron en cuenta en este artículo.

PALABRAS CLAVES: Candida albicans, azoles, resistencia, enzima 14-α-lanosterol desmetilasa, CLC
Genomics Workbench- CLC bio, ergosterol, mutaciones

INTRODUCCIÓN El fluconazol es un antifúngico del grupo

Candida albicans es un hongo que se puede
encontrar en el cuerpo humano sin presentar
ningún tipo de efectos patógenos. Sin embargo,
puede provocar infecciones, como lo es la
candidiasis sistemática o superficial, afectando la
piel, las mucosas y las uñas (Instituto nacional de
seguridad de higiene en el trabajo, 2012). Los
pacientes más susceptibles a Candida albicans
son las personas con cáncer, trasplantados o con
SIDA la infección puede hacerse sistémica
(candidemia), y puede llegar a ser mortal (He et
al., 2015).
de los azoles muy usado para el tratamiento de las
patologías causadas por Candida albicans
(Rautemaa, Richardson, Pfaller, Perheentupa, &
Saxén, 2008). Los azoles interrumpen la síntesis
del ergosterol, el cual es un componente principal
de las membranas celulares a las cuales les brinda
fluidez, además es importante para el crecimiento
y la división celular; sumado a esto los azoles
promueven la acumulación de peróxido de
hidrógeno capaz de lesionar la estructura del
hongo (Flowers, Colón, Whaley, Schuler &
Rogers, 2015). El gen ERG11 produce una

enzima llamada 14-α-lanosterol desmetilasa,
necesaria para la biosíntesis de ergosterol, y sobre
ella actúan los azoles bloqueando su sitio activo
(Xiang et al., 2013).
En los últimos años se ha descubierto que
algunas cepas de Candida albicans han
descubierto susceptibilidad a la acción de los
azoles. Este descubrimiento se logró gracias al
análisis de cepas del organismo en pacientes con
un tratamiento prolongado de azoles (Rautemaa,
Richardson, Pfaller, Perheentupa, & Saxén,
2008). Esta resistencia se puede deber a
mutaciones en la secuencia de ERG11, la enzima
14-α-lanosterol desmetilasa pierde afinidad por
los azoles, por causas como el cambio de su
estructura tridimensional (Xiang et al., 2013). Sin
embrago, esta no es la única razón de la
resistencia a azoles de Candida albicans, sino que
puede deberse también a una regulación positiva
en el gen ERG11, que genera más copias de la
enzima 14-α-lanosterol desmetilasa o una menor
concentración de azoles en el medio intracelular
(Sanglard, 2002).
El objetivo de este estudio es analizar la
secuencia del gen ERG11 en una cepa de Candida
albicans susceptible a azoles respecto a una
resistente para identificar las mutaciones que
podrían causar dicha resistencia.
. principales en cada ciclo de la PCR, que son:
MATERIALES Y MÉTODOS
El procedimiento se llevó a cabo en los
laboratorios de Ciencias biológicas de la
Universidad de los Andes de Bogotá, Colombia.
Extracción de ADN de Candida albicans
Primero, se agregó 600uL de buffer de lisis y 8 uL
de proteinasa K. esta mezcla se incubó a 65°C
durante un tiempo de 60 minutos, luego de esto se
transfirió a una columna Zymo-spin en un tubo de
colección haciendo uso del Kit Quick-gDNA
MiniPrep Zymo Research. Después, se centrifugó
la muestra a 10.000 rpm y se transfirió la columna
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a un tubo de colección nuevo. Luego de esto, se
agregaron 200 uL de DNA Pre-wash buffer a la
columna, se centrifugó y se transfirió la columna
con el mismo proceso ya descrito. A
continuación, se añadió ≥50 uL de DNA Elution
Buffer y se incubó la muestra de 2 a 5 minutos a
temperatura ambiente. Por último, se centrifugó a
máxima velocidad durante 30 segundos. La
elución resultante se almacenó a a ≤20°C.
PCR (ERG11 Candida albicans)
Se realizó un Master mix de los siguientes
reactivos en el orden y proporción que se
describirá a continuación. Agua ultrapura 68 uL,
buffer de 10X 10uL, cloruro de magnesio
(MgCl2+) 6uL. Además, los reactivos dNTPs,
primer Forward 10uM, primer Reverse 10 uM y
Taq polimerasa, se añadió 2uL de cada reactivo a
la master mix y se pipeteó la muestra sin generar
burbujas. Por último, se agregó 23 uL a cuatro
tubos eppendorf, a dos de ellos se les agregó 2 ul
de ADN de Candida albicans, además se realizó
un control negativo con 2 uL de agua ultra pura.
Se llevó esta muestra al termociclador con el fin
de poder amplificar la región terminal del gen
ERG11. Al usar este equipo, se tuvo en cuenta que
durante los 5 primeros minutos la muestra debía
estar a 94 °C, luego durante 1 minuto debía estar
a 58 y en los siguiente dos minutos a 72 °C,
debido a que, se debe cumplir con los tres pasos
denaturación, anillaje y elongación en su
respectivo orden.
Visualización de productos PCR
Para la visualización de los productos de la PCR,
se preparó un gel de agarosa al 1.5%, con 0,75g
de agarosa y 59 mL de TBE 1X. Se calentó hasta
que la preparación se disolvió y se agregó 0,5 uL
de GelRed®. Posteriormente, se dejó polimerizar
el gel durante 30 min. Acto seguido, se tomó 4 uL
del producto de PCR y se agregaron 3 ul de buffer
de carga. Preparación que se sembró en los pozos
dispuestos. Finalmente, se corrió a 100 voltios por

5º min, para después, visualizar el tamaño de las
bandas problemas con un transiluminador.
Purificación de productos de PCR
Para lograr purificar el producto de PCR del gen
Ergosterol de Candida albicans, secuenciar y
analizar, se utilizó el kit de purificación Wizard
SV gel and PCR Clean-up System; para el cual se
inició mezclando el producto de PCR con la
solución de unión a la membrana, en la misma
cantidad.
Luego de esto, se insertó la columna en un
tubo eppendorf y se transfirió el producto de PCR.
Esta muestra se incubó 1 minuto a temperatura
ambiente, posteriormente, se centrifugó a 14000
rpm durante 1 min. Paso seguido, se adicionó 700
uL de wash solution y se centrifugó nuevamente
a 14000 rpm, se descartó el contenido del tubo y
se agregó 500 uL de wash solution y se centrifugó
nuevamente a la misma velocidad durante 5
minutos. Se repitió el último procedimiento de
lavado y se centrifugó nuevamente durante 4
minutos, esta serie de lavados y centrifugación
permitieron que se eliminaran las impurezas de
PCR tales como primers, dNTPs, MgCl2, Taq
polimerasa y aceite mineral, que interfieren con la
secuenciación, clonación y genotipificación.
Después, como parte del proyecto de
elución .la columna se ensambló en un nuevo
eppendorf de 1,5 ml y se adicionó 50ul de libre de
nucleasas a la columna. Por último, se incubó a
temperatura ambiente por 1 min y se centrifugó a
14000 rpm/ 1 min., se descartó a la columna y se
almacenó la muestra a -20 °C.
Secuenciación y visualización de productos
El método de secuenciación utilizado fue
por terminador fluorescente, usando
dideoxinucleótidos marcados con fluorocromos,
gracias a esto fue posible realizar el análisis de
bioinformática.
Se adicionó 5uL de ADN y 5uL de
enzimas EcoRI + Pstl y se mezclaron los tubos.
Paso siguiente se incubaron las muestras a 37°C
durante 45 minutos y se almacenaron a -20°C,
3
luego de esto se corrió en un gel de agarosa al
1.5% con GelRed®, se cubrió con buffer de
corrido y se agregaron 5uL de cada muestra en los
pozos. El gel se corrió durante 40 minutos a 1000
voltios.
Bioinformática
Se usó la aplicación CLC Genomics Workbench-
CLC bio, en donde se exportó la carpeta con los
resultados de la secuenciación. Posteriormente, se
realizaron las secuencias Trim, Consenso con las
secuencias Forward –Reverse y Blast. El
resultado de tradujo a proteínas. Los aminoácidos
de la secuenciación del consenso se compararon
con una secuencia del gen ERG11 de Candida
albicans sensible a azoles. La secuencia del gen
ERG11 de Candida albicans sensible azoles que
se usó en este artículo se encuentra bajo la
referencia NCBI: GQ202082.2.
RESULTADOS
Visualización productos PCR
Al realizar la metodología anteriormente
mencionada se observó el producto de
amplificación de PCR en un gel de electroforesis:
Figura 1 Gel de electroforesis con
productos de amplificación. De izquierda
a derecha el carril 1 corresponde al
control negativo; carril 2 al marcador de
peso molecular; carril 4 a la muestra
problema; el carril 5 al control positivo.
Gel tomado de referencia.

En el gel puede observarse los resultados
esperados para la amplificación del producto de
PCR. En el control negativo puede observarse una
banda en la parte inferior que corresponde a los
dímeros de primers.
Bioinformática
Al realizar el blast con el primer forward G5 se
encontró el siguiente porcentaje de cobertura y de
identidad: 100% de cobertura, un e-value de 3 x
10-23 y un 99% de identidad. El puntaje obtenido
fue de 629 el cual fue identificado como el gen
ERG11 de Candida albicans.
La secuencia consenso hallada entre
resultados dada por ambos primer G5 fue:
Figura 3 Secuencia consenso de Candida albicans
resistente a azoles
Al traducir la secuencia consenso a
proteína se obtuvo el siguiente resultado:
Figura 4 Secuencia de aminoácidos de secuencia
consenso de Candida albicans resistente a azoles
Al usar la herramienta de alineamiento
para poder comparar la secuencia de aminoácidos
de la cepa resistente a azoles y la secuencia
sensible a azoles para el gen ERG11 se halló un
total de 3 mutaciones en el ultimo exón del gen.
Estas mutaciones corresponden a la siguiente
posición dentro del gen y al aminoácido cambiado
producto de la mutación: P392T; I437V; E517K.
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los
Figura 2 Alineamiento de aminoácidos entre secuencia consenso y
secuencia de Candida albicans sensible a azoles
ANÁLISIS Y DISCUSIONES
Mecanismos de resistencia a azoles presentes
en Candida albicans
La resistencia de este microorganismo al
antifúngico se explica principalmente mediante
dos mecanismos: mutaciones moleculares de la
enzima diana del antifúngico, como la alteración
de las enzimas relacionadas en la síntesis de
ergosterol y el segundo por la alteración en las
bombas de expulsión (ATP-binding cassette
(ABC)) y facilitadores mayores. (López-Ávila,
2016). La presencia de antifúngicos provoca una
presión selectiva que deriva en una evolución
acelerada.
Las mutaciones no sinónimas en la
secuencia del gen de la síntesis de ergosteol
ERG11. Estas mutaciones causan sustituciones
aminoacídicas, incrementando la producción de la
enzima lanosterol desmitelasa y disminuyendo su
afinidad por los azoles, por lo que será necesario
aumentar la dosis del antifúngico para que cumpla
su efecto (Flower et al., 2014). Otro cambio que
ocurre al mutar el gen ERG11 que se relaciona
con la tolerancia a los esteroles metilados se debe
a que dicha mutación cambia la concentración de
esteroles en la membrana, dando como resultado
la producción de 14α-methylfecosterol, que

permite el desarrollo celular (Kontoyiannis,
2000).
Lo anterior se logra evidenciar en el alineamiento
de la secuencia de aminoácidos entre la cepa
resistente a azoles y la sensible en el gen ERG11.
La mutación en el E517K puede darle
características fenotípicas a las levaduras que
pueden darle ventajas respecto a las wildtype
(Straight et al., 2000).
La mutación en I437V se encontró asociada a
Candida albicans resistente a azoles (Oliveria et
al, 2013). La mutación P392T no fue encontrada
en la bibliografía como causante de resistencia a
los azoles, sin embargo, se encontró que la
mutación L321F se ha encontrado como asociada
a la resistencia a los azoles.
CONCLUSIONES
De las tres mutaciones encontradas en el último
exón del gen ERG11 de Candida albicans:
P392T; I437V; E517K, se encontró referencias
bibliográficas respecto a dos mutaciones
implicadas en la resistencia a azoles: I437V;
E517K. La mutación P392T no está reportada
como causante de dicha resistencia, por lo que
cabe la posibilidad que pueda estar implicada en
la resistencia pero que todavía no esté reportada.
En este orden de ideas se hace necesaria más
revisiones sobre dicha mutación para poder
clasificarla. Se evidenció que en el gen ERG11 sí
hay mutaciones especificas que contribuyen a la
resistencia de Candia albicans a los azoles.
Se ha encontrado que dentro de Candida
albicans el gen ERG11 no es el único responsable
de la resistencia a los azoles. El gen MDR1, que
codifica para la proteína MDR1p, se encuentra
dentro de los llamados factores de resistencia
múltiple o pleiotrópica a fármacos
(PDR:Pleiotropi Drug Resistence). Este grupo de
factores confieren resistencia a múltiples
medicamentos sin ninguna semejanza estructural
definida. (Quintero, 2010). Esto significa que el
presente estudio no tuvo en cuenta que la
resistencia a azoles puede tener causante que
contribuyen desde sitios ajenos al gen ERG11.
El hecho de que no se encontraran más
mutaciones respaldadas por la bibliografía pudo
deberse a un error en la manipulación del
5
programa CLC, lo que pudo provocar un error en
el alineamiento o en la obtención de la secuencia
consenso.
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