Apostila Curso QPCR PDF

Introdução à PCR Quantitativa
em Tempo Real
Invenção daPCR
Evolução da PCR
1976 - Thomas D. Brock
DNA polimerase termoestável de Thermus aquaticus
1985 - Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich
HA, Arnheim N
Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and

restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.
Science. 1985; 230 (4732): 1350-4.
1987 - Mullis KB, Faloona FA
Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed

chain reaction. Methods Enzymol. 1987; 155: 335-50.
1993 - Prêmio Nobel de Química
2 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

O que é PCR?
Polymerase Chain Reaction (reação em cadeia da polimerase)
− Reação enzimática de polimerização de DNA in vitro
− Reação cíclica, produtos de um ciclo são substrato para o ciclo

seguinte
− Amplificação de sequências específicas de DNA, permitindo sua

visualização e/ou análise posterior

PCR: reação para amplificação de segmento específico de DNA

Princípio da Técnica
1. Desnaturação
1min – 95 ° C
2. Primers
28-40 ciclos
30s – 45/60°° C
3. Extensão
1min/kb – 72°° C

(90-96oC)
Desnaturação do DNA (90-
Extensão (72-76oC)
Hibridação dos Primers (50-60oC)

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
..\Animações\PCR_Convencional.mov
Principais componentes da PCR:
DNA molde
Primers
dNTPs – (dATP, dTTP, dCTP, cGTP)
Enzima DNA polimerase
Tampão da Enzima
Mg2+ (MgCl2 ou MgSO4)

Limitações da PCR convencional
Intensa padronização
Baixa sensibilidade
Baixa resolução (≥ 1 log)
Colorações não quantitativas
Contaminação (brometo)
Discriminação baseada apenas no tamanho do amplicon
Pobre discriminação entre o tamanho dos amplicons
Não automatizado
Necessidade de pós-processamento do produto da PCR
Resultados não são expressos em números

PCR em tempo real: histórico
1991 – Holland et al. – PNAS 88:7276-7280
-detecção de produtos de PCR com base na atividade 5’- 3’da Taq polimerase
1993 – Higuchi et al. – Biotechnology 11: 1026-30

-ensaio quantitativo, EtBr, monitoramento por câmera de vídeo
1995 - Livak et al. – Genome Res 4: 357-362; 1996 – Heid et al. – Genome Res 6:
986-994
-ensaio quantitativo com sondas fluorescentes, ABI 7700 Sequence Detector

Evolução da PCR em Tempo Real

PCR em tempo real ⇒ qPCR
método baseado em PCR
monitoramento contínuo do sinal fluorescente ao longo

dos ciclos de amplificação - permite análise dos dados
durante todo o proceso
conversão do sinal fluorescente em valor numérico para

cada amostra

PCR em Tempo Real
PCR convencional (1 ou 2-step)
RNA Detection
PCR em Tempo Real (1 ou 2-step)
RNA
Detection

Principais componentes da qPCR:
DNA molde
Primers
dNTPs – (dATP, dTTP, dCTP, cGTP)
Enzima DNA polimerase
Tampão da Enzima
Mg2+ (MgCl2 ou MgSO4)
Fluoróforo/Probe Fluorescente

Real-time PCR
Independente do modelo, os instrumentos de Real Time
possuem 3 partes em comum:
2. Fonte Luminosa
3. Detector
1. Termociclador

Vol 20, issue 12, pg 68, Dec 2006
16 (www)
1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential
Como funciona o PCR em Tempo Real?
• Como um produto da amplificação, a fluorescência irá
aumentar com esse produto.
PCR PCR
PCR product
Lots of PCR

Aplicações Proteínas
Carga Viral
Real-Time Expressão Gênica
Quantitativa
Transgênicos
ABI Real-Time MicroRNA
PCR Systems siRNA knockdown
HRM CNVs
DNA residual
End-Point Genotipagem (SNPs)
Qualitativa
Inserções/Deleções
Translocações
Detecção de Patógenos
Farmacogenômica
HRM
Taxa de Duplicação de DNA por PCR
Log Target DNA Theoretical
Real Life
Cycle

Amplificação Geométrica

Fases de uma PCR
Linear
Baixa Eficiência
Platô
Sem Amplificação
Log [DNA]
Detecção em gel
com brometo
Exponencial
Alta Eficiência
No de Ciclos
Real-Time x End-Point
Leitura ‘End
Point’
linear
log
Quantificação
‘Real Time’

PCR Quantitativa em Tempo Real
• Há uma relação quantitativa entre a quantidade inicial da amostra alvo e a
quantidade de produto da PCR após um determinado número de ciclos.
P = T (1+E)n P = Produto final

T = Template no início da reação
Pfinal n = Número de ciclos
Tinicial =
(1+E)n E = Eficiência
Método usado para medir a quantidade de DNA/cDNA inicial

amplificado por PCR.

Amplificação Geométrica
Eficiência de 100% Eficiência de 85%

Eficiência de Amplificação
Depende de:
● Preparo da reação (pipetagem)
● Qualidade do template (integridade do DNA/cDNA)
● Presença de inibidores (qualidade de extração)
● Desenho dos primers (Tm, estruturas secundárias)
● Condições de termociclagem (T de anelamento, rampa)
● Qualidade dos reagentes
● Concentração dos reagentes
● Tamanho do amplicon

Baseline
− Fase onde a intensidade de sinal de produto amplificado ainda não ultrapassou a
intensidade da fluorescência encontrada no meio.
Ciclos iniciais da
PCR com poucas
mudanças no sinal
de fluorescência
Baseline

Threshold
− Nível arbitrário de fluorescência estabelecido acima do Baseline e dentro da
região de crescimento exponencial.

Threshold Cycle (Ct) ou Quantification Cycle (Cq)
- Número do ciclo da PCR no qual a fluorescência atinge o
Threshold.
Ct = 20,5 Ct = 31

Threshold Cycle (Ct)
1000
100
Etapa exponencial
10
Threshold
1
∆Rn
0.1 A posição de cada curva

de amplificação depende
0.01 do número inicial de cópias
de DNA presente em cada
0.001 amostra.
0
10 20 30 40
Ciclos
Ct=22 Ct=30
Ct=28
Ct=20
Threshold Cycle (Ct)
1.25mil
2.5mil
5mil
10mil
20mil
CT aumenta um (1)
ciclo quando o número
inicial de cópias na
reação é a metade
CT=

Multicomponent

Reporter Normalizado (Rn)
− Sinal fluorescente de um “reporter dye” normalizado pelo sinal fluorescente de uma
referência passiva (ex: ROX)
− ROX: fluorescência presente no meio (correção do volume e resolução de problemas)
− Normalização: fluorescência do alvo ÷ fluorescência ROX

Referência passiva
Sem ROX Com ROX

∆Rn)
Reporter Normalizado (∆
• Reporter normalizado corrigido pelo Baseline (∆Rn)
− ∆Rn (ciclo) = Rn (ciclo) – Baseline, onde Rn = Reporter normalizado

Reporter normalizado: ∆Rn
∆Rn: Normalização do reporter menos o sinal de background

(nível da linha de base).
CT

Threshold
Threshold bom Threshold alto
Threshold baixo

Baseline
Baseline correto: 3-17 Baseline alto: 3-25
baseline baseline
Baseline baixo: 3-5
baseline

Sistemas de Detecção:
SYBR® Green e TaqMan
Sistemas de Detecção
A Applied Biosystems oferece dois tipos de químicas para detecção de
produtos de PCR:
− Agentes ligantes de DNA (SYBR® Green I e MeltDoctor ®/SYTO 9)
− Sondas de hidrólise (Química TaqMan®)

Agentes Ligantes de DNA

Agentes Intercalantes de DNA



Agentes Ligantes de DNA
Características:
− Ligante de DNA dupla fita
− Fluoróforo em suspensão no master mix
− Inespecífico
− *Permite multiplex
*Development of a versatile tool for the simultaneous differential detection of

Pseudomonas savastanoi pathovars by End Point and Real-Time PCR.
BMCMicrobiology 2010, 10:156 doi:10.1186/1471-2180-10-156
StefaniaTegli; Matteo Cerboneschi; Ilaria Marsili Libelli; Elena Santilli

Curva de Dissociação (melting curve)
− Experimento utilizado para detectar e discriminar moléculas de ácido
nucléico dupla fita resultantes da reação de PCR
− Temperatura de melting (Tm): temperatura onde metade do produto
da PCR está dissociado (denaturado)
− Tm: depende do tamanho do fragmento e %GC

Curva de Dissociação
Quantidades diferentes
do mesmo template

Target Amplification
Target Amplification
NTC
NTC
Produtos inespecíficos (dímeros) são comuns nos poços

negativos e facilmente diferenciados pela curva de dissociação.

Produtos inespecíficos
(dímeros) também são
A comuns quando há excesso
de primers em uma reação
ou quando houve falha no
desenho dos primers (grande
região de homologia).

• Comparação: Gel de Agarose e Curva de Melting
L A B C D E F G H I J K L M N

Sondas TaqMan®
Ensaios 5' Nuclease com Sondas TaqMan®
• Sondas Lineares (de hidrólise):
− PCR inclui, além dos primers, uma sonda conjungada com:
> Fluorocromo “reporter” → emite fluorescência
> Molécula “quencher” → absorve fluorescência emitida pelo reporter (sonda

intacta)

Sondas TaqMan®
R 5’ 3’ Q
5’Nuclease
R
Q

Sondas TaqMan®
• Denaturação

Sondas TaqMan®
• Anelamento da Sonda

Sondas TaqMan®
• AmpliTaq Gold® DNA Polymerase e Lise das sondas

Sondas TaqMan®
• AmpliTaq Gold® DNA Polymerase e Lise das sondas

Sondas TaqMan®
• Características:
− Baseia-se na atividade 5’-3’ exonuclease da Taq polimerase
− Funciona com sondas fluorescentes
− Altamente específico e sensível
− Não permite, nem precisa de curva de dissociação
− Permite multiplex

Sondas TaqMan®
• Características:
− Localiza-se ~1-5 bases do primer forward
− Tm deve ser ~10°C maior que Tm dos primers
− A primeira base não pode ser G (efeito quencher)
− Não pode ter mais Gs do que Cs
− Não deve ter mais que 3 bases consecutivas iguais

Sondas TaqMan®
• TaqMan® Fluorescent Dyes

− Referência Passiva
> ROX
− Reporters
> FAM, VIC, NED, TET*
− Quenchers
> TAMRA** e NFQ

Sondas TaqMan®
• Tipos de Sondas
− TaqMan® TAMRA™ Probes
> Quencher fluorescente (TAMRA™)
> ~30-40 bases
− TaqMan® MGB Probes

> Quencher não fluorescente (NFQ)
> Sonda com cauda MGB (Minor Groove Binding)
> ~15-20 bases

Sondas TaqMan® MGB
R : Reporter dye (FAM e VIC)

Q : Quencher
NFQ : Non-Fluorescent Quencher
MGB : Minor Groove Binder (Tm enhancer)

INTERVALO!!!

Purificação de ácidos nucleicos
O que é um RNA de boa qualidade?
Quantidade suficiente para realizar o experimento

(rendimento)
Razão 260/280 entre 1.9 e 2.1
Aparece bem no gel de agarose (integridade)
Não contém DNA
Não possui nucleases – é estável durante o armazenamento
Ausência de inibidores (tecido/extração)
Amplifica (RT-PCR)
Livre de RNAs não-informativos

RNases: as vilãs na instabilidade do RNA
Encontradas em todo lugar
− ex. bancada, mãos, pele, cabelos, unhas, saliva, etc
Algumas são sequência específicas

− RNase A corta 3′ de resíduos U e C
− RNase T1 cliva após G’s
RNase A é altamente estável RNase A

Image from Raines Lab,
− Suporta condições extremas tais como temperatura e altas University of Wisconsin
concentrações de sal
Podem não ser destruídas por autoclave

− Deve-se fazer tratamento com DEPC ou RNaseZap®

Reduzir exposição a RNases do ambiente
Qualquer item que possa entrar em contato com o RNA purificado deve
ser livre de RNAse
Descontamine bancadas, pipetas e vidrarias com solução RNAseZap®
Utilize ponteiras, tubos e soluções RNase-free e troque
frequentemente de luvas
Mantenha reagentes e caixas de ponteiras sempre fechados

Fluxograma para isolar RNA
Coleta da Amostra
Linhagens
Estabilização
Celulares
Homogeneização Tecidos
Isolamento RNA
Sangue Análise quanti/quali
Ensaios

Pontos Importantes quando se deseja isolar RNA
Os problemas geralmente não ocorrem no ato da

extração e sim antes e depois da mesma
Tratamento e Manipulação Estocagem

− Método de coleta
− Método de lise

Fluxograma para isolar RNA
Coleta da Amostra
Linhagens
Celulares Estabilização
Homogeneização
Tecidos
Isolamento RNA
Sangue
Análise quanti/quali
Ensaios

Diferentes Tecidos Apresentam Diferentes Níveis de
Atividade de RNAse
Atividade de RNase (Comparado ao Cérebro)
100000 10000 1000 100 10 1
Pulmão Timo
Pâncreas Fígado Coração
Baço
Rim
Cérebro

Inative IMEDIATAMENTE as RNAses endógenas
Existem 3 diferentes métodos para fazer isso:
− Homogeneizar as amostras imediatamente após coleta em

uma solução de lise contendo guanidina (solução
desnaturante)
− Congelar amostra em nitrogênio líquido. Pedaços de tecido
devem ser pequenos.
− Utilizar solução de preservação (solução de RNAlater®)

RNAlater®
Solução aquosa, preservação não-tóxica do tecido
Estabilização do RNA
Elimina necessidade de processar/congelar imediatamente as amostras
Amostras em RNAlater podem ser estocadas por períodos prolongados em

temperatura ambiente ou a 4°C
Podem ser estocadas indefinidamente a –20°C

Tecidos: fígado, baço e rim
RNAlater®
Preservação aquosa e atóxica do tecido

− Fornece separação espacial e temporal da coleta e processamento, sem
comprometer a qualidade ou quantidade
Cortar < 5mm x 5mm
RNA
RNAlaterTM Adicionar o Remover Adicionar Romper Homogeneizado

tecido para RNAlaterTM tampão de tecido
estocar lise

Solução RNAlater®
Tempo (Segundos)
Adicionado
Processado RNAlaterTM
Imediatamente
Adicionado
Processado RNAlaterTM
após 4 h
à 25 °C

Utilize condições de estocagem apropriadas para a
amostra
O tecido deve ser estocado a -80°C e não deve descongelar nunca até o
74
momento da extração 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential
RNAlater®-ICE Frozen Tissue Transition Solution
Para processamento de tecidos previamente congelados

Descongelamento de tecidos em RNAlater®-ICE protege o RNA
contra degradação
Subdivida facilmente porções do tecido para diferentes
experimentos

Homogenize muito bem as amostras
Passo essencial para evitar perdas e degradação

Deve ser rápido e homogêneo
Deve ser adaptado a cada tipo de amostra
Geralmente mecânico:
− Polytron, vortex, maceração....
ou enzimático

Fluxograma para Isolar RNA
Coleta da Amostra
Linhagens
Homogeneização
Tecidos
Isolamento RNA
Sangue
Análise quali/quanti
Ensaios

A Matriz Extracelular e os Tecidos Conectivos podem
complicar a extração
Consistência do Tecido
Duro ou Fibroso Médio Macio
Cérebro
Osso Rim
Pulmão
Musc. Esq. Bexiga Figado
Baço
Coração
Adiposo

Diferentes métodos de homogeneização
Dounce Potter-Elvhejam
Cadinho e Homogeinizadores
Pestilo Liquidos Liquidificador
Rompimento Polytron
do tecido
Ciclo de pressão
Freezer Mill Bead Mill Sonicador

FastPrep Vortex

Coleta da Amostra
Linhagens
Isolamento RNA
Sangue
Análise quali/quanti
Ensaios

Escolha do kit de purificação
1. Qual é o ácido nucleico a ser purificado?
1. DNA
2. RNA (RNA total, mRNA, microRNA)
2. Qual é o material de partida?
1. Células Animal 4. Amostras forenses

2. Tecido Vegetal 5. Bactéria, levedura
3. Sangue 6. FFPE, LCM
3. Qual é a aplicação?
4. Qual o formato de escolha?

5. Quantas amostras serão processadas por vez?

Métodos de Extração de Ácidos Nucleicos
Extração de
Ácidos Nucleicos
Extração com
Extração orgânica Beads Magnéticas Colunas
(membranas de sílica)
Combinação dos
métodos acima
(para RNA)

Extração Colunas çom
Beads
orgânica membranas de
Magnéticas
sílica
• TRIzol® •PureLink™ RNA mini kit •MagMAX™-96 Total

RNA Isolation Kit
•PureLink™ RNA micro kit
•MagMAX™-96 Blood
RNA Isolation Kit
•MagMAX™ Viral RNA
Isolation Kit
•MagMAX™ Total
Nucleic Acid Isolation
Kit
TRIzol® Plus

TRIzol®: Fenol ácido + guanidina

Fenol tamponado x Fenol ácido (TRIzol®)
FASE RNA RNA

AQUOSA
DNA
INTERFASE DNA
FASE Proteínas Proteínas

ORGÂNICA
Lipídeos Lipídeos
Fenol Neutro Fenol ácido

Tamponado (pH 4.5–5.5)
(pH ~7.9)

TRIzol®
Lise das células
Formação do com Trizol Adição de Fase aquosa
pellet celular clorofórmio
Centrifugação Fase orgânica
Coletar
Ressuspender o sobrenadante
RNA
RNA em água Centrifugação Adição de etanol DNA
Proteínas

Tipos de TRIzol®
TRIzol® Reagent (15596026 100mL, 15596018 200mL)

TRIzol® LS Reagent (10296028 200mL, 10296010 100mL): Para
extração de RNA de amostras líquidas
TRIzol® Plus Reagent (12183555): Combo TRIzol (100mL) +
Colunas para purificação de RNA Purelink mini kit (50 colunas)
TRIzol® Max Bacterial RNA Isolation Kit (16096020 100mL de
TRIzol e 20 mL de Max Bacterial Enhancement Reagent):
Específico para Extração de RNA de Bactérias.
Max Bacterial Enhancement Reagent (16122012 20mL) –
Elimina lise mecânica e enzimática

Purificação por afinidade à resina de sílica ou GFF
(fase sólida)
Permite uma purificação mais rápida e
eficiente que os métodos convencionais
hydrophobic solution
− Previne a separação incompleta de fase ou (ethanol)
O O O
contaminação durante a pipetagem nas extrações O P

O-
O O P
O-
O O P
O-
O
líquido-líquido semi-hydrophilic filter
Adsorção é dependente do pH e da força

iônica
− Princípio: alta afinidade do backbone negativo
pelas partículas de sílica
Diferentes tipos de sílica

− GFF (borosilicato) ligam preferencialmente RNA a
DNA na presença de sal e etanol em
concentrações específica

MagMAX™
Magnetic Bead Nucleic Acid Purification
Protocolo simples fácil de aprender

Protocolo rápido
Alta escala, fácil automação
Exclui problema de entupimento de
filtro
Purifica tanto DNA quanto RNA
Funciona para muitos tipos de células
Alta consistência
Contaminação cruzada é minimizada
Efetivo na remoção de inibidores

Beads Magnéticas: a tecnologia MagMaxTM
Solução de lise
+
beads magnéticas
+
amostra Tampão de Lavagem Tampão de eluição
Lise e ligação do Captura das beads no Lavagem Separação Eluição

ácido nucléico às suporte magnético
beads e separação do ácido
nucléico Os passos de lavagem são
repetidos com tampões distintos

Purificação com beads magnéticas
MagMAX™ Total RNA Isolation Kit

Suportes Magnéticos para extração manual - Ambion
Single Tube Magnetic Stand
96-Well Magnetic-Ring Stand

-Cada well é envolvido por um ímã
6 Tube Magnetic Stand

Suportes Magnéticos para extração manual - Dynal
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/brands/Dynal/Ma
gnets.html?CID=fl-magnets
DynaMag™-2 DynaMag™-Spin DynaMag™-15 DynaMag™-50

Tubos 1,5-2,0 mL Tubos 1,5 mL Tubos 15 mL Tubos 50 mL
DynaMag™-96
side & bottom

Aplicações Específicas

RecoverAll™ Kit – para tecidos parafinados
Front End: Protease
Digestion
designed to minimize
fragmentation during
digestion
Place De- Resuspend Digest at elevated

Cut off 4 debris in
slices (up paraffinize temperature 3 h
-20 µm proprietary
to 80 µm slice(s) (RNA) to 2d (DNA)
slices digestion buffer
total) in using xylene
tube and alcohol
Back End: Capture

& Elution on GFF
designed to Add proprietary
maximize recovery additive and
of small species Perform multiple ethanol to
Elute sample washes and 30min Place over digestion mix
in 2 x 30 µl DNase or RNase GFF
treatment (5 washes ‘column’
total, 2 compositions)

Tempus™ Blood RNA tubes

Kits compatíveis com TempusTM Blood RNA tubes
TempusTM Spin RNA Isolation kit
MagMaxTM for Stabilized Blood
Stabilized Blood-to-CTTM
Tempus 12-Port RNA Isolation Kit Para equipamento 6100

Nucleic Acid PrepStation
Tempus 6-Port RNA Isolation kit (descontinuado)

LeukoLOCKTM Isolamento de RNA total
Fraciona os leucócitos do sangue total em minutos

Extrai RNA total dos leucócitos
Nenhum passo adicional para remoção de globinas
Estabiliza o RNA para análises do perfil de expressão gênica
Preserva os leucócitos à temperatura ambiente durante dias

GLOBINclear™ Whole Blood
Globin Reduction Kits
Remove >95% do RNAm da globina do

RNA total do sangue
Detecta 50% mais genes
Eletroferograma de RNA amplificado a

partir de sangue total tratado com
GLOBINclearTM e não tratado

Isolamento de mRNA
Dynabeads® mRNA DIRECT™ Kit

Dynabeads® mRNA Purification Kit for
mRNA Purification from Total RNA preps
Dynabeads ® oligo dT (25)

Isolamento de microRNAs
mirVana™ miRNA Isolation Kit

Isolamento de RNAs pequenos a partir de tecido e células
Extração orgânica + purificação em GFF (glass fiber filter)
Isolamento de RNA total – kilobases a 10 bases
Enriquecimento de RNA < 200 bases

mirVanaTM miRNA Isolation kit

RNA + proteínas (Protein And RNA Isolation System)
− mirVana™ PARIS™
> Enriquece para RNAs < 200 nt
− PARIS™
> Sem enriquecimento de pequenos RNAs
> Sem uso de fenol
> Lise diferencial membranas no núcleo e citoplasma

Métodos para purificação de ácidos nucleicos
Filtro com Fibra de

Método Orgânico Beads Magnéticas
Vidro (GFF)
- ISTNGu/Fenol - ISTNGu + Álcool -Beads Magnéticas
Protocolo - Extração - Filtro G/F
- Precipitação: álcool
- Gold standard - Pureza - Protocolo simples
- Baixo custo - Fácil, rápido - High throughput
Vantagens - Altamente adaptado - Variedade amostras - Alta sensibilidade
- Amostras difíceis - Médio throughput -Alta consistência
- Baixo throughput -Entupimento do Filtro -necessita de rack
Desvantagens - Produto tóxico -Processamento de magnética
-Potencial inibição amostras > 24 e <96
Tempo ~2 horas ~60 minutos ~30 minutos
Produto Trizol
TRIzol Reagent® Plus™ Kit kit
PureLink® MagMaxTM
Trizol Plus
RNA Selection Guide
http://www.lifetechnologies.com

Tratamento com DNase
Necessária quando o RNA será utilizado para RT-PCR
Altamente recomendada quando isolando RNA de tecidos como

baço e timo (estes contém alta quantidade de DNA)
DNAse I, amplification grade (RNAse free); TurboTM DNAse; DNA-

freeTM

Ressuspensão
A solução de ressuspensão de RNA deve ter 3 características:
RNase-free
pH neutro a ácido (pH 6-7)
Possuir agentes quelantes que protegem RNA contra

degradação por nucleases e cátions divalentes (ex. Citrato de
Sódio e EDTA)
As soluções Ambion: The RNA Storage Solution, RNAsecure™
Reagent e RNAsecure™ Resuspension Solution possuem
condições ótimas para ressuspensão de RNA.

Soluções para o armazenamento do RNA
The RNA Storage Solution: 1 mM sodium citrate, pH 6.4 +/- 0.2

− Maior estabilidade do RNA
> Citrato de sódio: agente quelante
> Baixo PH
0.1 mM EDTA: em água ultra-pura e ausente de RNases
Tampão TE: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.0

RNAsecure™ Reagent
Elimina o tratamento com autoclave
Seguro, reagente fácil de utilizar que inativa RNases em
solução
Processo de inativação pode ser repetido para protejer contra
contaminantes novamente introduzidos
Inativa RNases no Tris e em outras soluções que não pode ser
tratadas com DEPC
Compatível com reações de RT-PCR e transcrição in vitro
− Sem efeito na transcrição in vitro (ex: RNA poli T7 e T3)

RNAsecure™ Resuspension Solution
Contém os mesmos ingredientes ativos do RNAsecure

Reagent, mas é fornecido em uma concentração de
trabalho para ressuspender os pellets de RNA.
Efeito do RNAsecure™ Resuspension

Solution no RNA tratado comRNase.

Estocagem
Curto período:
− Estoque a -20°C
Longo período:
− Estoque a -80°C
Aliquote seu RNA em vários tubos

− Evite múltiplos descongelamentos de cada alíquota
− Previna contaminações com RNase

Purificação de DNA

http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-
Services/Applications/Nucleic-Acid-Purification-and-Analysis/DNA-
Purification/DNAP-Misc/NA-Purification-Overview.html

Colunas com Beads
Extração
membranas de Magnéticas
orgânica
sílica
•MagMAX™ DNA Multi-
• DNAzol® • PureLink™ Genomic DNA Sample Kit
Mini Kit •MagMAX™ Total Nucleic
• DNAzol® BD
• PureLink™ 96 Genomic Acid Isolation Kit
• Plant DNAzol® DNA Kits •Dynabeads® DNA
• Easy-DNATM kit • PureLink™ Genomic Plant DIRECT™ Kit
DNA Purification Kit •Dynabeads® DNA
• PureLink™ Viral RNA/DNA DIRECT™ Blood Kit
Mini Kit •PrepFiler™ Forensic
DNA Extraction Kit
* PrepMan® Ultra Sample

Preparation Reagent

Prepman® Ultra
• Extração de DNA a partir de várias fontes:

Bacteria
Fungo
Tecidos de mamíferos
Cabelo
Células humanas (swab bucal e outros)
Sangue total
Preparo plasmidial
100 a 200 uL
o Recuperar o
10 minutos à 100 C 1 minuto à 10.000 g sobrenadante.

Extração Orgânica (DNA)

DNAzol®
Reagente para purificação de DNA genômico pronto para uso
Solução de guanidina + detergentes
Tipos de DNAzol®
DNAzol® Reagent (10503-027)
DNAzol® BD Reagent (10974-020): Extração de DNA de amostras

líquidas (sangue)
Plant DNAzol® Reagent (10978-021 ): Extração de DNA de Planta

DNAzol® Precipitar o
DNA com
Etanol 100%
Lise das células

com DNAzol Adição de
clorofórmio
Centrifugação
25-50 mg tecido, (opcional)
1-3 ×107 cels ou
0.1 mL amostras
líquidas
Ressuspender o Secar Lavar o DNA
DNA 8 mM NaOH Com Etanol 75%

(2X)

Colunas com membranas de
sílica

Purificação com Sílica - PureLinkTM
Células são lisadas em sais caotrópicos e solventes orgânicos → precipitação

de proteínas e debris celulares e ligação do DNA à matriz
Solução alcoólica → lavagem dos sais e debris celulares
Água ou tampão usado para eluição do DNA da coluna

Beads Magnéticas (DNA)

Extração de DNA genômico
• MagMAX™ DNA Multi-Sample Kit

Extração de DNA
MagMAX™ Total Nucleic Acid Isolation Kit

Dynabeads®
Tamanho uniforme (1 µm)
Superparamagnéticas (Óxido de Ferro)

– Exibem atividade magnética somente
quando colocadas em campo magnético,
não apresentam magnetismo residual
quando removidas do campo
Cobertas com polímeros – Superfície

de composição definida e específica,
evita contato com o metal
Alta estabilidade (18 a 24 meses)

Aplicações específicas
FFPE - formalin-fixed, paraffin-embedded - amostras de tecido fixado em
formol e incluído em parafina
− MagMAX™ FFPE DNA Isolation Kit (4463578)
> Beads magnéticas; DNA
− MagMAX™ FFPE Total Nucleic Acid Isolation Kit (4463365)

> Beads magnéticas; DNA+RNA
− RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE (AM1975)

> Colunas; DNA+RNA
LCM (amostras resultantes de microdissecção a laser)

− Pico Pure® DNA kit

PureLink™ DNA Stabilization Reagent
Tecnologia nova
Armazenamento de DNA em alíquotas, em temperatura
ambiente
Ambiente seco (water-free) protege amostras de DNA de
hidrólise
Formas de apresentação
PureLink™ DNA Stabilization Reagent - 3 Tube Sample Kit
PureLink™ DNA Stabilization Reagent - Tube Kit
PureLink™ DNA Stabilization Reagent - 96 Well Plate Kit
PureLink™ DNA Stabilization Reagent - Cluster Tube Kit

DNAZap (AM9890)
Soluções DNAZap – reagentes capazes de degradar DNA e RNA

contaminante de todos os tipos de superfície
Indicadas para prevencão de contaminação por DNA em PCR
DNA é degradado a nucleotídeos livres

Coleta da Amostra
Linhagens
Isolamento RNA
Sangue
Análise quanti/quali
Ensaios

Análise quantitativa e qualitativa
de ácidos nucléicos
Métodos de quantificação
Espectrofotômetro (absorbância UV)
− Simples, sensível, amplamente utilizado
− Quantificação e pureza
Agilent 2100 Bioanalyzer

− Requer quantidade pequena de ácido nucleico (1 µL, 25 ng)
− Pode tanto quantificar quanto medir a integridade
QubitTM
− Fluorímetro
− Corante específico
− Requer quantidade pequena de amostra (1 µL- 20 µL)
− Maior precisão e sensibilidade do que leitura de abs. em UV

Qubit™ Quantitation Platform

Qubit™ Quantitation Platform
• Tecnologia Quant-iTTM
> Família de fluoróforos seletivos – DNA, RNA ou proteína
> Maior especificidade
• Não detectam contaminantes

> Outras biomoléculas
> Nucleotídeos livres
• Maior precisão e sensibilidade

> 1-20 µL de amostra
> Amostras diluídas

Kits para uso com QubitTM
DNA genômico, amostras
− QubitTM ds DNA BR (Broad Range)
para sequenciamento e
clonagem
− QubitTM ds DNA HS (High Sensitivity)
Quantificação de
− QubitTM ssDNA oligonucleotídeos, experimentos
de hibridação, cDNA
− QubitTM RNA
Amostras para microarrays, PCR
em tempo real, Northern blots
− QubitTM RNA BR (Broad Range)
Amostras para Western blotting, ensaios

− QubitTM protein funcionais, SDS-PAGE ou eletroforese 2D

Kits para uso com QubitTM
Kit Range Concentração inicial amostra

QubitTM ds DNA HS Assay 0,2 – 100 ng 10 pg/uL – 100 ng/uL
QubitTM ds DNA BR Assay 2 – 1000 ng 100 pg/uL – 1 ug/uL
QubitTM ssDNA Assay 1 – 200 ng 50 pg/uL – 200 ng/uL
QubitTM RNA Assay 5 – 100 ng 250 pg/uL – 100 ng/uL
QubitTM RNA BR Assay 20 – 1000 ng 1 ng/uL – 1 ug/uL
QubitTM Protein Assay 0,25 – 5 ug 12,5 ug/mL – 5 mg/mL

Comparação de sensibilidade e range
2 ng/uL-15 ug/uL
QubitTM
10 pg/uL-1 ug/uL
QubitTM
QubitTM
250 pg/uL-1 ug/uL
QubitTM

Teste comparativo: QubitTM x métodos baseados
em absorbância a 260nm
Qubit Qubit 260nm-

260nm-based
RNA DNA HS quantification

Protocolo de utilização dos kits QubitTM
Armazenamento:
Dye e buffer: TA
Standards DNA, RNA e proteína: 4 °C
Reagentes em TA para começar o ensaio

Rendimento da extração depende de vários fatores
Tempo de coleta
Preservação
Tipo de amostra/tecido
− Forense
− Sangue (número de leucócitos)

Rendimento da extração de RNA

Análise qualitativa de ácidos nucleicos
-Pureza (A260/A280 e A260/A230)

-Integridade

Pureza
Espectro de Absorbância: Absorbância máxima em 260nm;

amostra típica apresenta A260/280 = ~1.8-2.0 (DNA) e A260/280 =
~1.9-2.1 (RNA)
A260/230 ⇒ medida secundária de pureza
A260/280 <1.7
- indica presença de proteínas ou outros contaminantes
que absorvem em 280 nm

Analisando a pureza do RNA
Espectrofotômetro
A260/280 Ratio vs. Protein (%) in Raji RNA
2.1
2
A260/280 Ratio
1.9
1.8
1.7
1.6 • A260/280 Ratio
1.5
1.4 Protein (%) w/w (BSA)
1.3
-20 0 20 40 60 80 100
Um RNA puro deve apresentar um valor de razão A260/280 de ~2.0. RNAs com valores
muito baixos devem ser novamente purificados por extração com fenol-clorofórmio,
tratamento com DNAse, preparo com Cloreto de Litio ou precipitação/lavagem com
álcool para remover sais residuais.

Integridade do DNA: gel de agarose

Rendimento e qualidade – gDNA Tissue Kit
1 Kb DNA Ex
Ladder
10 mg tecido

Analisando a integridade do RNA: gel de
agarose
28S rRNA
18S rRNA
5S/ 5.8s rRNA

Analisando a Integridade do RNA
Eletroforese em gel de agarose desnaturante
RNA intacto RNA degradado

- Razão de 2:1 ratio - Bandas 28S e 18S
entre rRNAs 28S e apresentam smear
18S - Razão 28S/18S muito
baixa

Analisando a Integridade do RNA
Agilent 2100 Bioanalyzer

Requer apenas 1 ng de RNA total
RIN (RNA Integrity Number), 0–10. Avalia todas as regiões e não só 18S e 28S
Razão 28S/18S rRNA deve estar próxima de 2.0
28S/18S = 2.0
28S
RIN = 7.6
18S conc = 28 ng/µL
Rendimento = 4.2 µg

Perfil de RNA total eucariótico
preservado
120
110
100 No small, well defined peaks Distinct 28S Ribosomal Subunit

between ribosomal peaks (usually ~2X 18S)
90
80
70
Fluorescence
Distinct 18S Ribosomal Subunit

60
Flat Baseline throughout
50
electropherogram
40
30 (5s Subunit)
Prep Dependant
20
10
18S
28S
0
19 24 29 34 39 44 49 54 59
Time (seconds)
Fonte: Agilent

Perfil de RNA total degradado
- Considerar re-extração
2.25
2.00
1.75
1.50 18S ribosomal 28S ribosomal subunit

subunit In general, the 28S peak
1.25 begins to degrade first.
Fluorescence
1.00 Intensities of the smaller

degraded RNA
0.75 increases The peaks begin to shift toward
the left of the electropherogram
0.50
0.25
18S
28S
0.00
19 24 29 34 39 44 49 54 59
Time (seconds)
Baseline between and to the left of the Intensities of the peaks decrease.
ribosomal peaks becomes jagged.
152
Fonte: Agilent
Importância da Integridade do RNA
250
Fluorescence
200
Impacto da
integridade do RNA
150
100
50
nos níveis de
18S
28S
0
19 24 29 34 39 44
Time (seconds)
49 54 59 64 69
expressão
50
45
mensurados:
40
35
30
Fluorescence
25
20
15
diferença de ~10X
10
5
18S
19 24 29 34 39 44 49 54 59 64 69
Time (seconds)

Síntese de cDNA
Dogma Central da Biologia Molecular
Transcrição Tradução
Amplificação DNA RNA Proteína
B
PCR
Transcrição Reversa
A RT
A: Transcriptase Reversa
B: DNA Polimerase (ex: AmpliTaq Gold® DNA Polymerase, UP)

Por que fazer a síntese de cDNA?
DNA Polimerase não usa RNA como “template”
Primeiro é necessário fazer a transcrição reversa do RNA

em cDNA (DNA complementar)
> RT: Reverse Transcriptase
Após a transcrição reversa, prossegue-se normalmente

com o PCR

RT-PCR
Reação de transcrição reversa seguida de PCR
Material de partida: RNA
RT PCR
RNA cDNA DNA
1ª fita

Principais componentes da transcrição reversa
RNA molde
Primer (iniciador)
dNTPs
Enzima transcriptase reversa + tampão
• Inibidores de RNAse (ex: RNAseOUTTM)
• RNAse H
• DNAse I (antes de fazer o cDNA)

Tipos de primers

Aspectos para considerar
Opções de primers:
− Random Primers
> Todos os RNAs servem como molde → especificidade é dada
pelos primers da PCR
> 96% RNA → RNA ribossômico e transportador
> Ideal para RNAs difíceis de serem copiados em sua
integridade

− Oligo dT
> Específico para mRNA - Cauda poli (A)
> 3’ - UTR

− Primer-específico
> Primer contém a informação complementar ao RNA alvo.

− Random primer + Oligo dT
> Maior sensibilidade e cobertura

Transcriptase reversa
RT (reverse transcriptase) - DNA polimerase dependente de RNA
DNA polimerase que utiliza RNA como “template”
A polimerização é sempre na direção 5’ → 3’
Domínio RNAse H
Presente em vírus RNA - retrovírus (ex: HIV, HCV)

Quais atividades enzimáticas as transcriptases reversas
possuem?
Ambas AMV e M-MLV RT possuem duas atividades principais:
− Atividade DNA polimerásica dependente de RNA
− RNase H
> Degrada a fita de RNA a medida que o cDNA é gerado (híbrido DNA:RNA)
− Atividade DNA polimerásica dependente de DNA (não é significativa e

geralmente não é explorada pelas aplicações em biologia molecular)
A atividade de DNA polimerase é essencial para a síntese de cDNA.

Entretanto, a RNaseH pode ser indesejável por interferir com a capacidade
da enzima de produzir cDNAs completos em seu comprimento.

Transcriptase reversa
Características importantes
↑ Estabilidade térmica
Reduzir efeitos da estrutura secundária do RNA
↓ Atividade RNAse H

1-Step x 2-Step RT-qPCR
1-Step 2-Step
Passo 1:
Conversão do
RNA para
cDNA
Único Tubo:
Conversão do
RNA para cDNA,
amplificação e
quantificação do
cDNA
Passo 2:
Amplificação e
quantificação do
cDNA

Aspectos para considerar:
One-step Two-step
Kit contém enzima para RT e RT e PCR em tubos separados
enzima para amplificação
RT feita com primers randômicos
RT e PCR no mesmo tubo e/ou oligo dT
Necessita de primer específico Mais lenta
para a RT (GSP)
Maior chance de erro
Mais rápida
Maior risco de contaminação
Menor chance de erro
Maior flexibilidade
Menor risco de contaminação
Permite usar cDNA em mais de
Formato mais conveniente uma reação
Demanda alta

Comprovar remoção do DNA
Reação de amplificação RT(-)
RT(+)
RT(-)
RT(-) : Amostra de RNA que não passou pela transcrição reversa. Usada para
verificar possíveis contaminações de DNA genômico.

Opções de kits
Real-Time PCR Workflow
Sample Reverse
Real-Time PCR
Preparation Transcription
Cells / Tissue, etc. RNA DNA
RNA-to-cDNA™ Product Line qPCR Master Mix
RNA-to-CTTM Production Line (kits One Step)
Cells-to-CTTM Product Line

SuperScript® III First-Strand cDNA Synthesis
Kits para síntese da primeira fita do cDNA

contêm SuperScript® III RT, RNaseOUT™, dNTPs, random
primers e oligo(dT)20
SuperScript® III First-Strand SuperScript® III First-Strand

Synthesis SuperMix Synthesis System
Cat. No. 18080-400 Cat. No. 18080-051
50 reações 50 reações
Mix enzimas, tampão, mix, primers Tubos separados

SuperScript® VILO
Variable Input, Linear Output
SuperScript® III + tampão otimizado

Alto rendimento
Linearidade (1 pg – 2.5 ug RNA)
Indicada para ensaios de PCR em tempo real

Opções de kits
Sample Reverse
Real-Time PCR

RNA-to-CT™ (RT-qPCR) 1-Step Kits

TaqMan® Fast Virus 1-Step Master Mix
Alta sensibilidade – um tubo, one-
step 4X master mix para amplificar
tanto RNA como DNA viral com alta
qualidade
Resultados consistentes –
desenvolvido para solucionar os
problemas com os maiores inibidores
de RT-PCR encontrados em sangue,
e amostras difíceis
Flexibilidade em alvos –
trabalhando em singleplex, multiplex,
e com controles endógenos e/ou
exógenos
Alta eficiência – aumentando a
velocidade em equipamentos FAST
ou Standard

Outras opções de kits One-Step
•SuperScript® III Platinum® SYBR® •Path-ID™ Multiplex One-Step Kit

Green One-Step qRT-PCR Kit
•AgPath-ID™ One-Step RT-PCR Reagents
•SuperScript® III Platinum® SYBR® •TaqMan® One-Step RT-PCR Master Mix
Green One-Step qPCR Kit w⁄ROX
•TaqMan® EZ RT-PCR Core Reagents
•EXPRESS One-Step SYBR® •SuperScript® III Platinum®One-Step qRT-
GreenER™ Universal PCR Kit (com e sem ROX no mix)
•EXPRESS One-Step SYBR® •EXPRESS One-Step SuperScript® qRT-PCR

GreenER™ with Premixed ROX Universal or Premixed ROX

Opções de kits
Sample Reverse
Real-Time PCR

Cells-to-Ct™ Kits
• Isola RNA de células em cultura em ~10 minutos! Não requer purificação
do RNA
• Kits para diversas aplicações:
• TaqMan® Gene Expression Cells-to-
CT™ Kit
• TaqMan® PreAmp Cells-to-CT™ Kit
• TaqMan® MicroRNA Cells-to-CT™ Kit
• Fast and Power SYBR® Green Cells-to-
CT™ Kits
• Single Cell-to-CTTM
• Componentes do Kit
Reverse Amplify &
• Solução de lise Lyse
Transcribe Detect
• DNAse
• Reagente para RT
• MasterMix para Real Time PCR

Cells-to-Ct™ Kits

Single Cell-to-CT™ Protocol Overview
Sample Prep
Transcription
Reverse
Pre-Amplification
qPCR

INTERVALO!!!

Inovações em PCR em Tempo Real
1996 2000 2005

Introduzido Lançado Lançado
ABI Prism ABI Prism ABI7300/7500
7700 7900 7500F
1998 2003 2007
Lançado Lançado Lançado
GeneAmp ABI Prism StepOne and
5700 7000 StepOnePlus

Conhecendo o seu instrumento:
Hardware, Manutenção e
Calibrações
7300, 7500 e 7500 fast
Características do 7500 Standard
Pode ser utilizado tanto com placas, strips ou

tubos individuais
Flexibilidade para utilização de outros dyes
Fonte de Excitação: lâmpada halógena

> Vida útil de ~2.000 horas
> Monitoramento pelo software
> Fácil substituição

Características 7500 Fast
Pode ser utilizado somente com placas ou strips, sendo que para uso de strips
é necessária aquisição de uma bandeja específica
Flexibilidade para utilização de outros dyes
Termociclador de alta velocidade (7500 Fast)
Fonte de Excitação: lâmpada halógena

> Vida útil de ~2.000 horas
> Monitoramento pelo software
> Fácil substituição

Sistema de Ciclagem
Instrumento 7500 System 7500 Fast System
Volumes 25-100µL 10-30µL
•Standard Optical 96 -well •Optical Fast 96-well plates

Consumíveis plates •Optical Adhesive Covers
•8-strip 0.2mL tubes •8-strip 0.1 mL tubes
•0.2mL tubes •Optical Flat Caps
•Optical Adhesive Covers
•Optical Flat Caps

Substituição da Lâmpada

Troca da Lâmpada
O equipamento indica o estado da lâmpada,

através da medição da corrente.
Importante!!!

Descrição do Termociclador
Utiliza a tecnologia do Sistema Peltier

Bloco de amostras de 96-well
Volume de reações: 25-100µL (10-30 µL no FAST)
As placas ópticas são seladas com adesivo óptico
Tubos ópticos individuais ou em tiras de 8
Deve-se utilizar as tampas Optical Flat Caps

Sistema Óptico
7500 Real-Time PCR System
halogen light
Excitation
filter wheel
mirror
lens CCD
Emission
excitation emission filter wheel
96 well plate

Sistema Óptico
4 filtros de emissão
7300 Real-Time PCR System
5 filtros de excitação/
emissão
7500/7500Fast Real-Time
PCR System

Sistema de Leitura Multiplex
4 Color Multiplex – detecção de 5 cores:
FAM, VIC, NED, Cy5 e ROX (referência passiva)
Cy5 FAM
VIC
NED

Calibrações
7300, 7500 e 7500 Fast

Calibrações
ROI: Semestral (mapeia as posições dos poços,
determina o tempo de exposição da lâmpada e
verifica contaminação do bloco)
Background: Mensal (quantifica ruído basal do

equipamento)
Óptica (7500/7500Fast): Semestral (normalização

dos filtros de emissão e excitação)
Pure Dyes (Spectral): Semestral (determina a

contribuição do sinal de cada fluoróforo em cada
filtro)

Calibração ROI

Calibração Background
Mede o sinal gerado pela

placa, selo adesivo e
água, que durante a
análise dos resultados,
será subtraído do total de
emissão fluorescente de
cada poço.
Sinal tem que ser menor do que 72000 FSU (filtros A, B, C e D) e 90000 (filtro E)

Background acima do limite
Limpeza do Bloco
Limpar com:
• Água
• Etanol
• Água Sanitária 10%

Calibração Óptica (7500 e 7500 Fast)
• Compensa efeitos físicos do filtro E

• Realizada com a placa ROI

Calibração Pure Dye
Apresenta ao equipamento as
diferentes cores que serão
usadas, para poder distinguir
a contribuição individual de
cada um dos corantes na
fluorescência geral coletada.

Perfis da Calibração Pure Dye



Placa de Verificação/Instalação RNase P
Curva padrão com 20K, 10K, 5K, 2.5K e Amplificação de 36 réplicas com
1.25K cópias em quatro réplicas 10K e 5K

Manutenção do Equipamento
ABI Prism 7300 / 7500 / 7500 Fast
Troca da lâmpada
Limpeza periódica do bloco
Calibrações (ROI, background, óptica e espectral)
Computador:
Não instalar outros aplicativos que não sejam recomendados
pela AB
Não mudar a configuração
Não deixar antivírus automático
Back up de corridas e desfragmentação do disco uma vez por
mês

Conhecendo o seu instrumento:
Hardware, Manutenção e
Calibrações
StepOne/StepOnePlus
StepOne™ Real-Time PCR System
StepOneTM StepOne PlusTM

Bloco com 48 poços • Bloco com 96 poços (usar
(usar placas ou tubos) placas ou tubos)
Sistema de 3 cores • 6 blocos independentes
Velocidades Fast e • Sistema de 4 cores
Standard
• Velocidades Fast e
Volume de reação: 10- Standard
30 µL
• Volume de reação:
Standalone ou co-
located 10-30 µL
• Standalone ou co-located

Sistema Óptico
StepOne/StepOnePlusTM Real-Time PCR System
LED
Fotodiodos
Emission
Filter
96-Well Plate

Calibrações
StepOne e StepOne Plus

Calibrações
Espacial: 18 meses (mapeia as posições

dos poços)
Background: Mensal (quantifica ruído basal

do equipamento)
Dye (Spectral): 18 meses (determina a

contribuição do sinal de cada fluoróforo em
cada filtro)

Limpeza do Bloco
Limpar com:
• Água
• Etanol
• Água sanitária 10%
Antes de iniciar a
calibração
Background,
recomenda-se
descontaminar o
bloco do
termociclador.

Calibração Background
1. Verificar status
(passou/ falhou)
2. Selecionar todos os
poços da placa
3. Verifique o dado
bruto, verificando se
não há poços
contaminados
4. Caso os resultados
sejam aceitáveis,
clicar em Finish
5. Salvar a calibração
Background

Calibração de Dyes
1. Verificar status (passou/ falhou)
2. Para cada dye, (a) selecione os poços
respectivos usando o Ctrl e (b) verifique
se o dado bruto aparece com o mesmo
perfil para todos os poços da mesma
cor, no filtro correto e com intensidade
fluorescente dentro da faixa aceitável
3. Caso os resultados sejam aceitáveis,
clicar em Plate 2
4. Repetir o passo 2b
5. Caso os resultados sejam aceitáveis,
clicar em Finish
6. Salvar a calibração de Dyes

Placa de Verificação/Instalação RNase P
• Precisa ser corrida apenas na

instalação do StepOne
• A placa já vem pronta para correr
(quantificação absoluta)
• Pode ser corrida pelo computador ou
por um Wizard no próprio StepOne
• No final, verificar os resultados e
salvar

Manutenção do StepOne/StepOne Plus
StepOne:
• Descontaminação do bloco
• Calibrações (espacial, background e espectral)
Computador:
• Acesso remoto: trabalhar em rede segura
• Não instalar outros aplicativos que não sejam recomendados pela
AB
• Não mudar a configuração
• Não deixar antivírus automático
• Back up de corridas e desfragmentação do disco no máximo uma
vez por mês

Dye vs Equipamento vs Filtros
Step One Step One Plus 7300 7500 7500 FAST 7900 HT ViiA7
FAM TM #
SYBRTM Green
VICTM #
JOETM
NEDTM #
TAMRATM *
Cy3TM
Texas RedTM
ROXTM
Cy5TM
TETTM #
INTERVALO!!!

Tipos de Quantificação
Quantificação Absoluta:
− Trabalha com unidades palpáveis
− Determina n° de cópias, quantidade em nanogramas, n° de genomas, etc.
− Necessária curva padrão para cada alvo
− Ensaio utilizado para quantificar amostras desconhecidas interpolando

sua quantidade a partir de uma curva padrão

Quantificação Absoluta:
− Exemplo:
> Construção de um gráfico: Log quantidade inicial de amostra x Ct
CT CT
0 1 2 3 4 5 6 7
log n° cópias

Quantificação Relativa:
− Ensaio utilizado para avaliar mudanças na expressão gênica de
grupos experimentais distintos
> Células tumorais vs células normais
> Cultura celular tratada vs cultura celular não tratada
> Diferentes condições de tratamentos
− Resultados expressos em ordem de grandeza
− Análise através dos CT das amostras
− Necessidade de normalização com genes de referência*

* Segundo The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR
Experiments. Bustin et al., 2009

• Quantificação Relativa:
− Exemplo

Quantificação Absoluta x Quantificação Relativa
No Cópias
1000
900 1000
800
700
600
500
400 500
300
200
100
0
Amostra 1 Amostra 2
Valor relativo
2
1.75 2
1.5
1.25
1
0.75 1
0.5
0.25
0
Amostra 1 Amostra 2
Princípios da Quantificação
Absoluta
Quantificação Absoluta
Curva Padrão
CT
CT
0 1 2 3 4 5 6 7
log n° cópias
CT é inversamente proporcional ao log da quantidade inicial de DNA / RNA

Construção da Curva Padrão
Quantidade absoluta do padrão (estoque) deve ser conhecida

inicialmente por algum método independente:
− Aquisição de painéis comerciais (RNA e DNA);
− Oligos sintéticos / produtos de PCR;
− Clonagem de controles para ensaios RNA em vetores de expressão;
− Clonagem de controles para ensaios DNA.

http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/brands/
Product-Brand/acrometrix.html?CID=AcrometrixLife

Acrometrix

Acrometrix

Pontos importantes:
− Qualidade dos padrões é primordial para análise correta dos dados do
experimento. O DNA ou o RNA devem ser puros.
− Qualquer erro ou imprecisão no momento de realizar as diluições afeta

diretamente a qualidade dos resultados.
− A qualidade das pipetas e das ponteiras e o cuidado na quantificação e

mistura das diluições afeta a precisão dos resultados.
− A estabilidade dos padrões deve ser considerada, especialmente para o

RNA. Para isso, é recomendado dividir os padrões em pequenas
alíquotas, armazená-los a –80°C e descongelá-los apenas uma vez, antes
de utilizá-los.

Controle Interno
Mesmo tipo de molécula do gene-alvo (DNA para DNA / RNA

para RNA) e presente (ou adicionado) na mesma quantidade
entre diferentes amostras
Idealmente, utilizado para normalizar os dados com relação à

eficiência de extração, eficiência de RT, quantidade de DNA/RNA
inicial na reação de qPCR - à semelhança do controle endógeno
na quantificação relativa

Cálculos – Quantificação Absoluta
HBV HBV
Amostra Valor de CT No de cópias
29.025 ± 0.047 4.994 ± 150,2
CT
#1
#2 27.059 ± 0.043 9.836 ± 285,4
#3 30.924 ± 0.074 2.484 ± 126,2
#4 29.546 ± 0.049 4.789 ± 76,1
Quantidade (cópias)
Controle Interno
Amostra Valor de CT
#1 21.209 ± 0.024
#2 21.216 ± 0.027
#3 21.247 ± 0.047
#4 21.141 ± 0.023

Quantificação de OGMs
5’ 3’
Promotor Transgene Terminador
FAM Quencher
Gene Alvo: Promotor do
vírus do mosaico da
couve-flor (35S)
VIC Quencher Controle Interno Positivo (CIP):

Lectina para soja, Invertase para
milho
TaqMan® GMO Soy 35S Detection Kit
TaqMan® GMO Maize 35S Detection Kit

Análise de OGMs
Curvas azuis = 35S

Curvas verdes = Lectina
0.5%
0.1%
0.01%
1%
2%
Ct Lectina = 22 5%
STD5% = Ct 24.5 ; ∆Ct = 24.5-22 = 2.5
STD2% = Ct 26 ; ∆Ct = 26-22 = 4
STD1% = Ct 27 ; ∆Ct = 27-22 = 5
STD0.5% = Ct 28 ; ∆Ct = 28-22 = 6
STD0.1% = Ct 31 ; ∆Ct = 31-22 = 9

Análise de OGMs: Curva Padrão de ∆CT
Análise de regressão linear logarítmica

dos ∆Ct’s dos padrões de referência (0%,
0.1%, 0.5%, 1%, 2% e 5%). O ∆Ct de
cada amostra é então inferido a partir
desta curva para determinar a %OGM.
∆ Ct
LOG % OGM

TaqMan® Exogenous Internal Positive Control
Reagents


Construção da curva padrão - DNA
Amplificar o segmento de DNA alvo do teste, utilizando

preferencialmente primers externos, por meio de PCR
convencional.
Clonar o produto da PCR acima por meio de ligação a vetor

do tipo plasmídeo e replicação em bactérias competentes.
− Obtenção de um alto n° de cópias do fragmento
− Replicação fiel com a maquinaria bacteriana
− Quantificação mais precisa (inserto+vetor)

L 1 2 3 4 5 6
L 100 bp ladder;1-3 internal primers; 4-6

external primers;1,2,4,5 HBV +; 3,6 HBV -

amplicon


Selecionar cerca de 5 a 10 colônias que apresentem o

plasmídeo recombinante e isolar o DNA por meio de miniprep.
Confirmar a presença do inserto (segmento alvo) nas colônias

selecionadas por meio de PCR e/ou seqüenciamento.
Posteriormente, submeter a sequência a ferramenta de BLAST.




Query= HBV1-F (93 letters)
Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS,

GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences) 2,627,594
sequences; 11,919,774,978 total letters
Score E
Sequences producing significant alignments: (bits)Value
gi|38374303|gb|AY236163.1| Hepatitis B virus isolate 29, co... 125 2e-26
gi|38374299|gb|AY236162.1| Hepatitis B virus isolate 23 A, ... 125 2e-26
gi|38374294|gb|AY236161.1| Hepatitis B virus isolate 12A, c... 125 2e-26
gi|38374285|gb|AY230128.1| Hepatitis B virus isolate case 2... 125 2e-26
gi|51090241|dbj|AB116654.1| Hepatitis B virus DNA, complete... 125 2e-26
gi|51036197|dbj|AB116552.1| Hepatitis B virus S gene for HB... 125 2e-26
>gi|51036197|dbj|AB116552.1| Hepatitis B virus S gene for HBsAg,

complete cds, clone:VENEZ4 Length = 3215 Score = 125 bits (63), Expect =
2e-26 Identities = 63/63 (100%) Strand = Plus / Plus
Query: 18 gctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatcaaggtatgttgcccgtttg
77 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct:415 gctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatcaaggtatgttgcccgtttg
474
Query: 78 tcc 80
|||
Sbjct: 475 tcc 477
Tratar o clone contendo o inserto de interesse com RNase I
(Ambion P/N AM2294).
Linearizar o clone contendo o inserto de interesse por meio
de digestão com enzima de restrição com sítio único na região
“polylinker” do plasmídeo. Certifique-se de que o produto de
PCR que foi clonado não possui sítio de restrição para a
enzima selecionada.

Purificar o produto da reação e verificar a presença de uma

única banda do tamanho esperado (plasmídeo + inserto) por
eletroforese em gel de agarose.

Quantificar de forma precisa o clone linearizado e

purificado.
Determinação do número de cópias:
X g/uL DNA x 6,022 x 1023

Tamanho do clone em pb x 649
Observações:
clone = plasmídeo + inserto

649 g/mol = PM médio de 1 pb DNA
6,022x1023 = no de moléculas em 1 mol (no de Avogadro)

Exemplo:
Tamanho do clone: 3954 + 400 = 4354 pb

Concentração: 50 ng/uL = 50 x10-9g/uL
Cálculo:
50 x 10-9
x 6,022 x 1023 = 1 x 1010 moléculas/uL
(4354 x 649)

Exemplo: Concentração estoque do clone = 1 x 1010 cópias/ uL
Ci x Vi = Cf X Vf
Cf = 108 cópias/ uL
Vf = 1000 uL
Ci = 1 x 1010 cópias/ uL
108 x 1000
Vi = = 10 uL estoque + 990 ul diluente
1 x 1010

Diluente = Yeast tRNA 100 ng/uL, Ambion P/N AM7119
Exemplo:
900 uL de
yeast tRNA
100 ng/uL
+ 108 107 106 105 104 103 102 101
100 uL da
diluição
anterior

Construção da curva padrão - RNA
Amplificar o segmento alvo do teste por meio de transcrição

reversa + PCR convencional (protocolo “one” ou “two-step”),
utilizando preferencialmente primers externos.
Clonar o produto da PCR acima por meio de ligação a um

plasmídeo contendo promotor T7, SP6 ou T3 e replicação em
bactérias competentes.

Exemplo de vetor de expressão
TOPO TA Dual Promoter

Selecionar cerca de 5 a 10 colônias que apresentem o

plasmídeo recombinante e isolar o DNA por meio de
miniprep.
Identificar, por meio de sequenciamento, as colônias que

apresentam o inserto (segmento alvo) na orientação correta
para transcrição.

VETOR HCV
...CCAGAATTCGTGATT CACTCCCCTGTGAGG...

Linearizar o clone contendo o inserto de interesse por meio de

digestão com enzima de restrição com sítio único na região
“polylinker” do plasmídeo correspondente à extremidade 3’ do
transcrito esperado. Certifique-se de que o produto de PCR que
foi clonado não possui sítio de restrição para a enzima
selecionada.
Purificar o produto da reação e verificar a presença de uma única

banda do tamanho esperado (plasmídeo + inserto) por
eletroforese em gel de agarose.

Transcrever com a RNA polimerase apropriada.
Tratar o produto da transcrição com DNase antes de
prosseguir para a próxima etapa.
Purificar o transcrito (MEGAclear™ Kit, Ambion P/N
AM1908). Concentrar o transcrito utilizando acetato de
amônia (incluso no kit).
Quantificar de forma precisa o transcrito acima.

Transcrever com a RNA polimerase apropriada.

(Ambion: “MEGAscript® High Yield Transcription Kit” P/N AM1330, AM1333 e
AM1338 para as RNAs polymerases SP6, T7 e T3; “MEGAshortscript T7 Kit” - P/N
AM1354 - transcritos até 500 bases)

Determinação do número de cópias:
X g/uL RNA x 6,022 x 1023

Tamanho do transcrito x 320
Observações:
tamanho do transcrito: no bases entre sítio de início da transcrição

no promotor e sítio de corte da enzima de restrição utilizada
320 g/mol = PM médio de 1 base de ssRNA
6,022x1023 = no de moléculas em 1 mol (no de Avogadro)

Fator de conversão dos resultados
• Resultado em 1 mL de plasma → 2,5 x 20 x 2 x 105 cópias
• Etapas: x 2,5
− Extração: 400 uL de plasma → 20 x 2 x 105 cópias
− Eluição: 100 uL de tampão

→ 20 x 2 x 105 cópias
− Reação qPCR: 5 uL de eluato x 20

→ 2 x 105 cópias
Fator de conversão = 50 x
Construção da curva padrão
Metodologia alternativa
• Misturar o plasmídeo (na quantidade certa para cada ponto da curva)
ao plasma negativo para o alvo do teste e depois fazer a extração
Vantagem: curva mais representativa do ensaio (os pontos

da curva passam pelas mesmas etapas que as amostras em
teste); resultados mais exatos.
Desvantagens:
• estabilidade da curva
• eficiência e R2 passam a representar o teste
como um todo (extração e qPCR) e podem ser menores

INTERVALO!!!

Princípios da Quantificação
Relativa
Exemplo de um experimento
Platypus não tratado Platypus tratado
Gene de interesse: Plat1
Grande questão: Como é a expressão de Plat1

quando eu tratar meus platypus?





Duas maneiras de fazer uma quantificação relativa
Ct Comparativo Curva Padrão

Método (∆∆Ct) Relativa
Amostra-para-
Amostra- para-amostra
fold changes

Métodos para Cálculo da Quantificação Relativa
Ct Comparativo (∆∆Ct) – Preparo mais simples pois não

requer curva padrão. É necessária a validação das
eficiências dos ensaios do gene alvo e endógeno, que
devem ser semelhantes.
Curva Padrão Relativa – Não requer validação da

eficiência, nem que a eficiência dos ensaios do alvo e do
endógeno sejam semelhantes. Requer construção de
curva padrão, portanto uso de mais reagentes e espaço
na placa.

Método do DDCt
DDCt
Um requerimento fundamental para o dd

ddCt
Ct
Os dois genes (alvo e referência) deven

praticamente apresentar a mesma eificência
de amplificação!

Curva Padrão
Curva Padrão
Curva padrão em número de

cópias
CT
0 1 2 3 4 5 6 7
log n° cópias

Eficiência de PCR
100% eficiência: diluição 1:10, 3.32 ciclos entre cada diluição
threshold
15,00 18,32 21,64

ciclo
Eficiência de PCR
50% de eficiência: diluição 1:10, 5.68 ciclos entre cada diluição
30.00 35.68
ciclo
Eficiência de PCR
127% de eficiência: diluição 1:10, 2.27 ciclos entre cada diluição
13.00 15.27 17.54

ciclo
Passos para fazer o ddCt
ddCt
Eficiências são, por vezes, confirmada pela

execução dos ensaios lado a lado e
confirmando que eles têm curvas de
amplificação em paralelo.

Check se as linhas estão paralelas e em fase geométrica
Gene de referência
Alvo

Realizar curvas de diluições seriadas e comparar os
valores de slopes
Slope = -3.38
Ct
Slope = -3.32 Alvo
Referência
[cDNA]

Curvas padrão nos fornecem uma idéia da eficiência
de uma PCR
Por exemplo, um valor de slope igual a -3.3 sugere que os
primers estão amplificando com aproximadamente 100% de
eficiência.
Um valor mais negativo (ex: -3.5) sugere uma reação com uma
eficiência menor que 100%.
Cálculo: E = 10(-1/slope) -1

Voltar para a Validação
Validação.. . .
A-F = ∆Ct1
A
F B Subtrair os pontos
correspondentes
G C
Ct
H D
I
Alvo
E
J Referência
[Molde]
Subtrair os pontos correspondentes
A-F = ∆Ct1
A
B-G = ∆Ct2
C-H = ∆Ct3
F B
D-I = ∆Ct4
C
E-J = ∆Ct5
G
Ct
H D
I Alvo
E
Referência
J
[Molde]

Gráfico das diferenças no Excel
A-F = ∆Ct1 ∆Ct

B-G = ∆Ct2
C-H = ∆Ct3 ∆Ct1 ∆Ct2 ∆Ct3 ∆Ct4 ∆Ct5
D-I = ∆Ct4
E-J = ∆Ct5
1 2 3 4 5
Pontos de diluição

Após a validação
validação,, escolher o método de quantificação
Método do Ct
Slope ≤ 0.1 comparativo (∆∆Ct)
Curva Padrão
Slope ≥ 0.1 Relativa

Gene de referência
Utilizado para corrigir variações relacionadas à:
− Quantidade de tecido utilizado na extração (número de células
total)
− Eficiência de extração de RNA (por exemplo, em tecidos
diferentes)
− Eficiência da transcrição reversa (RT) e da amplificação (PCR)
− Quantificação de RNA/ cDNA inicial
− Pipetagem de RNA/ cDNA nas reações
− Degradação de RNA/ cDNA

Gene de referência
Qual é o gene de referência ideal?
Expressão no Tratado
= ~1
Expressão no Controle
Aquele cuja expressão gênica não tenha grandes
variações entre os tecidos analisados!

Calibrador
• Amostra utilizada como base para resultados comparativos
Calibrador
tempo
t =0 t=12 t=24 t=48
Conversão do RNA total para cDNA

Controle da
variabilidade
das amostras
[ALVO] [ALVO] [ALVO] [ALVO]
[REF] [REF] [REF] [REF]

Resultados da Quantificação Relativa
50
t=0
40
37.01
x-fold Expression
t = 12 h
30 t = 24 h
20 t = 48 h
5.6
10
1 -7.8
0
Calibrador
t=0

Gene de referência
Resultados cMYC Resultados GAPDH
25
25
Valores de Ct
c-myc mRNA
GAPDH mRNA
20
Valores de Ct
20
15 15
10 10
5 5
0
0
Cérebro Rim Fígado Pulmão
Normalização com GAPDH

QuantidadeRelativa
7
de c-myc mRNA
0

Método do CT Comparativo (∆∆Ct)
∆∆Ct
∆∆
c-myc GAPDH Tecido ∆Ct ∆∆Ct
∆∆ 2-∆∆
Ct ± desvio Ct ± desvio c-myc - GAPDH ∆Ct-∆Ct Rel. ao cérebro
Cérebro 30.49 ± 0.15 23.63 ± 0.09 6.86 ± 0.17 0.00 ± 0.17 1.0 ± 0.11
Rim 27.03 ± 0.06 22.66 ± 0.08 4.37 ± 0.10 -2.50 ±0.10 5.6 ± 0.32
Figado 26.25± 0.07 24.60± 0.07 1.65 ± 0.10 -5.21 ± 0.10 37.0 ± 2.52
Pulmão 25.83 ± 0.07 23.01± 0.07 2.81 ± 0.10 -4.05 ± 0.10 16.5 ± 1.10
∆CT = CT (alvo
alvo)) - CT (gene de referência
referência))
∆∆CT = ∆CT (amostra) - ∆CT (calibrador)
Quantidade Relativa = 2 -∆∆Ct

Validação do Método do CT Comparativo (∆∆Ct)
• Escolher alvo e o gene (s) de referência

• Diluições seriadas de concentrações conhecidas do alvo e
do(s) gene(s) de referência
• Real time PCR
• Calcular a média dos CTs das réplicas e o ∆Ct para o alvo e o
(s) genes de refefência
• Plotar em um gráfico o log da quantidade vs ∆Ct
• O valor do coeficiente angular (slope) deve ser ≤ 0.1

Variações na Eficiência de Amplificação
Gene - CE Eficiência* Cálculo

* Tolerância de +- 10%
Gene = CE 100 % 2-∆∆Ct
Gene = CE <100% (1+ E)-∆∆Ct
Gene ≠ CE NA
Curva Padrão
Relativa

∆∆Ct)
∆∆
Método do CT comparativo (∆∆
− Vantagem:
> Não há necessidade de utilizar curva padrão em toda placa.
> Redução na quantidade de reagentes.
− Considerações:
> Necessita ser validado.
> Eficiência de amplificação do alvo (gene de interesse) e da
referência interna (controle endógeno) deve ser igual (dp = ±10%).
> Taqman Gene Expression Assays possuem eficiência de 100%
> Ideal para um grande número de alvos e/ou amostras ou para
validação de resultados de microarray.

Cálculos para o Método da
Curva Padrão Relativa

Usado quando a validação das eficiências dos
genes alvo e referência falharam
-4.21
Alvo
Ct -3.34
Referência
Qty (Log)

Método da Curva Padrão
- Qualquer estoque de cDNA, RNA ou DNA
contendo o alvo apropriado, pode ser
utilizado para preparar a curva padrão
- Apenas as diluições relativas necessitam

ser conhecidas
c-myc
- Ex: diluição de 10x → 200, 20, 2, 0.2, 0.02
0.02
Amostras Desconhecidas
0.2
c-myc
2
20
GAPDH Amostras Desconhecidas
200
GAPDH

Método da Curva Padrão Relativa
c-myc GAPDH c-mycN c-mycN

Tecido Valor Arbitrário Valor Arbitrário Norm. c/ GAPDH Rel. ao cérebro
Cérebro 0.039 ± 0.004 0.54 ± 0.034 0.07 ± 0.008 1.0 ± 0.12
Rim 0.41 ± 0.016 1.02 ± 0.052 0.40 ± 0.025 5.5 ± 0.35
Fígado 0.70 ± 0.036 0.28 ± 0.013 2.49 ± 0.173 34.2 ± 2.37
Pulmão 0.93 ± 0.044 0.81 ± 0.041 1.15 ± 0.079 15.7 ± 1.09
c-myc
GAPDH c-mycN
c-myc calibrador

− Vantagem:
> Requer menor quantidade de validação pois a eficiência do alvo e do
controle endógeno não necessita ser equivalente.
− Considerações:
> Toda placa necessita de uma curva padrão, portanto, mais espaço na
placa e maior consumo de reagentes.
> Resultados mais precisos, pois os valores das amostras desconhecidas
são interpolados na curva padrão.
> Ideal para um pequeno número de alvos e amostras ou para análise de
mudanças discretas na expressão gênica.

Curva Padrão vs. Ct Comparativo
√ ... Pode ser utilizada entre ensaios com diferentes eficiências de
amplificação
√ ... Considera as diferenças de amplificação de um mesmo ensaio em
diferentes placas
X ... Utiliza grande espaço na placa
Método do Ct Comparativo
√ ... Elimina a necessidade de utilização de uma curva padrão - mais
espaço na placa
X ... Não considera as diferenças de amplificação de um mesmo ensaio em
diferentes placas

Seleção de genes de referência

Genes de referência ideais
Não apresentar similaridade (pseudogene, por exemplo) com outro
gene do mesmo organismo
Expressão homogênea entre diferentes amostras
Expressão não alterada pelas diferentes condições experimentais
em estudo (tratamento com drogas, comparação entre 2 tecidos)
Expresso na mesma faixa que o(s) gene(s) alvo do estudo
Ideal utilizar mais que um gene de referência
Genes que codificam enzimas e componentes do citoesqueleto

podem ser boas escolhas (ex: beta-actina)


Gene de Referência
Gene de referência, gene normalizador ou ”housekeeping gene”
Expresso em TODOS os tecidos de interesse e com MÍNIMA variabilidade de
expressão relativa entre as amostras e condições experimentais
Necesária validação em todo experimento!
Não existe gene de referência universal!
Normalização com um único gene de referência é possível APENAS se for
confirmado sua expressão não alterada nas condições descritas.


Opções:
FAM ou VIC
MGB ou TAMRA
Primer Limited (Multiplex) ou
Non- Primer Limited

Genes de Referência
Expressão constitutiva (GAPDH, ACTB, 18S);
Corrigir variações de eficiência da transcrição reversa;
Corrigir a presença de inibidores;
Corrigir diferenças na quantificação de RNA;
Corrigir degradação de material (RNA);
Normalização dos resultados

Seleção do gene de referência
Softwares para análise
> GeNorm, Vandesompele et al., 2002
> REST, Pfaffl et al., 2002
> Normfinder, Pfaffl et al., 2004
> BestKeeper, Andersen et al., 2004
> qBase, Jan Hellemans & Jo Vandesompele 2006
> StatMiner, Integromics 2007
> DataAssist v3.0 (Life Technologies 2010)

DataAssist® Software

Compatibilidade entre equipamentos e as versões do SDS

a – Criar novo estudo

b – Editar estudo
c – Deletar estudo
d – Exportar resultado das análises
e – Guia (Tutorial)
f – Seleção de estudos


Informação sobre o grupo biológico

Data Assist™ faz as contas para você!
312
| Life Technologies Proprietary & Confidential | 1/24/2012
QC Plots
Scatter Plot – ∆Ct Correlation Signal Correlation Plot
RQ Plot – RQ vs Sample (or Target) Volcano Plot – P-value vs Fold Change
313 Plots de Resultados 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

Opções de Ensaios TaqMan® e
Desenho de Primers

TaqMan® Gene Expression /
SNPs / MicroRNA Assays:
~ 5.000.000 conjuntos de sonda TaqMan® e primers
Entregues em formato tubo único, pronto para uso
Utiliza condições de ciclagem universal

− Mesmo protocolo da PCR para todos os ensaios
Elimina necessidade de desenho dos primers e

padronização da PCR

• Usuário escolhe o ensaio pronto no web site:
http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/products/taqman-guarantee.html
• Expressão Gênica
• Análise de microRNA
• Quantificação de Pri-miRNA
• RNA Não codificadores
• Genotipagens de SNPs
• Copy Number Variation
• Genotipagem (Drug Metabolism)
• Expressão de proteínas

TaqMan® Gene Expression Assays
Mais que apenas primers e sonda
Prontos para utilização
SNPs/repetições mascaradas
Especificidade (white paper)
Eficiência (Application Note)
Três eventos de hibridização
Condições universais de termociclagem
Código de barras (opcional)
Anotações detalhadas
Visualização com o GeneAssist™

Assays individuais
TaqMan Array

TaqMan® Array
Mesmos ensaios, diferentes formatos
ABI7900HT
ViiA7
QuantStudio

TaqMan® Array
7900HT, ViiA7 e QuantStudio
Versatilidade e Flexibilidade com blocos removíveis
Bloco 384-well Bloco 96-well
Bloco TaqMan Array

TaqMan® Array

pre-loaded in micro fluidic wells
1-8 amostras
12-380 alvos
1µL de volume de reação

Tubo (s) Arrays
?
• Flexível • Fácil utilização
• Qualquer instrumento • Projetos (média/larga
escalas)
• Apenas no 7900HT

Tubo (s) Express Plates Arrays
A mesma confiança, os mesmos resultados, apenas

escolha o melhor formato para seu projeto

GeneAssist Pathway Atlas

GeneAssist Pathway
http://www4.appliedbiosystems.com/tools/pathway/all_pathway_l
ist.php

GeneAssist Pathway
Ferramenta interativa online
Over 380 pathway maps, including:

Biological Processes Signal transduction Metabolic Disease State
• Apoptosis • MAPK Signaling Pathway • Anti-oxidant action of • Alzheimer’s Pathway
• Cell cycle management • Hedgehog Vitamin C
• Transcriptional Regulatory • Wnt Signaling Pathway

GeneAssist Pathway

GeneAssist Pathway
Informações detalhadas dos genes envolvidos

GeneAssist Pathway
Referências

GeneAssist Pathway
GeneAssist Export Tool

MicroArray: UMapIt Cross-mapping Tool

UMapIt: Map Array Probes to TaqMan Assays

Workflow UMapIt
Weeks or months
Microarray Search Assay

hits public DB design and
Real-time
optimization
PCR

Workflow UMapIt
Days or weeks
Microarray hits UMapIt TaqMan®

Assays, Arrays,
or Custom Real-time PCR
Plating Service

Copy Number Variation (CNV)
Copy Number Variation (CNV)
• Redon e cols. definiram “Copy Number

Variation” (CNV) como sendo deleção ou
duplicação envolvendo >1 kb de DNA
− Polimorfismos
– ~20.000 CNVs identificadas
– Correspondendo a >6.000
regiões/locus únicos no genoma
humano
− Associação com doenças ou desordens
genômicas como câncer, doenças imunes e
desordens neurológicas
• Associação fenotípica
− CYP2D6: associação com metabolismo de
drogas
− CCL3L1: suscetibilidade - HIV/AIDS
Fonte: “Global variation in copy number in the

human genome.” Richard Redon, et. al.
Nature 444, 444-454 (23 November 2006)

Database of Genomic Variants
DGV/Toronto/Sick Kids database
Inclui descobertas relacionadas

às CNVs a partir de experimentos:
● Array Comparative Genomic
Hybridization (aCGH)
● CGH BAC arrays (custom)
● SNP & CNV arrays (Affymetrix,
Agilent, Illumina)
● Oligo tiling arrays (Nimblegen)

Por que ensaios TaqMan® Copy Number?
Capaz de identificar quantitativamente as alterações distintas no

número de cópias com alta especificidade e reprodutibilidade
Ferramenta de validação para descoberta de CNVs a partir de

técnicas como Microarray, FISH, Array CGH e outras tecnologias
Workflow simplificado
− Em média, a configuração inicial para análise leva em torno de 3-4 horas
(incluindo aproximadamente 2 horas para amplificação - PCR)

Determinação do número de cópias de DNA
Exemplo
Control Test
Reference assay Sample (♀) Sample (♂)
(VIC,
RNase P) Ct (VIC) Ct (VIC)
Chr 14 = 27.5 = 27.0
Test assay Ct (FAM) Ct (FAM)

(FAM, YIPF6) = 27.0 = 28.5
Chr X ∆Ct = 0.5 ∆Ct = 1.5

3
∆∆Ct = 1
Copy Number
0 Copy number
2-∆∆Ct × 2 = 1
2.5 - NA10859
2.5 - NA14474
2.5 - NA14476
2.5 - NA17102
2.5 - NA17103
2.5 - NA17104
2.5 - NA17105
2.5 - NA17106
2.5 - NA17107
2.5 - NA17108
2.5 - NA17109
2.5 - NA17110
2.5 - NA17111
2.5 - NA17112
2.5 - NA17113
2.5 - NA17114
2.5 - NA17115
2.5 - NA17116
2.5 - NA17117
2.5 - NA17118
2.5 - NA17121
2.5 - NA17122
2.5 - NA17123
XX XY

Workflow TaqMan® Copy Number Assays
FAM™-labeled 1
TEST ASSAY
VIC®-labeled
2
CONTROL ASSAY
Standard TaqMan protocol
(i.e.: RNase P)
gDNA 3 PCR
1 ng / µL PCR rxn
TaqMan 4
Master Mix 4 replicatas
por amostra de gDNA

Sistemas de análise Copy Number Variation
Applied Biosystems 7900HT Fast Applied Biosystems 7500

Real-Time PCR System Fast/7500 Real-Time PCR
System
Applied Biosystems 7300 QuantStudio

Real-Time PCR System Applied Biosystems StepOne
and StepOnePlus Systems
ViiA7
Obs: StepOne™ System não deve ser
usado pelo fato da perda do filtro
TAMRA™ - sondas genes controles

Analisando o número de cópias
Os dados obtidos por qPCR

são exportados e analisados
no software CopyCallerTM.

Análise pelo Software CopyCaller™
• Software gratuito para a análise dos dados de TaqMan Copy Number Assays
• Fácil utilização da interface gráfica, com resultados em poucos segundos
• Algoritmos para a identificação do n°° de cópias de amostras utilizando valores de confiança

TaqMan Copy Number Assays
Acurácia para determinação de 0 a 5 cópias de gDNA
4 6
Chr 21: C210RF91 5
Chr X: YIPF6
Copy number
3
4
2 3
2
1
1
0 0
XXXXY
XXXXX
XY
XY
XY
XX
Monosomy
XX
XXXX
XY XX XX XX XX XY XY XX XX XY
XXX
21
Trisomy 21 Normal
Normal
4 5
Chr 22: PIWIL3 Chr Y: EIF1AY
4
Copy number
3
2
2
1
1
0 0
XY
XYYYY
XY
XY
XYYYY
XYYYY
XX
XX
Trisomy
XY XY XX XX XY
XXYY
22
XYY
XYY
Normal individuals Normal

Seleção de ensaios

INTERVALO!!!

High Resolution Melting (HRM)
O que é HRM?
High Resolution Melting (HRM) consiste em um método de análise (pós-PCR
que utiliza uma curva de dissociação de alta resolução, o qual permite
identificar variações em sequencias de ácidos nucléicos.
Difere da curva de dissociação do corante SYBR® Green:

− Química: corantes de DNA dupla-fita que saturam a molécula que possuem
maior brilho
− Instrumento: coleta de mais pontos de dados que uma curva de dissociação
padrão
− Software: novos gráficos e algorítmos de normalização da fluorescência

Novos corantes para HRM vs SYBR® Green
Novos corantes:
SYBR® Green Dye Bound to dsDNA dsDNA Saturated with MeltDoctor® dye
• MeltDoctor®
• SYTO®9
Saturação completa da
molécula de dsDNA
SYBR® gree MeltDoctor® dye
Visualização dos dados

utilizando uma curva
padrão de dissociação:
dissociação:
• Melhor separação dos
alelos (Tms)
• Fácil identificação de
heterozigotos
Curva de Dissociação HRM

Aplicações do HRM
HRM pode ser utilizado para identificar precisamente mutações que alterem
a Tm em menos que 0.1°°C
Se você possue interesse em qualquer aplicação com curva de dissociação,

você pode estar interessado no software HRM:
− Genotipagem
− Pesquisa de mutações
− % de metilação
− Identificação de linhagem viral
− Triagem de amostras poligênicas
− Triagem de genes em organismos não-modelo
… e número de aplicações está aumentando!!!!!!

High Resolution Melting
Exemplos de Aplicações

Aplicações do HRM- Pesquisa de Mutações
Objetivos:
− Detectar variações desconhecidas em sequências específicas de
DNA genômico com suspeita de associação com uma doença
− Utilizada como ferramenta de pré-sequenciamento

Aplicações do HRM- Genotipagem de SNPs
Em um experimento de genotipagem, o heterozigoto difere no formato da curva

comparado com o homozigoto dominante e o homozigoto recessivo. Os
homozigotos são diferenciados baseados na diferença de Tm.

Aplicações do HRM- Pesquisa de Mutações
Notar a dispersão dentro das curvas

que representam a população wild-type
Sequências variantes são facilmente

identificadas

Aplicações do HRM - Pesquisa de Mutações
99bp amplicon [A/G]

dbSNP ID: rs1041983
A allele G allele heterozygous

Aplicações do HRM – Detecção de Patógenos
HRM é um método rápido e preciso para pesquisa de cepas microbianas conhecidas ou
não.
Comparado com a técnica de PCR-RFLP, HRM permite identificar cepas microbianas de
forma rápida e com excelente custo benefício.
HRM screening:
− Permite detectar baixas concentrações de cepas microbianas;
− Minimização de perdas de detecção de novas cepas microbianas semelhantes a
sequencias sondas específicas;
− Minimiza interpretações subjetivas quando comparados com métodos tradicionais;
− Produto proveniente das reações de HRM podem ser diretamente sequenciadas, sem
necessidade de prévia realização de reações de purificação.

Aplicações do HRM- Metilação do DNA
Objetivos:
− Detectar a presença ou a porcentagem de DNA metilado
− Possibilidade de utilização para diagnóstico
Métodos:
− Após o tratamento com bisulfito, as amostras de DNA metiladas e
as não-metiladas terão um diferente padrão de dissociação
− “If compared to methylated and unmethylated reference samples,

estimates of extent of methylation may be determined”
(Wojdacz et.al. NAR, 2007)

Aplicações do HRM - Metilação do DNA
Amostra 100% Me: Conversão por Bisulfito (CG) -> Amplificação por PCR -> Análise por HRM
Amostra 0% Me: Conversão por Bisulfito (TG) -> Amplificação por PCR -> Análise por HRM
100%
Metilado
CC C C
50%
Metilado
0%
Metilado
TT T T
74°°C 80.0°°C
Aplicações do HRM – Metilação do DNA
100%
75%
50%
25%
10%
5%
1%
0%

Aplicações do HRM – Metilação do DNA
100%
75%
50%
25%
0%
teste

HRM nos Sistemas de PCR em Tempo Real 7500 Fast,
StepOne, StepOnePlus, 7900 HT, ViiA7 e QuantStudio
O software HRM é utilizado para análises e

funciona separadamente do equipamento
O software HRM é compatível com as corridas

da curva de dissociação dos sistemas de PCR
em Tempo Real 7500 Fast, StepOne,
StepOnePlus, 7900 HT, ViiA7 e QuantStudio
Os sistemas de PCR em Tempo Real 7500 Fast,

StepOne, StepOnePlus, 7900 HT e ViiA7 são
capazes de ler corantes específicos para o HRM
StepOne & e coletar dados suficientes para gerar curvas de
StepOnePlus
“high resolution”.
QuantStudio
ViiA7 ABI7500 fast
ABI7900HT
Guia da Aplicação
http://www.lifetechnologies.com

Software HRM V3.0.1 para StepOne,
StepOnePlus e 7500 Fast
https://licensing.appliedbiosystems.com/downlo
ad/hrm/v3.0.1

Genotipagem e Expressão
Gênica - OpenArray® Real Time
System
Throughput
100000
10000
# Ensaios
1000
TaqMan®
100 OpenArray®
10
Ensaios
individuais
10 100 1000 10000 100000
# Amostras
Plataforma OpenArray / QuantStudio

Anatomia do Slide OpenArray
Subarray

OpenArray® Workflow Overview
1 A 1 Assay A TGGAGCATCCCTGCACAAGT Desalt
1 B 1 Assay B GCACTCAACGGAGCCTTCCT Desalt
1 C 1 Assay C ACCCGAGAGAAAGCGTCTGG Desalt
1 D 1 Assay D GATGGAGCGCAGCATAACCA Desalt
1 E 1 Assay E TGGGTGTGGCATCTCACAAA Desalt
1 F 1 Assay F AGCTCGATGGTGGTCATGGA Desalt
1 G 1 Assay G TCCTCTTCCACCCCATCCTC Desalt
1 H 1 Assay H CCAGACTGTGGAGGGGGTCT Desalt
1 A 2 Assay I CTGCCGAAATTGCTGTGGAC Desalt
1 B 2 Assay J CCAAAACAACACCCCCATCA Desalt
1 C 2 Assay M ATGATTGGGCAGGGAGCCTA Desalt
1 D 2 Assay N TTCCCAGCTGTCCTGCAGTC Desalt
1 E 2 Assay O GCCTTGGGACCCTGCAATAA Desalt
1 F 2 Assay P TTCCTGCCACACAGGGAATG Desalt
1 G 2 Assay Q CCTCCAGACCAGGGCATAGG Desalt
1 H 2 Assay R CCAGCCTCCAGGGAAGAGAC Desalt
1 A 3 Assay S GCGACTCTGCTGCTCTCCAC Desalt
1 B 3 Assay T GGCAGGGTCCTGAAGCAGAT Desalt
LifeTechnologies recebe as Sintetiza e deposita cada LifeTech envia um kit com os ensaios
sequencias dos iniciadores ou ensaio no slide previamente para o seu laboratório
ensaios desejados configurado
No Lab
Prepare MM, add you cDNAs Load your samples with Master Cycle and image up to 3 (OpenArray)
Mix onto the OpenArray® plate or 4 (QuantStudio) OpenArray®
plates
Results!

OpenArray® para Genotipagem
• 3072 ensaios em paralelo
O mesmo que oito placas de 384 poços Hidrofóbico
• Configurações flexíveis para Ensaios e 33 nL Hidrofílico

Amostras
64x48, 128x24, 192x16, 256x12
• Química para PCR confiável e sensível
• A mesma reação em menor volume

Layouts do OpenArray® para GT
16 ensaios x
144 amostras
3 amostras/subarray
32 ensaios x
96 amostras
2 amostras/subarray
64 ensaios x
48 amostras

Layouts do OpenArray® para GT
128 ensaios x
24 amostras
192 ensaios x
16 amostras
256 ensaios x
12 amostras

Ciclagem “Off-Side” para Genotipagem (4 horas)
• 8 Slides do OpenArrays por ciclo de corrida

Capacidade: Quantos Slides? Quanto tempo?
3 Slides podem ser lidos

simultaneamente no OpenArray
4 Slides podem ser lidos
simultaneamente no
QuantStudio
A captura de imagem leva
aproximadamente 15 minutos

Genotipagem no QuantStudio 12K Flex OA Block
9:00 11:00 13:00 15:00 17:00
0:20 4:00
Load Run + Read (4 x 3,072)
Load Run + Read (4 x 3,072)
Load Run Overnight (4 x 3,072)

= 36,864 rxns (QuantStudio 12K Flex)
12 OpenArray® plates
(Opcional) Alcança mais pontos de dados com 9700 FlatBlock Cycler
0:40 4:00 0:10

Load Run (8 x 3,072) Read
Load Run (8 x 3,072) Read
Load Run (8 x 3,072)

= 110,592 rxns (QuantStudio 12K Flex + 9700 Flatblock)
36 total OpenArray Plates
Resultados

OpenArray® para Expressão Gênica
• 2688 ensaios em paralelo
Hidrofóbico
• O mesmo que sete placas de 384 poços
33 nL Hidrofílico
• Configurações flexíveis para Ensaios e
Amostras
56x48, 112x24, 168x16, 224x12
• Química para PCR confiável e sensível
• A mesma reação em menor volume

Formatos disponíveis
18x3 ensaios
48 amostras
56 ensaios
48 amostras
112 ensaios
24 amostras
168 ensaios
16 amostras
224 ensaios
12 amostras

Ensaios para Gex
18 ensaios
por subarray
Brancos (sem ensaios)
Posição final Posição inicial
379
| Life Technologies Proprietary & Confidential | 1/24/2012
Capacidade: Quantos Slides? Quanto tempo?
Ciclagem “In-Side” para

Expressão Gênica
Até 3 Slides do OpenArray®

podem ser ciclados juntos
Até 4 Slides do OpenArray®
podem ser ciclados juntos no
QuantStudio
Cada ciclo de corrida para
TaqMan® dura
aproximadamente 2h e 20 min

Expressão Genica/miRNA no QuantStudio 12K Flex
OpenArray® Block
9:00 11:00 13:00 15:00 17:00
0:20 2:00

Corre até 4 arrays por vez!
16 arrays/ dia
>43,000 reações, 1 operador

OpenArray® Real-Time qPCR
Software

OpenArray® Data Analysis Overview
Análise de dados usando o OpenArray® Software

Interface amigável
Configurações do
Informações
dos ensaios
projeto
Tabela
de
dados

Relatórios
Relatórios em formato .csv
• Compativel com Microsoft Excel
• Pode ser facilmente importado no banco
de dados
Relatórios incluem
• Resumo dos resultados (Ct, Ct
Confidence,Tm)
• Informações sobre Curva de Amplificação e
Curva de Melting
• Informações sobre quantificação relativa
• Informações sobre Curva Padrão Absoluta

A decisão é sua….
Custom Panels
TaqMan®

PCR Digital

PCR Digital

dPCR
Resposta: a mesma quantidade que a

referência
Analógico
Quantas balas tenho

nesse pote? Digital
Resposta: 23 amarelas, 45 vermelhas,

16 verdes…

Como encontrar uma agulha num palheiro???

Dividindo esse palheiro em pequenas unidades…

Analogia entre qPCR e dPCR na Detecção de
Alelos Raros
Alelos raros podem ser difíceis ou Alelos raros são detectados mais
impossíveis de serem detectados facilmente mesmo na presença
pela presença abundante do wild- abundante do wild-type
type
Quantificação de Proteínas
Celulares usando qPCR
TaqMan® Protein Assays
EnsaiosTaqMan® Protein
Detecção de proteínas a partir de 10-500 células ou 1-1000 ng de tecido
Combinação da robustez dos anticorpos com a
sensibilidade da PCR quantitativa.
Quantificação relativa de proteínas a partir de células ou
lisado tecidual.
− Sem requerimento de purificação de proteínas!
> Apenas lisa e dilui….
• Aplicações:
Análise de proteínas a partir de pequena quantidade de amostras
Validação de knockdown (siRNA)
Validação de transfecção/tradução
Quantificação de mRNA/miRNA : correlação com a análise
quantitativa de proteínas
Caracterização de tumores
Análise de proteínas em tecido fixado
Interações proteína-proteína

Quantificação de Proteínas usando Proximity Ligation Assay
Quantidade de amostra
10-500 células
1-1000 ng proteína - tecido
5’ LIGASE
3’ F
Q M
B
B B connector
B
B B
Target
Target
Cycle number
Bind Liga Amplifica e detecta

Fast TaqMan®
se
Mesmo Protocolo Universal para todos os Assays qPCR
• Ensaio baseado em dois anticorpos, cada um conjugado a um oligonucleotídeo

diferentes (um oligo, um 5' do oligo 3') por meio da ligação streptavidina-biotina.
• Quando os dois anticorpos se ligam e estão próximos, os oligonucleotides podem ser
ligados, servindo como molde para a amplificação por PCR em tempo real e posterior
quantificação.
Fredriksson, S., Landegren, U. et al. Nature Biotechnology 20, 473 - 477 (2002)

TaqMan® Protein Assay Overview
Prep. TaqMan® Análise
Binding Ligação
Amostras Fast Real- dos dados
3’ 5’
Time PCR 100
3’
connector 10
Fold Change
B B
B B B B
B B B 1
B B B
0.10
Target Target
Cycle number 0.010
1 4 10 14 28
Day
Lise de Bind Assay Ligação dos Corrida Fast Análise dos

células e Probes (2 uL) Oligos após Real-Time PCR dados de
diluição em ao lisado de binding (100 (20 uL) quantificação
uma placa proteínas uL) relativa
Somente 2 uL
de amostra é Total Time
requerida! Hands on Time ~1.5 hrs
Time to Results ~3.5 hrs
Compatível com StepOneTM, StepOnePlusTM, 7500, 7500 Fast, 7900 HT, & ViiATM 7
Real-Time PCR Systems

Tamanho estimado dos componentes do ensaio
Tamanho do
oligonucleotídeo ~50 nm
Anticorpo ligado ao
oligonucleotídeo 1
Anticorpo ligado ao
oligonucleotiídeo 2
30 kDa
proteína
~21 nm
LIGASE
Tamanho do anticorpo, 150 kDa, ~8 nm diâmetro
Protein Tamanho do antígeno, 30 kDa, ~5 nm diâmetro
Comprimento da ssDNA ~0.5 nm / nucleotídeo

x 100 nucleotídeos = 50 nm total

Tipos de EnsaiosTaqMan® Protein
1. Pre-designed Assays (ready to add to cell/tissue lysate
− Currently we sell assays to 6 proteins
− 4 stem cell pluripotency assays (hSOX2, hOCT3/4, hNANOG, hLIN28)
− 2 common protein assays (hICAM1 & hCystatin-B)
3’
B
B B Assay
Pre-designed Assay = 2 Antibody-Oligo Assay Probe A
Probes (linked through streptavidin-biotin)
B
B B
Assay
Probe B
2. Open Kit – ‘Tool kit’ to build assay probes to your protein of interest
from Streptavidin-Oligos (prox-oligos) & customer-supplied biotinylated
antibodies
− 2 streptavidin oligos (3’ and 5’ prox-oligos) 3’
Prox-Oligo A
Publications:
• Ruff D. et al, Applications of Quantitative PCR Protein Assays During Reprogramming Stem
Cells Dev. 2011 Apr 8.
• Swartzman E. et al, Expanding applications of protein analysis using proximity ligation and
Prox-Oligo B
qPCR. Methods 2010 Apr; 50(4):S23-6.

Open Kit TaqMan® Protein Assay
Permite fazer um ensaio para o seu alvo de escolha
Componentes do Open Kit

• Oligo Probe Kit
3’
Prox-Oligo A
Prox-Oligo B
• Buffer Kit
• Lysate Dilution
• Antibody Dilution
• Assay Probe Dilution Suficiente para 5 preparações de
• Assay Probe Storage
anticorpos diferentes de Ensaio Sondas
- extra “plus” para CQ de biotina-anticorpos

Seleção do alvo
Compatível com ampla variedade de proteínas e aplicações
Peso
Localização Classe de proteínas e aplicações
Molecular*
Demonstrados para mais de 100 alvos:

• Fatores de transcrição
• Nuclear • Proteínas de Vias de transdução de sinal
De • Receptores ligados a membrana
6 to >200 kDa • Citoplasmica
• Proteínas fosforiladas
• Superfície celular
• Interações proteína-proteína
• Complexos Monomericos vs multimericos
• Proteínas tags (GFP, GST, HIS)
*No upper size limits identified

- Suggest minimum size for an
assay target is 50 amino acids
~5 kDa
Lista de alvos rastreados e anticorpos pode ser obtido no site:
www.appliedbiosystems.com/proteinassays

Exemplos de ensaios Positivos
Alvo: Humano:
ADAM9 CAII CASP3 (active) CASP3(total)
CASP8 CCL5 CD29 CD30
CD48 CD105 CD166 CDH1
CKIT CSTB CTSB CTSD
DPPA4 DECORIN EGF EGF R
HDAC8 ICAM1 IL1A IL1B
IL2 IL4 IL6 IL7
IL8 KLF-4 LIN28 MCP1
NANOG NCAM1 NGF R NOGO R
OCT3/4 OPG P53 PDGF-BB
SCF SOX2 SURVIVIN TGFB1
TNF RI TNFA TROY VEGF
Also Mouse targets: ICAM1 ADAM9 Cathepsin B Cathepsin D
• 117 Anticorpos (27 mAb & 90 pAb) – listados no site

~ 75% sucesso com pAbs purificados com afinidade imunogênica

Fazendo Ensaios Oligo-Anticorpo

Ensaios são obtidos a partir de anticorpos biotinilados
conjugados a estreptavidina ligada aos oligonucleotídeos
1. Tubo único de anticorpos policlonais
B
B B B
B
biotinilados divididos em dois.
B
B or
B B
2. 1 tubo policlonal + 1 tubo monoclonal
or
3. Par de anticorpos matched por (ELISA)
Estreptoavidina-oligo
Divididos
Estreptoavidina-oligo
3’ B pela metade B 5’
B B B B
B B B B
B B B
B
B B B
B +
+
SA SA
3’ Combina para 5’
B B
SA SA
B B
formar o assay B B
Oligo conector B SA
SA B B B
Assay probe B B Assay probe
A B
Alvo

Requerimentos dos anticorpos
3’
B
B B Assay
Anticorpo • Antigeno (afinidade) purificado B

B
B
Probe A
• Estababelece próximo ao
Policlonal comprimento do antígeno (> 100 B
B
B
aa) Assay
Probe B
B 3’
B B
B
B B Assay
Anticorpo • Pode ser usado somente quando Probe A
com um par correspondente
Monoclonal (qualificado por ELISA) B
B
B B
B B
Assay
Probe B
• Anticorpos precisam ser biotinilados para gerar os Assays probes

Anticorpo
Biotinilado • Anticorpos biotinilados não podem conter biotinas não conjugadas
(livres) (QC test: Forced Proximity Probe Test)

Se precisar Biotinilar Anticorpos.
Sugestão de Kits para biotinilação dos anticorpos (no protocolo)
− Biotin-XX Microscale Protein Labeling Kit - Molecular Probes (PN B30010)
− EZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh™Format - Pierce (PN 21327)
> Anticorpos devem estar livres de proteínas carreadoras (Ex. sem BSA, gelatina) e
aminas primárias – free buffer (Ex. sem Tris, azide ≤ 0.1%)
Kit alternativo para Biotinilação com proteína carreadora

− Molecular Probes APEX biotinylation kit (PN A10495)
Anticorpos devem ser dializados após a biotinilação (ao invés de spin por colunas) para
remover todas as biotinas livres – pois isso irá interferir com a conjugação com oligos-
estreptoavidina.
− Slide-A-Lyzer® Mini Dialysis Unit (MWCO=7000) - Thermo Scientific (PN 69562)

Preparação das amostras – Opções de Kit para Lise
das proteínas
For limiting cultured For larger starting
cells or primary cells amounts of cells

Preparação das amostras – Outras opções
Reagentes de Extração e Lise de proteínas compatíveis/Testados
• Geralmente 0.1% (ou menos) de detergentes não denaturantes, tais

como Triton ou NP-40 são incompatíveis.
• Cuidado: Reagentes que denaturam proteínas (ex. SDS e Urea) podem
inibir os PLA e até mesmo a reatividade da proteína no teste pode ser
abolida ou severamente diminuída.

Outros componentes compatíveis com o Kit

Como os dados aparecem?

Características dos dados gerados - TaqMan® Protein Assay
NPC
31.00
sensitivity
30.00 ∆CT = 8.0
29.00 (30.1 – 22.1)
28.00
Average Ct
27.00
∆ CT 26.00
25.00
24.00
‘Hook’
23.00 Linear dynamic range
22.00
21.00
0 1 10 100 1000
cells per reaction
NPC = No Protein Control

(i.e. somente buffer, sem célula lisada)

Dados gerados com TaqMan® Protein Assay
CT plots convertidos para ∆CT plots
Assay Cystatin B em lisado de células Raji
"hook"
32.00 9.00
NP
8.00
30.00 C
7.00
28.00 6.00
Avg. Ct
5.00
∆ Ct
26.00
"hook" 4.00
24.00 ∆C 3.00
22.00 t 2.00
Linear dynamic range 1.00

20.00 Linear dynamic range
0 1 10 100 1000 0.00
0 1 10 100 1000
Cell Input per reaction
Cell Input per reaction
CT vs quantidade de ∆CT vs quantidade de

células iniciais células iniciais

Comparação com métodos de detecção de proteínas
baseados em anticorpos comumente usados.
Westerns & IHC TaqMan® Protein Assay
Média a grande quantidade de amostras Pequena quantidade de amostra é
requeridas (105 cells ou 1 ug ou mais) requerida: max input 500 células (50 ng de
proteína) ou1000 ng de proteína tecidual
O sinal gerado é dependente do passo de O sinal gerado é dependente do passo de
ligação de um único anticorpo. ligação de dois anticorpos no mesmo alvo:
ganho de especificidade
Requer múltiplos passos de lavagem para Sem passos de lavagem
remover os sinais de background
Demorado: até 1-2 dias 3 ½ horas
Resultados: imagem visual, dados de Resultados: dados numéricos,

presença/ausência quantificação relativa

Software ProteinAssist™ - Quantificação Relativa
Software gratuito para download:
www.appliedbiosystems.com/taqman4antibodies
Análise com múltiplas placas (RQ) usando o o conceito de um “Estudo”
Análise de 1 até 100 placas de 96 ou 384-well em um único “Estudo”
Relatório de resultados (fold change) em formatos Gráficos ou Heat Map
Interface fácil e amigável para configuração da placa: definição de nomes
amostras, ensaios e input de quantidades de amostras iniciais.
Novo algoritmo para cálculo de RQ, usando curva de diluições seriadas
para amostras referência e teste.

Legal Acknowledgements
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
NOTICE TO PURCHASER: Limited Use Label License
The products shown in this presentation may be covered by one or more Limited Use Label License(s).
Please refer to the respective product documentation or the Applied Biosystems website under
www.appliedbiosystems.com for the comprehensive license information. By use of these products, the
purchaser accepts the terms and conditions of all applicable Limited Use Label Licenses. These products are
sold for research use only, and are not intended for human or animal diagnostic or therapeutic uses unless
otherwise specifically indicated in the applicable product documentation or the respective Limited Use Label
License(s).
The trademarks mentioned herein are the property of Life Technologies Corporation or their respective
owners.
TaqMan is a registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc.

Proximity Ligation Assay technology is covered by IP rights held by and licensed from Olink AB, Sweden
© 2010 Life Technologies Corporation. All rights reserved.

INTERVALO!!!

File Builder
e Primer Express
Custom TaqMan® Assays/Gene Expression/SNPs
- Usuário envia arquivo, Applied Biosystems envia o ensaio
- Software para gerar e validar arquivo de desenho de primers e sondas
https://www2.appliedbiosystems.com/support/software/

File Builder Software v3.1
Escolha das seqüências
Biologicamente relevante
Ambiguidades – substituir por N
Análises de bioinformática
Escolha dos “target sites”

• Avaliação da Sequência Alvo

• Avaliação da Sequência Alvo
http://www.repeatmasker.org/

Custom Probes and Primers
Usuário desenha, AB faz os primers e/ou sondas
Primers
− Liofilizados (10.000, 80.000 e 130.000pmol)
− Ressuspender a 200 µM em TE
− Alíquotas 50 µM e 5 µM em H2O
Sondas
− 100 µM: alíquotas 50 µM e 5 µM em H2O
− TaqMan® MGB Probes
− TaqMan ® TAMRA™ Probes

Primer Express Software
Primer Express software é uma ferramenta para desenho de sondas e
primers para serem utilizados com os equipamentos de Real-Time
PCR:
• StepOnePlus™ Real-Time PCR System
• StepOne™ Real-Time PCR System
• 7900HT Fast Real-Time PCR System
• 7500 Fast Real-Time PCR System
• 7500 Real-Time PCR System
• 7300 Real-Time PCR System

As sondas e os primers desenhados pelo software são utitlizados para

as seguintes aplicações:
• Quantificação Absoluta/Relativa
• Discriminação Alélica

TaqMan® Probe Primer
(recomendados amplicons de 50 a 150pb)
Conteúdo de G/C de 20 a 80%
Evitar repetição consecutiva da mesma base

Repetições de mais do que 4 bases Gs devem ser evitadas
Usando Primer Express® software, o Usando Primer Express® software, o

Tm deve ser de 68 a 700C Tm deve ser de 58 a 600C
Nenhum G na extremidade 5’
Os 5 nucleotídeos da extremidade 3’
Selecionar a fita que contenha não devem ter mais do que dois Gs e/ou Cs
mais Cs que Gs

INTERVALO!!!

Real Time PCR: Abordagem das
Aplicações Qualitativas
Ensaios de Presença/Ausência
Exemplo de Aplicações Qualitativas
Presença/ausência
End-point
+ + - +
Discriminação Alélica

Detecção de uma sequencia: esta presente ou não?

Ensaio não é quantitativo.
Usa um controle interno positivo (IPC) para identificar
falsos negativos.

Ensaio Presença / Ausência
- configuração sugerida
Alvo
FAM Quencher
IPC
VIC Quencher
IPC: Internal Positive Control – Controle positivo da PCR.

Geralmente um DNA exógeno inserido na reação juntamente com um par de
primers e sonda para amplificá-lo.

Reação realizada com TaqMan® Assays em multiplex:
Ambos, alvo e IPC são amplificados

simultaneamente em um mesmo tubo.

Setup IPC
•Unknown (patógeno) + IPC → amostra + IPC template
•Negative control + IPC → água/tampão + IPC template
•Negative control + blocked IPC → água/tampão + IPC

template + IPC blocking agent (No Amplification Control)

Componentes da reação:
− PCR cocktail (buffer, dNTPs, enzima, etc.).
− A amostra de DNA desconhecida (unknown).
− Um TaqMan® assay que irá detectar a sequencia alvo – sonda
marcada com FAM™.
− IPC – sequencia artificial não encontrada na natureza; incluído
no cocktail.
− Um TaqMan® assay que irá detectar o IPC – sonda marcada
com VIC®.

Dois controles essenciais
No-template controls (NTCs) – reação contém todos os
componentes para a PCR, exceto o template desconhecido
(unknown).
− Somente o IPC deverá amplificar.
No-amplification controls – sem a amostra desconhecida; o

agente bloqueador para o IPC é adicionado separadamente.
− Não pode haver nenhuma amplificação.

3 Etapas de leitura
Leitura “Pre-read”
Leitura “Real Time” OPCIONAL
Leitura “Post-read”

Ensaios de Presença/Ausência - setup

Ensaios de Presença/Ausência - setup

Amostras positivas
Controles negativos
Amostras negativas

Ensaios de Presença
Presença//Ausência
O usuário pode designar “auto call” para o
valor de confiança.

Interpretação dos dados

Ensaios de Presença
Presença//Ausência

Kits para patógenos
− Listeria monocytogenes
− Staphylococcus aureus
− Salmonella enterica
− Pseudomonas aeruginosa
− Escherichia coli
− Campylobacter jejuni
− Cronobacter sakazakii

-química Fast
-formato liofilizado

Saúde animal

Saúde animal
Bovinos
• Tritrichomonas foetus (T. foetus)
• Bovine Viral Diarrhea
• Bovine Herpesvirus 1 / Infectious Bovine Rhinotracheitis (IBR/BHV-1)
• Bluetongue Virus (BTV)
• Bovine Respiratory Syncytial Virus (BRSV)
• Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) Johne's Disease
Equinos
• Equine Influenza Virus (EIV)
Suínos
• Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyo)
• Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus (PRRSv)
Aves
• Avian Influenza Virus (AIV)
• Newcastle Disease Virus (NDV)

TaqMan® Exogenous Internal Positive Control
Reagents (IPC)
-Primers + sonda TaqMan para um

alvo exógeno
-Concentração primer limitante
-Reporter: VICTM
-Quencher: TAMRATM
-Monitoramento de inibição na PCR
P/N 4308323
* Alternativa: pode-se também utilizar um alvo endógeno para

monitorar eficiência de extração e inibição na PCR (ex: beta-
actina)

Real Time PCR: Abordagem das
Aplicações Qualitativas
Ensaios de Discriminação Alélica
Ensaios de Discriminação Alélica
Permite aos pesquisadores genotipar com rapidez e facilidade,

polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) previamente
identificados, em um grande número de indivíduos.

Single Nucleotide Polimorphism (SNP)
• SNPs são alterações de base única na sequência de nucleotídeos, que podem

ou não apresentar uma repercussão funcional.
...GAC ACT TTC GAA CAC GTG ATA GAA GAG CTG...
D T F E H V I E E L
...GAC ACT TTC GAA CAC ATG ATA GAA GAG CTG...
D T F E H M I E E L

Sobre SNPs
Em média, SNPs ocorrem na população humana em uma frequência

maior que 1%.
Aproximadamente 3-5% da sequência do DNA é responsável pela
codificação de proteínas; a maioria dos SNPs estão localizados nas regiões
não-codificadoras
SNPs identificados em regiões codificadoras possuem grande interesse na
pesquisa devido a possibilidade de alteração da função biológica da proteína
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/snps.html
O que são SNPs?
Variantes seqüência curta encontrados espalhados por
todo o genoma. (milhões de SNPs conhecidos em
humanos).
Podem ser do tipo….
− Mudanças de base única (SNPs – Polimorfismos de Base Única)
− Pequenas inserções
− Pequenas deleções

Como os SNPs são descobertos
descobertos…..?
…..?
Tradicionalmente, pelo seqüenciamento da mesma região de
DNA de várias pessoas e encontrar diferenças nessas seqüências.
Indiv. #1: …GTGCATTACAGGAAAACATGACCAGACATTACAGAC…

Indiv. #5: …GTGCATTACAGGAAAATATGACCAGACATTACAGAC…

Aplicações dos estudos com SNPs
• Farmacogenômica/genética
• Variação genética afetando resposta a
medicamentos
• Doenças genéticas
• SNPs como causa de doenças
• SNPs associados a doenças
• Mapas para estudos de desequilíbrio de ligação
• Agricultura e Pecuária
• Agricultura
• Pecuária: qualidade da carne/leite
• Evolução humana e genômica

Organismo diplóide: 2 cópias
TTGCGCAATAAACCTGCATGCATGCATGCTGCCCTCGCATTTTA
AACGCGTTATTTGGACGTACGTACGTACGACGGGAGCGTAAAAT
TTGCGCAATAAACCTGCATACATGCATGCTGCCCTCGCATTTTA
AACGCGTTATTTGGACGTATGTACGTACGACGGGAGCGTAAAAT
Um G/A SNP (Indivíduo heterozigoto)

Três possibilidades de genótipos para um SNP G/A
ACCTGCATGCATGCATGC
TGGACGTACGTACGTACG
ACCTGCATGCATGCATGC
ACCTGCATGCATGCATGC
TGGACGTACGTACGTACG
TGGACGTACGTACGTACG
ACCTGCATACATGCATGC
ACCTGCATACATGCATGC TGGACGTATGTACGTACG
TGGACGTATGTACGTACG
ACCTGCATACATGCATGC
TGGACGTATGTACGTACG

O que nós precisamos. . .
Um ensaio que de forma fácil e rápida nos informa o

genótipo de um SNP particular (potencialmente) em um
grande número de amostras de DNAs.
TaqMan® Allelic Discrimination Assay

Composição de um Assay
Sondas Alelo-
específicas
FAM™ MGB
Primers
comum C
G
VIC® MGB
T
A
dsDNA de células diplóides

Ensaio de Discriminação Alélica
Alelo 1
VIC Quencher Homozigoto alelo 1
= VIC
Alelo 2
FAM Quencher Homozigoto alelo 2
= FAM
Heterozigoto alelo 1 + 2
+ = VIC + FAM

Sondas TaqMan® MGB
Alta Estringência para Discriminação Alélica
R : Reporter dye (FAM and VIC)

Q : Quencher
NFQ : Non-Fluorescent Quencher
MGB : Minor Groove Binder (Tm enhancer)

Setup – Software SDS

3 Etapas de leitura
Leitura “Pre-read”
Leitura “Real Time” OPCIONAL
Leitura “Post-read”

Plots de amplificação
FAM VIC
VIC FAM
Homozigoto alelo FAM Homozigoto alelo

específico FAM™ específico VIC®.
(G/G) VIC (A/A)
Heterozigoto (G/A)

Plot da discriminação alélica
FAM (G/G)
Ambos (G/A)
NTCs
VIC (A/A)

Resultado – Homozigoto (para alguns ensaios)
Homozigoto AA

Discriminação alélica - software
Software é capaz de fazer a denominação
automatica dos genótipos em cada amostra (“auto
call”)

Relatório final dos genótipos

Concentração de DNA
Usa somente 1-20 ng de DNA genômico por reação.
Pureza e homogeidade da concentração de amostras
permitirá obter uma melhor clusterização dos
genótipos.
SEMPRE correr No Template Controls (NTCs).
− Checar contaminação.
− Permite o instrumento realizar a denominação
automatica dos genótipos de forma mais fácil.

Dicas para melhores resultados - SNPs
• Homogeneidade das amostras: todas as amostras na placa devem

estar na mesma quantidade e com mesmo grau de pureza;
• Controles: uma amostra representante de cada genótipo e controle

negativo em toda placa;
• Utilizar
o “Genotyping MasterMix”: mastermix otimizado para
aumentar a estringência das sondas, aumentando a especificidade;
• Aumentar o número de ciclos: aumentar o número de ciclos de 40

para 50 pode ajudar a melhorar a separação entre os clusters;
• Aumentar o tempo de extensão/anelamento: aumentar o tempo de 60

segundos para 1 minuto e 30 segundos.

TaqMan - SNPs Genotyping Assays
•~4.5 milhões de ensaios prontos – busca no site da Applied por nome do
gene ou código dbSNP (rs #).

TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays
• Genotipagem de 2700 polimorfismos

localizados em elementos reguladores e em
regiões codificantes de genes relacionados
ao metabolismo e transporte de drogas.
• Polimorfismos relacionados à eficiência

das drogas e seus efeitos colaterais.

TaqMan® Sample-to-SNP™ Kit

INTERVALO!!!

Quantificação de microRNAs
Biogênese dos microRNAs
1. Moléculas de RNA
processadas em RNAs
hairpins;
2. Pre-miRNA é transportado
para o citoplasma;
3. Digestão por dsRNA

ribonuclease;
4. miRNA maduro formado por meio do

complexo RISC = RNA Induced Silencing
Complex;
5. Interação do complexo RISC ao mRNA a ser

regulado.
478 Reinhart et al. Nature.

1/24/2012 | 2000
Life Technologies™ Proprietary and confidential
Biogênese dos microRNAs
• Pequenos RNAs não codificadores, fita simples e endógenos
• pri-miRNA é clivado entre os nucleotídeos 70-130 formando o pré-

microRNA
• O precursor é transformado no microRNA maduro por meio do
processamento realizado pela enzima Drosha/Dicer
5´
Drosha Dicer
U
C
pri- pre-miRNA C Mature miRNA

3´
miRNA
Funções dos microRNAs
• Desenvolvimento
• Diferenciação
• Morte Celular (Baehrecke, 2003)
• Doenças
• Câncer (Lu et al. 2005)
• Diabetes (Poy et al. 2004)
• Metilação do DNA e modificação da cromatina (Bao et al.
2004)

miRBase
Banco de dados de microRNAs: http://www.mirbase.org

miRBase
Mais de 21643 miRNAs descritos para inúmeras espécies!!! (1527 só em humanos!)
Dados obtidos em Janeiro de 2012

microRNAs: localização genômica

Ensaios TaqMan® MicroRNA
RT primer
miRNA
Quatro óligos por miRNA:
1. RT primer
2. Forward primer
Step 1: Stem-loop RT 3. Reverse primer
cDNA 4. TaqMan probe
Duas enzimas:
1. Reverse transcriptase
Step 2: Real-time PCR 2. AmpliTaq Gold® DNA
Polymerase
Forward primer
Chen et al.
Q F Reverse Nucleic Acid Res. v33: e179, 2005
TaqMan probe primer
Vendo a “Imagem Completa”
MicroRNA Biogenesis
miRNA são processados pela pol II.
− Subclasses de ncRNA.
Comumente contém múltiplos stem-
loops, embora ainda não bem
mapeados.
Dois eventos de clivagens são
requeridos para liberar a sequencia
de miRNA madura;
Sequencias maduras podem ser
mapeadas em múltiplas regiões
cromossômicas.
TaqMan® Pri- TaqMan®

miRNA MicroRNA
Assays Assays
Busca por TaqMan Assays para miRNAs
Lista de ensaios com base no miRBase

MicroRNAs: aplicações

Ensaios funcionais

Otimização de reações
e fatores que interferem nos
resultados
Otimização de um novo ensaio
1. Verificação do ensaio: testar controles positivos e negativos (NTC)
sem limitar concentração de primers e sonda (exemplo: 600nM e
250nM, respectivamente quando separados ou 1x quando misturados
em um assay).

2. Titulação de primers: 100, 300, 600nM (fixar 250nM sonda, fixar
amostra/ concentração da amostra). Objetivo: Concentração que gere
MENOR Ct, MAIOR ∆Rn e SEM presença de dímeros, mesmo em
poços NTC (caso esteja utilizando SYBR).
Forward Primer (nM)

100 300 600
Primer (nM)
100 100/100 300/100 600/100

Reverse
300 100/300 300/300 600/300
600 100/600 300/600 600/600

Efeito da concentração de primers
0,1 0,2 0,5 1,0 uM
1,1 Kb

Curva de Melting
ALVO
NTC/ALVO
600/600
300/300
100/100

3. Titulação de sonda: Utilizando a condição ótima estabelecida de
primers, variar a concentração de sondas, entre 50nM a 250nM.
Objetivo: Concentração que gere MENOR Ct e MAIOR ∆Rn (maior
sensibilidade do ensaio).

4. Avaliar eficiência do ensaio: Tomando as concentrações de óligos
determinadas no passo anterior, amplificar diluições seriadas de uma
amostra para avaliar a eficiência do experimento, indicada pela
inclinação (slope) da curva padrão. Eficiência de 100% resulta em
curva padrão com slope de -3.32.
E=10(-1/slope) -1

5. Singleplex vs Multiplex (Taqman apenas): avaliar se as amplificações dos
dois alvos possuem eficiências equivalentes em single e multiplex,
especialmente quando um deles está presente em baixo número de cópias. Se
as eficiências não são alteradas no multiplex, o Ct não deve mudar. Mudança
no Ct indica competição entre os sistemas. Deve-se então limitar a quantidade
de primer do sistema mais expresso, seguindo a matriz abaixo, sendo que o
∆Rn pode diminuir, mas o Ct deve se manter o mesmo.
Matriz de Otimização da Limitação de Primers

Fatores que interferem nos resultados
Qualidade da amostra: amostras (RNA/cDNA/DNA) de má qualidade

podem repercurtir nos seguintes problemas:
Características de má qualidade do
Efeitos na PCR
template
Sobraram RNAses e proteínas Inibição da PCR
Má retirada dos reagentes químicos

utilizados na extração Inibição da PCR
(como fenol)
Template degradado Perda da detecção de transcritos raros
Podem ser amplificados

Contaminação com DNA Genômico
conjuntamente com o RNA invalidando
(para templates de RNA)
a análise

Quantidade de amostra: amostras muito concentradas podem inibir a
reação e amostras pouco concentradas podem favorecer a formação de
dímeros de primers. Para se determinar a faixa de quantidade (Ct) com a
qual se pode trabalhar, recomenda-se fazer diluições seriadas de uma
amostra e observar os perfis de amplificação
1000
100
10
Delta Rn
n
0.1
0.01
0.001
0
10 20 30 40
Ciclos
Utilização dos mesmos estoques de padrões de cDNAs (curva

padrão) e amostra calibradora: O preparo de cDNA em momentos
diferentes pode acarretar diferenças nas quantidades e na qualidade do
cDNA, gerando grande variabilidade nos resultados. Assim, no preparo
destas amostras, deve-se preparar um grande volume já prevendo seu
uso durante todos os experimentos. Esses grande volume deve ser
aliquotado em volumes menores de forma a evitar descongelamentos
sucessivos e, consequentemente, degradação dos cDNAs.
Uso de Mastermix: o uso de Mastermix de PCR diminui o número de

pipetagens e erros relacionados no preparo da reação.

Homogeneização dos reagentes: evita que as quantidades variem entre

os poços.
Uso de ensaios com alta eficiência: quanto mais alta a eficiência dos
ensaios, mais precisos ficam os resultados.
Análise correta de Baseline e Threshold: cruciais para a precisão dos

resultados.

Pipetagem: erros de pipetagem aumentam o desvio padrão e afetam
consideravelmente as curvas padrão. Pipetas bem calibradas, volumes
maiores e spin nas placas ou tubos antes de iniciar a corrida são fatores
cruciais para a qualidade dos resultados.
R2 ideal
501 ≥0.99
Problema Observado Fator de Pipetagem
Alto desvio padrão ou R2 <0.99

Erros na pipetagem das replicatas
(no caso da curva padrão)
Erros na diluição dos padrões para a

R2 ≥0.99, mas slope alterado
curva

Eficiência do ensaio: valores de slope e Y-intercept
Fonte: Real-time PCR; Dorak MT.

Diferença de performance do Master Mix
Alvo: colágeno NTC amostra
NTC
amostra
Master Mix 1
amostra
amostra
Master Mix 2
NTC
NTC

Diferença de performance - Master Mix
Alvo: beta-actina amostra
amostra
Master Mix 1
NTC
NTC
amostra
amostra
Master Mix 2
NTC
NTC

AmpliTaq® Gold DNA Polimerase
Hot-start automático
Enzima quimicamente modificada

Ativação: 95 °C – 5 min (protocolo geral)

Efeito de hot-start
Taq HS Taq HS Taq HS
1100 bp
300 bp
264 bp
Maior especificidade
Maior rendimento

Assay Volume
Errol Thomson &

Renaud Vincent
Analytical
Biochemistry
(2005) 347–350

Troubleshooting

Troubleshooting
Múltiplos picos na curva de melting: dímeros de primers ou bandas
inespecíficas. Como solucionar: Otimização da reação (quantidade de
reagentes/programa de termociclagem), uso de enzimas hot-start, re-
desenho dos primers.

Troubleshooting
Amplificação no Controle Negativo: Contaminação no poço de reação
ou nos reagentes. Como solucionar: novo preparo de reação. Caso
desconfie dos reagentes, trocar todas as alíquotas (inclusive da água)

Troubleshooting
Curva de amplificação caída: Baixa eficiência do ensaio, causada por

problemas na amostra ou nos reagentes. Como solucionar: rever
protocolo de extração e grau de pureza da amostra, além da quantidade
que está sendo utilizada (não deve estar nem muito concentrada, nem
muito diluída). Atente-se para reagentes que possam estar em
quantidades limitantes (como primers).

Troubleshooting
Soluções para curvas deslocadas a direita: curvas muito deslocadas
para a direita podem representar genes pouco expressos ou amostras
com índice de contaminação baixo.
O ideal é que o Ct esteja entre 15 e 35
Kit Poly(A) PuristTM

Isola apenas o mRNA do RNA Total
A retirada dos RNAs ribossomais aumenta a
representatividade do gene pouco expresso
na massa de RNA a ser utilizada

Troubleshooting
Soluções para curvas deslocadas a direita: curvas muito deslocadas
para a direita podem representar genes pouco expressos ou amostras
com índice de contaminação baixo.
O ideal é que o Ct esteja entre 15 e 35
Kit GlobinClearTM
Para quem extrai RNA de Sangue
70% do mRNA do sangue corresponde ao
gene da Globina.
O Kit GlobinClear utiliza beads magnéticos
para retirada de mRNA de globina
aumentando a representatividade de outros
mRNAs na massa utilizada na reação

0800-772 5433 ou
11 - 5070 9662 (Grande SP)
Horário de atendimento: segunda à sexta (08h – 18h)
suporte.br@lifetech.com
vendas.br@lifetech.com

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Introdução à PCR Quantitativa

1976 - Thomas D. Brock

DNA polimerase termoestável de Thermus aquaticus

Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and

1987 - Mullis KB, Faloona FA

Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed

2 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

− Reação enzimática de polimerização de DNA in vitro

− Reação cíclica, produtos de um ciclo são substrato para o ciclo

− Amplificação de sequências específicas de DNA, permitindo sua

3 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

4 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

5 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

Hibridação dos Primers (50-60oC)

6 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

8 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

Baixa resolução (≥ 1 log)

Colorações não quantitativas

Discriminação baseada apenas no tamanho do amplicon

Pobre discriminação entre o tamanho dos amplicons

Necessidade de pós-processamento do produto da PCR

Resultados não são expressos em números

9 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

1993 – Higuchi et al. – Biotechnology 11: 1026-30

10 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

11 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

método baseado em PCR

monitoramento contínuo do sinal fluorescente ao longo

conversão do sinal fluorescente em valor numérico para

12 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

PCR em Tempo Real (1 ou 2-step)

13 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

14 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

15 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

17 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

Log Target DNA Theoretical

19 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

20 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

22 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

P = T (1+E)n P = Produto final

Método usado para medir a quantidade de DNA/cDNA inicial

23 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

Eficiência de 100% Eficiência de 85%

24 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

● Qualidade do template (integridade do DNA/cDNA)

● Presença de inibidores (qualidade de extração)

● Desenho dos primers (Tm, estruturas secundárias)

● Condições de termociclagem (T de anelamento, rampa)

● Qualidade dos reagentes

● Concentração dos reagentes

25 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

26 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

27 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

28 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

0.1 A posição de cada curva

30 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

31 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

32 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

Sem ROX Com ROX

33 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

34 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential

∆Rn: Normalização do reporter menos o sinal de background

35 1/24/2012 | Life Technologies™ Proprietary and confidential